龐家舉

（國有新賓滿族自治縣趙家林場，遼寧 新賓 113200）

油松Pinus tabulaeformis隸屬松科松屬，是我國的特有樹種，又叫中國松，廣泛分布于我國東北、華北以及西北地區(qū)。油松是我國重要的造林及用材樹種，并且對惡劣環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，耐干旱瘠薄，具有重要的生態(tài)價(jià)值。油松主要采用種子繁殖方式進(jìn)行造林，這導(dǎo)致繁殖周期長，苗木分化程度大，林相不整齊，影響了造林質(zhì)量，因此可以采用無性繁殖方式進(jìn)行油松造林[1]。然而油松無性繁殖困難，對于選育的優(yōu)良無性系難以規(guī)?；敝?，所以不能使用傳統(tǒng)的無性繁殖方式。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)是一種新興的無性繁殖方式，指植物組織器官經(jīng)過體外培養(yǎng)形成具有雙極性胚性結(jié)構(gòu)的過程，具有繁殖速度快、數(shù)量多、優(yōu)良性狀穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)。已有研究表明，針葉樹種的體胚發(fā)生一般經(jīng)歷4 個(gè)階段，首先是胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，其次是胚性愈傷組織的保持與增殖，再次是體細(xì)胞胚的成熟，最后是體胚萌發(fā)及植株的再生[2]。本文概述了油松體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)的研究進(jìn)展，為后續(xù)的研究提供便利，使體胚發(fā)生技術(shù)成為油松大規(guī)模克隆繁殖的手段。

1 油松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

胚性愈傷組織的誘導(dǎo)是體胚發(fā)生的初始步驟，也是整個(gè)過程的限速步驟，能否誘導(dǎo)成功取決于外植體的種類、消毒方式、培養(yǎng)基的類型以及植物生長調(diào)節(jié)劑種類等。

1.1 外植體種類及消毒

目前，在油松體胚發(fā)生過程中應(yīng)用最多的外植體包括油松成熟合子胚以及未成熟合子胚。當(dāng)以成熟合子胚為外植體時(shí)，誘導(dǎo)出的大多數(shù)是不定芽或非胚性愈傷組織[3-5]，難以獲得胚性愈傷組織。而以未成熟合子胚為外植體時(shí)，可以誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，且誘導(dǎo)率較高。馬麗源等[6]發(fā)現(xiàn)在7 月10 日左右采集的油松未成熟合子胚中，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，可達(dá)88.3%。因此相對于成熟合子胚來說，最好選用未成熟合子胚作為油松體胚發(fā)生的外植體。

確定好外植體后要對其進(jìn)行消毒，在油松種子采集后先用流水沖洗2 h，然后在超凈工作臺上用75% 酒精浸泡30～60 s，取出后用無菌水沖洗3～5次，之后放入0.1% 的HgCl2溶液中浸泡5～10 min，再用無菌水沖洗3～5 次，置于滅菌的濾紙上備用。

1.2 培養(yǎng)基類型

外植體經(jīng)過消毒后需要接種到培養(yǎng)基中，研究發(fā)現(xiàn)外植體的類型不同，需要的培養(yǎng)基類型也不同。馬佩[7]發(fā)現(xiàn)以油松成熟胚的子葉-胚軸段為外植體時(shí)，1/2MS 培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最好；以下胚軸段為外植體時(shí)，SH 培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最好[8]。而以未成熟合子胚為外植體時(shí)，mLV 培養(yǎng)基[9]效果最好，且能夠誘導(dǎo)出胚性愈傷組織[10]。

1.3 植物生長調(diào)節(jié)劑種類

植物生長調(diào)節(jié)劑在體胚發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用，主要包括生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、乙烯和脫落酸，其中在愈傷組織誘導(dǎo)階段主要用到的是生長素和細(xì)胞分裂素，常用的生長素包括IAA、IBA、NAA、2，4-D 等；細(xì)胞分裂素包括6-BA、ZT、KT 等。將不同質(zhì)量濃度的生長素和細(xì)胞分裂素組合使用對油松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)具有較好的效果。此外，在培養(yǎng)基中添加一些營養(yǎng)物質(zhì)如谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖等也對油松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)起著促進(jìn)作用。李亦軒[10]以未成熟合子胚為外植體，mLV 為基本培養(yǎng)基并添加2 mg·L-12，4-D、1 mg·L-16-BA、0.5 mg·L-1水解酪蛋白、0.5 mg·L-1谷氨酰胺、30 g·L-1蔗糖以及2.5～3 g·L-1植物凝膠，接種后將培養(yǎng)皿放在培養(yǎng)室中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)室相對濕度60%～70%，溫度（25±3）℃，培養(yǎng)1 個(gè)月后油松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)60%。

2 油松胚性愈傷組織的增殖

油松體胚發(fā)生體系的進(jìn)一步成熟和萌發(fā)再生需要大量的胚性愈傷組織作為基礎(chǔ)材料，因此對誘導(dǎo)出的油松胚性愈傷組織進(jìn)行增殖十分關(guān)鍵。目前，常用的兩種增殖方式為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)以及液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，二者都伴隨有褐化現(xiàn)象。褐化的出現(xiàn)將影響其它健康組織的生長，甚至導(dǎo)致其死亡，危害性較大。為了控制油松胚性愈傷組織增殖過程中的褐化，付雙彬[11]等對培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化并發(fā)現(xiàn)，以mLV 為基本培養(yǎng)基添加2.5 g·L-1植物凝膠、10 g·L-1蔗糖，pH 控制在5.9，且在90 mm 培養(yǎng)皿中放置7 塊愈傷組織時(shí)，褐化率最低，增殖率和利用率最高。

利用錐形瓶進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，相對于固體培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)速度較快，但仍然難以滿足生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)的大量需求，并且也遭受褐化影響，而使用氣動(dòng)生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)可以避免這些問題。氣動(dòng)生物反應(yīng)器是一種新型培養(yǎng)方式，主要原理是空氣進(jìn)入生物反應(yīng)器，在液體培養(yǎng)物中產(chǎn)生小氣泡，這些氣泡既攪動(dòng)胚胎細(xì)胞團(tuán)防止材料堆積，又向培養(yǎng)物提供空氣[12]。李亦軒等[13]利用氣動(dòng)生物反應(yīng)器對油松胚性愈傷組織進(jìn)行增殖，發(fā)現(xiàn)每100 mL 液體培養(yǎng)基內(nèi)接種10 g 油松胚性愈傷組織，添加0.2 mg·L-12，4-D，并保留20%的原培養(yǎng)基時(shí)增殖率最高，可達(dá)216.18%，且愈傷組織穩(wěn)定優(yōu)質(zhì)。

3 油松體細(xì)胞胚的成熟

體細(xì)胞胚的成熟是植物體胚發(fā)生體系中至關(guān)重要的一步，是限制體胚技術(shù)商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的重要因素，畸形胚和發(fā)育不完全胚將會影響后期體胚的萌發(fā)與植株再生[14]。影響油松體細(xì)胞胚成熟的因素主要包括ABA 濃度、愈傷組織生長情況、培養(yǎng)基滲透壓和細(xì)胞系的基因型等。眾多樹種的體胚發(fā)生研究中均發(fā)現(xiàn)ABA 在體細(xì)胞成熟階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是在針葉樹種中[14～15]。此外，在體胚成熟階段經(jīng)常通過添加PEG 來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓，有研究表明經(jīng)PEG 處理的愈傷組織細(xì)胞活力和有絲分裂能力均較高，有利于后續(xù)成熟培養(yǎng)[16]。李亦軒等[17]根據(jù)這些因素對油松體細(xì)胞胚成熟過程進(jìn)行了優(yōu)化，并發(fā)現(xiàn)在mLV 基本培養(yǎng)基中添加16 mg·L-1ABA、75 g·L-1PEG、5 g·L-1植物凝膠、（10+30）g·L-1麥芽糖和蔗糖時(shí)，油松體細(xì)胞胚的成熟效率最高，與對照相比提高了0.8 倍。

4 油松的遺傳轉(zhuǎn)化

油松作為一種針葉樹種，傳統(tǒng)育種周期長，難以滿足樹木遺傳改良的需求，因此需要通過基因工程引入分子育種途徑。建立油松遺傳轉(zhuǎn)化體系是實(shí)現(xiàn)這一途徑的基礎(chǔ)，而高效穩(wěn)定的體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系是油松遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建的重要前提。胚性愈傷組織是遺傳轉(zhuǎn)化體系最佳的受體材料，因?yàn)槠湓偕芰?qiáng)大，容易調(diào)控分化表達(dá)全能性，已被廣泛應(yīng)用于其它針葉樹種的遺傳轉(zhuǎn)化研究[18]。目前，油松的體胚發(fā)生體系逐漸優(yōu)化，可以較高效地獲得油松胚性愈傷組織，這也為油松的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。由于針葉樹的遺傳轉(zhuǎn)化難度大，仍處于初步探索階段。李亦軒[10]采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，以油松固體愈傷組織和液體懸浮組織為材料，研究發(fā)現(xiàn)卡那霉素Kan=50～75 mg·L-1時(shí)有利于轉(zhuǎn)化，當(dāng)OD 值在0.4～0.6，侵染時(shí)間為5～15 min，共培養(yǎng)時(shí)間為48 h，農(nóng)桿菌與胚性愈傷組織狀態(tài)良好，并能得到GUS 陽性的愈傷組織。盡管只有一種處理的轉(zhuǎn)化效率相對較高，但是其愈傷組織可以被GUS 染液染成藍(lán)色，說明結(jié)果可信，這對后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)積極的影響，奠定了良好的遺傳轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)。

5 展 望

目前，油松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖以及成熟3 個(gè)階段已經(jīng)被廣泛研究并取得了較大的進(jìn)步，可以獲得大量的優(yōu)質(zhì)胚性愈傷組織，并篩選出了油松體細(xì)胞胚成熟的最佳條件。然而，體細(xì)胞胚的進(jìn)一步萌發(fā)以及植株再生還沒有實(shí)現(xiàn)，這制約著油松體胚發(fā)生技術(shù)的應(yīng)用。此外，對油松胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的研究也停留在初步階段。因此，在今后的研究中應(yīng)該把重點(diǎn)放在體胚萌發(fā)及植株再生，并繼續(xù)對油松遺傳轉(zhuǎn)化各階段條件進(jìn)行篩選，逐步完善油松體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系。