白 天，崔新儀，李 寧，程偉霞，張 斌，劉敬波

（天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300380）

芹菜（Apium graveolensL.）屬于傘形科，又稱藥芹或旱芹，是中國(guó)消費(fèi)量巨大的蔬菜之一，在世界各地廣泛栽培，資源豐富［1-3］。目前中國(guó)芹菜生產(chǎn)中常用的種類有本芹、西芹及西芹與本芹雜交改良型品種［4］。芹菜也可作為藥用植物，其代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，初級(jí)代謝物和次級(jí)代謝物類型多樣，且具有廣泛的生物活性和藥理功效?，F(xiàn)代研究表明，芹菜富含酚類物質(zhì)，主要是類黃酮和酚酸，酚類物質(zhì)藥理活性主要體現(xiàn)在抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、降血脂、降血壓等方面，芹菜葉酚類物質(zhì)含量豐富，抗氧化能力顯著高于基部莖與頂端莖［5-7］。

基于高效液相色譜（HPLC）的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)芹菜的化學(xué)成分及其質(zhì)量進(jìn)行定性和定量鑒別，能夠?qū)Χ喾N不同類別代謝物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)分析，不僅能夠深入理解植物代謝網(wǎng)絡(luò)與代謝調(diào)控，還能揭示植物表型與植物生長(zhǎng)、發(fā)育及生物多樣性之間的關(guān)系［8-10］。任園宇等［11］建立同時(shí)測(cè)定6 種酚酸化合物的高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)方法，并用于高溫脅迫前后不同品種玉米幼苗酚酸類化合物含量的檢測(cè)，表明酚酸化合物含量變化可能與高溫脅迫的敏感性有關(guān)。He 等［12］利用高效液相色譜同時(shí)測(cè)定了桑葉中綠原酸和蘆丁等化合物的含量，建立了桑葉抗氧化能力的可靠指紋圖譜，并用于桑葉質(zhì)量鑒定。Wei 等［13］基于代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)甘草151 種生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，首次揭示了植物次生代謝途徑中的單親遺傳，對(duì)甘草和其他藥用植物的生物合成、遺傳和質(zhì)量控制研究提供參考。Zhang等［14］利用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行大規(guī)模非目標(biāo)代謝組學(xué)分析，對(duì)不同誘導(dǎo)氮水平下的2 個(gè)小麥品種生長(zhǎng)期進(jìn)行代謝組學(xué)分析，證實(shí)了低氮脅迫可增加小麥次級(jí)代謝產(chǎn)物含量，揭示了次生代謝物積累是對(duì)非生物因素的脅迫反應(yīng)。以植物代謝物為基礎(chǔ)的組學(xué)研究有利于建立基因和代謝產(chǎn)物之間的完整網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從代謝角度進(jìn)一步全面闡明植物代謝規(guī)律及其關(guān)鍵途徑［15-18］。

本研究基于HPLC 建立11 種酚類化合物的分析方法，進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)考察。應(yīng)用該方法獲取10 種芹菜品種的酚類代謝物特征，結(jié)合聚類分析法對(duì)芹菜進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。為芹菜品種的優(yōu)選和質(zhì)量的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化提供基礎(chǔ)資料，并為芹菜內(nèi)在質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)和全面控制提供新的參考方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 LC-20A 型高效液相色譜儀（PDA 檢測(cè)器），島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；HP 超聲波清洗器，保定圣峰儀器科技有限公司；CAV264C 型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品 芹菜素（純度≥98%）、阿魏酸（純度≥99.5%）、木犀草素（純度≥98%）、山奈酚（純度≥98%）、槲皮素（純度≥98.5%）均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芹菜苷（純度≥98.9%）、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（純度≥98.7%）均購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；兒茶素（純度≥98%）購(gòu)于天津百奧泰科技發(fā)展有限公司；綠原酸（純度≥98%）購(gòu)于天津晟佰昊生物技術(shù)有限公司；咖啡酸（純度≥99%）購(gòu)于天津索羅門(mén)生物科技有限公司；蘆丁（純度≥90.5%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；去離子水；乙酸（色譜純）、甲醇（色譜純）均購(gòu)于天津市康科德科技有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）購(gòu)于天津百奧泰科技發(fā)展有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

分別用色譜級(jí)甲醇將芹菜素、阿魏酸、木犀草素、山奈酚、槲皮素、芹菜苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、蘆丁11 種酚類標(biāo)準(zhǔn)品溶解，定容得到0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用甲醇將上述儲(chǔ)備液稀釋成試驗(yàn)所需的不同質(zhì)量濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃冰箱避光保存。

1.3 樣品前處理

精準(zhǔn)稱取新鮮芹菜葉片0.5 g，置于50 mL 離心管內(nèi)，用乙醇水（體積比為70∶30）溶液10 mL 均質(zhì)，在60 ℃下超聲波提取1 h，10 000 r/min 離心5 min，取上清液稀釋10 倍，0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾后，樣品進(jìn)行色譜分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：Venusil XBP Cl8（L）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.2%乙酸溶液（pH 3.0）；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫程序：（0～10 min，20%～50% B；10～25 min，50%～50% B；25～35 min，50%～90% B；35～45 min，90%～20% B）；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

采用PDA 檢測(cè)器在波長(zhǎng)190～800 nm 范圍內(nèi)對(duì)11 種酚類化合物進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)多數(shù)化合物的最大吸收波長(zhǎng)為240～290 nm，而波長(zhǎng)240 nm 下各化合物均有較強(qiáng)的紫外吸收峰，認(rèn)為該波長(zhǎng)可以兼顧各組分的檢測(cè)，因此選擇240 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 選擇合適的色譜柱是分析方法的關(guān)鍵。C18 色譜柱是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用的色譜柱，因此本研究?jī)?yōu)先選擇C18 色譜柱。但是即使同樣是C18 色譜填料，因?yàn)殒I合技術(shù)、硅羥基封尾基團(tuán)的不同，色譜柱的選擇性也有很大的差別。在色譜條件相同的情況下，比較了Venusil XBP Cl8（L）（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）3 種色譜柱對(duì)11 種酚類化合物的分離效果。結(jié)果表明，在相同的梯度洗脫下，Agilent TCC18 柱對(duì)槲皮素、木犀草素、山奈酚和芹菜素出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾，保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，分離效果不佳；Agilent Eclipse XDB-C18 柱對(duì)蘆丁、芹菜苷、山奈酚、芹菜素分離度不夠，并且槲皮素在該柱上保留過(guò)強(qiáng)；Venusil XBP Cl8（L）柱對(duì)11 種酚類化合物能很好地分離，響應(yīng)值高。因此本研究選用Venusil XBP Cl8（L）色譜柱作為分離色譜柱。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇 按照“1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，對(duì)甲醇-水、甲醇-0.2%乙酸、乙腈-0.2%乙酸3 種流動(dòng)相體系進(jìn)行考察，在甲醇-水流動(dòng)相條件下，兒茶素與雜質(zhì)無(wú)法分離；乙腈-0.2%乙酸流動(dòng)相條件下，11 種酚類化合物分離效果不佳。因此選擇甲醇-0.2%乙酸溶液作為本研究的流動(dòng)相。

2.2.3 梯度洗脫條件的優(yōu)化 按照“1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，考查了4 種梯度洗脫條件對(duì)11 種酚類化合物的分離效果，在李幼林等［19］的研究基礎(chǔ)上，基于樣品中的雜質(zhì)干擾因素，將梯度洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，并將流動(dòng)相B 濃度從40%降低至20%，另外，通過(guò)降低10～25 min 內(nèi)流動(dòng)相B 的濃度來(lái)達(dá)到對(duì)阿魏酸、蘆丁、芹菜苷和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的分離（表1）。結(jié)果表明，方法4 對(duì)11 種酚類化合物均獲得較好的分離和檢測(cè)效果，響應(yīng)值高。因此，試驗(yàn)選用方法4 進(jìn)行梯度洗脫。

表1 色譜分離流動(dòng)相梯度

由圖1 可知，11 種酚類化合物與其他雜質(zhì)分離，各化合物的峰形良好，分離度高，因此本方法適合芹菜中11 種酚類化合物的測(cè)定。

圖1 11 種酚類化合物的高效液相色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各分析物的峰面積（y）和相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。結(jié)果表明，各目標(biāo)物在0.5～10.0 μg/mL范圍內(nèi)11 種酚類化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均≥0.990（表2）。以信噪比（S/N）為3 時(shí)對(duì)應(yīng)的對(duì)照品濃度作為檢出限（LOD），S/N 為10 時(shí)對(duì)應(yīng)的對(duì)照品濃度作為定量限（LOQ）。結(jié)果表明，11 種酚類化合物的檢出限為0.07～0.29 mg/kg，定量限為0.20～0.84 mg/kg。

表2 11 種酚類化合物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4 回收率和精密度

在測(cè)定樣品前，先測(cè)定樣品的本底值，添加標(biāo)樣樣品的測(cè)定值扣除本底值的結(jié)果用于計(jì)算回收率。在0.5 g 芹菜葉樣品中分別按0.2、0.4、1.0 mg/kg 3 個(gè)濃度添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平平行測(cè)定3 次。由表3 可知，11 種酚類化合物的平均加標(biāo)回收率為71.90%～134.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.30%～4.00%（n=3）。說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可用于芹菜酚類活性成分的檢測(cè)。

表3 11 種酚類化合物的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性

取相同質(zhì)量濃度的11 種酚類標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，室溫條件下分別于第0、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量20 μL，在“1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，計(jì)算各成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，11種酚類化合物精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.00%，各成分穩(wěn)定性良好。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用上述方法對(duì)市場(chǎng)售賣的10 種芹菜樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4 所示。在四季香芹中芹菜苷和芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量較高，分別為44.525、57.879 mg/kg；在津星西芹中綠原酸含量最高，為107.119 mg/kg；在天雙西芹、四季香芹中阿魏酸含量差異明顯。

表4 不同芹菜葉樣品中11 種酚類化合物的含量（單位：mg/kg）

2.7 數(shù)據(jù)分析

聚類分析是將樣品按照品質(zhì)特性相似度逐漸聚合在一起，最終按照類別的綜合性質(zhì)將多個(gè)品種聚合，從而完成聚類分析的過(guò)程［20］。采用SPSS 23.0 軟件，使用組間連接法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖2所示。基于次生代謝物含量的不同將芹菜樣品分為3 類，第1 類為津青實(shí)芹一號(hào)、天津?qū)嵭那?、金于夏芹和天雙西芹，第2 類為津抗法拉利、津耘芹二號(hào)、津星西芹、玉香1 號(hào)和白翠香實(shí)芹，第3 類為四季香芹。結(jié)果表明，10 種芹菜都含有重要影響的代謝產(chǎn)物，酚類組分存在相似性，但存在品種間的差異。通過(guò)HPLC 結(jié)合聚類分析可為芹菜質(zhì)量評(píng)價(jià)及鑒定提供依據(jù)，能夠提供更多的代謝物信息，對(duì)芹菜中酚類物質(zhì)的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支撐，為研究芹菜次生代謝產(chǎn)物積累規(guī)律提供有效手段。

圖2 基于HPLC 的芹菜樣品的聚類分析

3 小結(jié)

本研究成功建立了一種同時(shí)測(cè)定芹菜中11 種酚類化合物含量的方法，該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性好，為闡述芹菜的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了新的思路。結(jié)合聚類分析較全面地反映了芹菜酚類活性成分的化學(xué)信息，可用于評(píng)估芹菜指標(biāo)成分含量與品種之間的相關(guān)性，為營(yíng)養(yǎng)功能成分作用機(jī)制研究提供新方法。