沈明娟，李云嵌，楊 曦，王永琴，沙小梅，張雪春,3,*

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022；3.西南林業(yè)大學(xué) 云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

泡核桃（Juglans sigillata）別名胡桃、羌果，為胡桃科胡桃屬木本植物，是我國最重要的經(jīng)濟(jì)類堅(jiān)果之一，其可食部位為核桃仁，富含蛋白、氨基酸及不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分，其中蛋白占比可達(dá)22.18%[1-2]。核桃蛋白是一種較為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，但同時(shí)也是世界上主要的食物過敏原之一。調(diào)查顯示，堅(jiān)果等“八大過敏原”導(dǎo)致了90%的食品過敏現(xiàn)象，其中核桃產(chǎn)生的過敏反應(yīng)約占所有堅(jiān)果過敏的34%，約15%的兒童過敏體質(zhì)者對(duì)核桃過敏[3]。核桃過敏可作用于人體呼吸道、胃腸道等部位，導(dǎo)致惡心、唇腫、呼吸困難等臨床癥狀，嚴(yán)重影響人們尤其是兒童的身體健康[4-5]。因此，明確核桃中的過敏原蛋白，深入研究其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，對(duì)人類膳食健康有重要意義。

截至目前，世界過敏原數(shù)據(jù)庫（http://www.allergenonline.org）共收錄了6 種核桃過敏原的信息，分別為Jug r 1、Jug n 1（2S蛋白），Jug r 2、Jug n 2（7S蛋白），Jug r 3（脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白）和Jug r 4（11S球蛋白）[6]。其中Jug r 1是一種分子質(zhì)量約16.4 kDa的2S蛋白種子貯藏蛋白，由139 個(gè)氨基酸組成，研究發(fā)現(xiàn)在32 例核桃過敏患者中，約96.9%的患者對(duì)抗原Jug r 1過敏，說明Jug r 1是引發(fā)核桃過敏反應(yīng)的主要原因[7]。Sordet等[8]利用大腸桿菌表達(dá)重組Jug r 1，同樣證實(shí)了Jug r 1是核桃中的主要過敏原蛋白。但目前國內(nèi)外關(guān)于Jug r 1的相關(guān)研究較少，主要集中在其致敏原線性表位[9-10]及基因表達(dá)[8,11]等方面，且使用的幾乎都是Jug r 1含量較低的粗蛋白，與Jug r 1相關(guān)的過敏研究如人體血清學(xué)分析、免疫學(xué)分析和生物信息學(xué)分析等仍較為匱乏[6,12]。因此，迫切需要采用各種分離純化手段制備高純度的Jug r 1以開展進(jìn)一步研究。

蛋白純化的主要方法有尺寸排阻色譜、鹽析沉淀法、離子交換層析、疏水層析、親和層析等[13-14]，其中尺寸排阻色譜一般又被稱作凝膠過濾層析或分子篩層析，因具有分離效果好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用[13]。目前已有對(duì)花生[15]、巴西堅(jiān)果[16]、榛子[17]以及其他植物蛋白中過敏原蛋白[13,18]進(jìn)行分離純化的相關(guān)報(bào)道，但對(duì)核桃致敏蛋白Jug r 1分離純化及鑒定的研究鮮有報(bào)道。

云南是我國核桃主產(chǎn)區(qū)，其種植面積和產(chǎn)量均居全國第一，且由于其獨(dú)特的氣候和地理環(huán)境，云南核桃的品質(zhì)和品種隨地域分布呈現(xiàn)豐富的多樣性，但目前鮮見對(duì)云南不同產(chǎn)地核桃的致敏性及其Jug r 1含量的相關(guān)研究。因此，以云南不同產(chǎn)地的泡核桃為研究對(duì)象，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等方法，從中篩選出Jug r 1含量最高的品種，進(jìn)一步采用硫酸銨分級(jí)沉淀、凝膠過濾層析、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等手段對(duì)Jug r 1進(jìn)行提取、分離純化和鑒定，并利用圓二色譜和紫外光譜法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，旨在為深入研究Jug r 1提供科學(xué)基礎(chǔ)，以期為核桃致敏的診斷、治療和機(jī)理研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

7 個(gè)核桃品種（產(chǎn)地）：臨滄大泡（云南臨滄市），大姚三臺(tái)（云南楚雄自治州大姚縣三臺(tái)鄉(xiāng)），昌寧細(xì)香（云南保山市昌寧縣），大理娘青、大理漾濞、大理龍佳（云南大理自治州），保山隆陽（云南保山市隆陽區(qū)）。選擇品質(zhì)較佳、大小均一、新鮮干燥的核桃，手工破碎后取核桃仁，置于4 ℃冰箱用于下一步實(shí)驗(yàn)。

硫酸銨（純度≥99%）廣東光華科技股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker 北京索萊寶科技有限公司；植物Jug r 1蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；1.0 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.8）、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）上海源葉生物科技有限公司；Superdex 200 pg 美國GE公司；鹽酸、冰乙酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5427R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；mini Protean3Cell垂直電泳槽、Powerpac Universal電泳儀美國伯樂公司；Gel-Pro Imager Kit電泳凝膠成像系統(tǒng)美國Media Cybernetics公司；15 mm×75 cm中壓特制玻璃層析柱 北京索萊寶科技有限公司；MD SpectraMax Plus 384酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；BRIGHTTIME Chirascan-1500圓二色譜儀 日本分光JASCO公司；UV-2600紫外-可見分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；Easy nLC 1200色譜系統(tǒng)、Q-Exactive HF-X質(zhì)譜儀美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂核桃粉的制備

參考文獻(xiàn)[19]并稍作修改。將不同產(chǎn)地的核桃仁用0.125 mol/L的NaOH溶液在室溫下浸泡30 min，清水漂洗3～4 次，手工剝?nèi)ズ颂移ぃ?0～60 ℃烘干后，按照核桃與石油醚料液比1∶6（g/mL）進(jìn)行攪拌粉碎和脫脂3 h，旋蒸回收石油醚，重復(fù)上述操作步驟，直至濾液無色透明。收集脫脂后的核桃仁碎粒，最后過80 目篩得到脫脂核桃粉末。

1.3.2 核桃粗蛋白的制備

參考黃子林[20]方法稍作修改。將脫脂核桃粉與蒸餾水按料液比1∶10（g/mL）混合，用0.1 mol/L的NaOH溶液將pH值調(diào)為8.5，室溫?cái)嚢杼崛? h后，于4 ℃、5000 r/min離心30 min，取上清液用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至5.0，同樣于4 ℃、5000 r/min離心30 min后取沉淀物，為消除酸性環(huán)境對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，向沉淀物加入適量的蒸餾水和NaOH溶液調(diào)至中性，冷凍干燥后即為核桃粗蛋白，收集備用。

1.3.3 雙抗夾心ELISA法測定Jug r 1含量

參照植物Jug r 1蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書進(jìn)行，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的核桃粗蛋白溶液，按照核桃粗蛋白溶液和樣品稀釋液體積比1∶4進(jìn)行混合稀釋。分別設(shè)置空白孔（不加樣品和酶標(biāo)試劑）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，以空白孔調(diào)零，在450 nm波長處測定光密度（OD值），在相同條件下測定試劑盒自帶質(zhì)量濃度為2.5、5、10、20、40 ng/L標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程Y=0.0449X-0.0119（R2=0.9974），依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Jug r 1含量。

1.3.4 硫酸銨分級(jí)沉淀法提取Jug r 1

在4 ℃環(huán)境下，將脫脂核桃粉與25 mmol/L Tris-HCl中鹽緩沖液（pH 7.5，含0.5 mol/L NaCl）按料液比1∶10（g/mL）混合攪拌12 h，然后10000 r/min離心20 min，取上清液并調(diào)節(jié)pH值至7.5[6]。在4 ℃環(huán)境下預(yù)冷后，于30 min內(nèi)邊攪拌邊緩慢加入一定質(zhì)量的硫酸銨，完全溶解后靜置2 h，在12000 r/min離心30 min，收集沉淀與上清液。按相同的操作使離心后上清液的硫酸銨飽和度依次為0%～20%、20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%，每個(gè)梯度得到的沉淀透析48 h，凍干備用[21]。

1.3.5 凝膠過濾層析法分離純化Jug r 1

填料預(yù)處理：將20%乙醇溶液已溶脹的Superdex 200 pg填料用適量超純水反復(fù)清洗至無味。

裝柱：選取已清洗干凈的15 mm×75 cm中壓特制玻璃層析柱，垂直固定在鐵架臺(tái)上，出口連接乳膠管，將上述清洗好的Superdex 200 pg填料與適量超純水充分?jǐn)嚢柚辆鶆驊覞嵋汉?，用玻璃棒引流至層析柱上端管?～2 cm處，連接進(jìn)水口并打開恒流泵，用Tris-HCl緩沖液進(jìn)行壓柱與平衡，待凝膠液面不再改變。

上樣：將1.3.4節(jié)中的硫酸銨沉淀蛋白用Tris-HCl緩沖液配制成質(zhì)量濃度50 mg/mL的蛋白液，過0.22 μm水系膜，上樣至已完全平衡的層析柱，流速為1 mL/min。

洗脫收集：待Tris-HCl中鹽緩沖液洗脫至完全出峰后，收集各完整洗脫峰溶液待下一步測定[22]。

1.3.6 SDS-PAGE測定

將1.3.4節(jié)和1.3.5節(jié)中得到各洗脫峰分別采用12%、15%的分離膠與5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE分析，上樣量為10 μL，恒壓80 V，待樣品全部進(jìn)入分離膠后更改電壓為120 V，電泳結(jié)束后，染色40 min，脫色至背景無色，用凝膠電泳成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集并分析電泳條帶[23]，使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度掃描，分析蛋白純度[13]。

1.3.7 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鑒定

將硫酸銨分級(jí)沉淀得到的Jug r 1粗提取組分或分離純化得到目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶使用Easy nLC 1200色譜系統(tǒng)進(jìn)行色譜分離。對(duì)于粗提取物組分，流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈為80%）；梯度洗脫程序：0～3 min，95%～92% A、5%～8% B；3～43 min，92%～74% A、8%～26% B；43～48 min，74%～60% A、26%～40% B；48～50min，60%～10% A、40%～90% B；50～60 min，10% A、90% B。

對(duì)于純化后的蛋白質(zhì)條帶，其色譜分離條件為：流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-乙腈和水混合溶液（乙腈體積分?jǐn)?shù)80%）；梯度洗脫程序：0～2 min，98%～95% A、2%～5% B；2～44 min，95%～72% A、5%～28% B；44～51min，72%～60% A、28%～40% B；51～53min，60%～0% A、40%～100% B；53～60 min，0% A、100% B。肽段分離后用Q-Exactive HF-X質(zhì)譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴采集質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件：分析時(shí)長為60 min；檢測模式為正離子；母離子掃描范圍m/z350～1800；二級(jí)質(zhì)譜采集：每次全掃描后觸發(fā)采集20 個(gè)最高強(qiáng)度母離子的二級(jí)質(zhì)譜圖譜。使用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索軟件MaxQuant 2.0.1.0進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索及鑒定。

1.3.8 凝膠過濾層析條件優(yōu)化

凝膠過濾層析法受洗脫液pH值、上樣質(zhì)量濃度、上樣體積與洗脫流速的影響較大[24]，參照1.3.5節(jié)方法已確定Jug r 1目標(biāo)蛋白在pH 7.5時(shí)溶解性最好，故改變上樣質(zhì)量濃度、上樣體積與洗脫流速，研究其對(duì)Jug r 1目標(biāo)蛋白含量和得率的影響，從而對(duì)Jug r 1的凝膠過濾層析條件進(jìn)行優(yōu)化。其優(yōu)化條件如表1所示，分別收集各洗脫峰組分并測定Jug r 1含量，按下式計(jì)算Jug r 1得率：

表1 凝膠過濾層析單因素試驗(yàn)因素與水平Table 1 Levels of variables used in single-factor experiments on GFC

1.3.9 圓二色譜檢測二級(jí)結(jié)構(gòu)

參考Sun Lingge等[25]方法，先用0.01 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.4）將蛋白樣品配制為質(zhì)量濃度1 mg/mL的溶液，12000 r/min離心10 min后取上清液稀釋至0.1 mg/mL進(jìn)行分析，測定條件：室溫，帶寬0.2 nm，測定范圍190～240 nm，平均掃描速率100 nm/min，光徑1 mm。將所得樣品的圓二色性值轉(zhuǎn)換成平均摩爾橢圓度[θ]（deg·cm2/dmol），使用圓二色譜在線分析軟件（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml）對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析轉(zhuǎn)換，計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.3.10 純化前后核桃蛋白中Jug r 1含量的測定

選取核桃蛋白、40%～80%硫酸銨沉淀蛋白，以及經(jīng)凝膠過濾層析后的目標(biāo)峰組分，測定其Jug r 1含量，具體操作同1.3.3節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Excel處理數(shù)據(jù)，利用SPSS 25中單因素方差（ANOVA）進(jìn)行差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析（P＜0.05），并用Origin 2018和Image Lab 3.0（Beta 3）作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地核桃蛋白的Jug r 1含量

研究表明，核桃蛋白中的主要蛋白是谷蛋白（主要分布于17～19、33～35、55～70 kDa和250 kDa及以上）和球蛋白（主要分布于10～15、32～34、38～40、50～70 kDa）[26-27]。不同產(chǎn)地核桃蛋白SDS-PAGE如圖1A所示，不同產(chǎn)地的核桃蛋白條帶分布基本一致，分子質(zhì)量均在10～75 kDa范圍，說明含多種相同的蛋白亞基[28]，即這7 種核桃成分組成較為一致，同源性高。另外，不同產(chǎn)地核桃蛋白彼此間條帶明暗略有差異，其中保山隆陽的核桃蛋白條帶最多，且在11、17、28 kDa和35 kDa附近顏色較深，條帶較寬，說明其蛋白含量較高，種類較多。

圖1 不同產(chǎn)地核桃蛋白SDS-PAGE圖譜與Jug r 1含量Fig.1 SDS-PAGE profiles and Jug r 1 contents of walnut proteins from different regions

雙抗夾心ELISA法可以有效用于各種食物中過敏原蛋白的檢測[29]，不同產(chǎn)地核桃蛋白Jug r 1含量如圖1B所示。核桃中Jug r 1含量為：保山隆陽＞臨滄大泡＞昌寧細(xì)香＞大理龍佳＞大理娘青＞大理漾濞＞大姚三臺(tái)，其中，保山隆陽核桃中Jug r 1含量最高，為49.73 ng/L，約為大姚三臺(tái)核桃的2 倍，進(jìn)一步驗(yàn)證了SDS-PAGE結(jié)果。雖然臨滄大泡核桃與保山隆陽相比，二者蛋白中Jug r 1的含量沒有顯著差別，但根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果來看，保山隆陽產(chǎn)地的蛋白分子質(zhì)量條帶比臨滄大泡產(chǎn)地的條帶更多、顏色更深，各種蛋白分布的特征更明顯，更適合于下一步的觀察分析和分離純化。且保山隆陽為云南核桃主產(chǎn)區(qū)，選擇該地區(qū)的核桃進(jìn)行研究更有意義。因此選取保山隆陽的核桃進(jìn)行后續(xù)分離純化。

2.2 最佳硫酸銨分級(jí)沉淀提取Jug r 1的確定

如圖2所示，脫脂核桃粉經(jīng)Tris-HCl中鹽緩沖液提取后，小分子質(zhì)量條帶主要出現(xiàn)在浸提物的上清液中（泳道2），鑒于Jug r 1分子質(zhì)量在16 kDa附近，故選擇上清液進(jìn)一步硫酸銨分級(jí)沉淀。

圖2 硫酸銨分級(jí)提取后核桃蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE profiles of walnut proteins obtained after ammonium sulfate fractionation

結(jié)果顯示，硫酸銨飽和度在0%～40%區(qū)間的沉淀蛋白主要為大分子質(zhì)量蛋白（25～75 kDa，泳道3～5），小分子質(zhì)量蛋白在該區(qū)間的條帶顏色較淺，隨硫酸銨飽和度的增加，飽和度在40%～80%區(qū)間（泳道5～6）為小分子質(zhì)量蛋白集中沉淀區(qū)，其條帶顏色較深。張煜等[30]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到50%～65%的情況下，可將分子質(zhì)量為14～30 kDa的大豆蛋白分離開，其分子質(zhì)量為30 kDa以下的亞基條帶顏色加深，說明這些亞基含量相對(duì)較多，且蛋白的分級(jí)分離效果最好，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。考慮到飽和度在80%～100%區(qū)間的沉淀蛋白中硫酸銨飽和結(jié)晶過多，蛋白含量較少，難以收集且影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，后續(xù)選擇硫酸銨飽和度為40%～80%區(qū)間收集沉淀蛋白。

2.3 硫酸銨分級(jí)沉淀粗提Jug r 1的鑒定

對(duì)40%～80%飽和硫酸銨的沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3A所示。將符合目標(biāo)蛋白分子質(zhì)量范圍的凝膠（11～17 kDa左右凝膠，紅色標(biāo)記范圍）切下。硫酸銨飽和度為40%～80%區(qū)間獲得的目標(biāo)沉淀蛋白經(jīng)LC-MS/MS鑒定分析，如圖3B所示，該區(qū)域的凝膠檢測出致敏蛋白Jug r 1、Jug r 4、Jug r 6以及其他非致敏蛋白的存在。通過Uniprot蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）對(duì)其蛋白含量檢索發(fā)現(xiàn)，其中致敏蛋白Jug r 1的相對(duì)含量最高達(dá)到37.70%，占總致敏蛋白含量的76.03%。此外，經(jīng)LC-MS/MS鑒定和相對(duì)定量結(jié)果可以看出（圖3C和表2），硫酸銨飽和度為40%～80%區(qū)間蛋白條帶的蛋白數(shù)量與豐度較大，質(zhì)譜所收集到的關(guān)鍵峰以及組分復(fù)雜。圖3C中標(biāo)注有出峰時(shí)間的均為目標(biāo)蛋白Jug r 1，其主要集中在20～30 min附近出峰，當(dāng)出峰時(shí)間在27.0446 min時(shí)，目標(biāo)蛋白Jug r 1相對(duì)豐度最高，峰面積最大。由表2可以看出，P93198序列蛋白為致敏蛋白Jug r 1，其相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)到16.4 kDa，Jug r 1的覆蓋率最高達(dá)到44%。以上結(jié)果表明，采用飽和度為40%～80%硫酸銨分級(jí)沉淀的方法可較好地初步分離純化核桃致敏蛋白Jug r 1。

圖3 40%～80%飽和硫酸銨沉淀提取后核桃蛋白的SDS-PAGE圖譜和總離子流圖Fig.3 SDS-PAGE profiles and total ion current chromatogram of walnut proteins obtained after 40%–80% saturated ammonium sulfate fractionation

表2 40%～80%飽和硫酸銨沉淀提取后核桃蛋白的LC-MS/MS鑒定結(jié)果Table 2 LC-MS/MS identification of walnut proteins obtained after 40%-80% ammonium sulfate fractionation

2.4 Jug r 1凝膠過濾層析純化條件的確定

凝膠層析柱中的Superdex 200 pg是一種惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠物質(zhì)，可利用不同蛋白分子大小流經(jīng)的途徑差異將其分離[31]。如圖4A所示，飽和度區(qū)間為40%～80%的粗蛋白液經(jīng)凝膠層析過濾后，當(dāng)洗脫時(shí)間約為40 min時(shí)出現(xiàn)第1個(gè)峰，直至240 min左右結(jié)束出峰，共計(jì)出現(xiàn)6 個(gè)洗脫峰，按照出峰順序標(biāo)記為F1～F6。除F2外，幾乎所有峰的峰高較高，峰形窄而尖，說明分離效果較好。對(duì)6 個(gè)洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4 B 所示，F(xiàn) 1 所含蛋白組分較少，且條帶顏色較淡；F2、F3蛋白組分冗雜，其分子質(zhì)量主要集中在20～75 kDa之間，屬于高分子質(zhì)量蛋白；F4收集的蛋白質(zhì)組分只有1 條清晰的條帶，其分子質(zhì)量主要集中在11～17 kDa左右，符合目標(biāo)蛋白Jug r 1的分子質(zhì)量范圍；F5、F6處的蛋白濃度較低，幾乎檢測不到蛋白條帶。采用Image J軟件對(duì)凝膠過濾層析后F4組分的SDS-PAGE蛋白條帶進(jìn)行灰度值掃描，結(jié)果如圖5所示，根據(jù)蛋白電泳條帶峰面積，計(jì)算得到F4組分的蛋白純度占總蛋白的96.83%。因此，選擇F4組分的蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 40%～80%飽和硫酸銨沉淀提取后核桃蛋白的凝膠層析分離結(jié)果Fig.4 Gel filtration chromatographic separation and SDS-PAGE analysis of walnut proteins obtained after 40%-80% ammonium sulfate fractionation

圖5 凝膠層析分離后F4組分的SDS-PAGE灰度掃描峰面積圖Fig.5 SDS-PAGE grayscale scanning peak area of F4 obtained after gel filtration separation chromatography

2.5 LC-MS/MS鑒定分析

將F4組分樣品經(jīng)透析除鹽、凍干后進(jìn)行LC-MS/MS檢測，其總離子流圖如圖6所示。經(jīng)過凝膠過濾層析分離純化后的目標(biāo)蛋白Jug r 1與硫酸銨沉淀法初級(jí)分離純化的粗蛋白相比，質(zhì)譜收集的關(guān)鍵峰組分較少，表明分離純化之后，目標(biāo)蛋白Jug r 1純度提高，其關(guān)鍵出峰時(shí)間主要集中在57 min附近，經(jīng)數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，出峰時(shí)間分別在56.545、57.579、58.087、58.153 min附近的為目標(biāo)蛋白Jug r 1。綜合表3可知，F(xiàn)4組分的肽段數(shù)量單一，豐度較高，其中序列號(hào)為P93198的蛋白分值最高，其分子質(zhì)量為16.373 kDa，氨基酸序列為139，符合Jug r 1的典型特征[8]。此外質(zhì)譜共檢測到14 條肽段，均為對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)組中的唯一肽段，其中2 條肽段（GEEMEEMVQSAR、QQQQQGLR）為目標(biāo)蛋白Jug r 1所唯一對(duì)應(yīng)的肽段，總肽段長度最長（100～119），肽段分值最高（表4），故將其鑒定為Jug r 1。其他肽段使用UniProt蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）檢索發(fā)現(xiàn)，均為非致敏蛋白，其蛋白質(zhì)類型主要為蛋白組功能、分子功能、生物過程物質(zhì)，如細(xì)胞骨架（A0A834CXD8）、脂肪酸結(jié)合（A0A2I4E8T0）、DNA轉(zhuǎn)錄（A0A6P9EG14）等。

圖6 目標(biāo)組分的LC-MS/MS總離子流圖Fig.6 Total ion current chromatogram of of the target fraction

表3 目標(biāo)組分的LC-MS/MS鑒定結(jié)果Table 3 Results of LC-MS/MS identification of the target fraction

表4 目標(biāo)組分的LC-MS/MS肽段鑒定Table 4 LC-MS/MS peptide identification table of the target fraction

2.6 凝膠過濾層析條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖7A、B所示，Jug r 1的蛋白含量隨上樣質(zhì)量濃度的增加呈上升的趨勢，但蛋白得率卻呈下降趨勢，原因在于樣品質(zhì)量濃度隨著上樣質(zhì)量濃度的增加而增大，而上樣體積、洗脫流速保持固定不變，這導(dǎo)致Jug r 1增加的比例遠(yuǎn)小于樣品增加的比例。綜合蛋白吸收信號(hào)峰值及目標(biāo)蛋白Jug r 1得率，選擇上樣質(zhì)量濃度為30 mg/mL。由圖7C、D可知，Jug r 1的蛋白吸收信號(hào)峰值隨上樣體積的增加而增大，當(dāng)上樣體積為4 mL時(shí)，此時(shí)的樣品質(zhì)量濃度最高，Jug r 1含量最高，而Jug r 1得率卻與上樣體積為3 mL的相比無顯著差異（P＞0.05），為了更方便檢測Jug r 1的蛋白含量，綜合考慮選擇上樣體積為4 mL。圖7A～D結(jié)果與趙春燕等[32]報(bào)道一致，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度與上樣體積繼續(xù)增加時(shí)，蛋白吸收信號(hào)峰寬會(huì)有所增加，致使峰與峰之間分離不徹底，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)的得率無顯著提高作用，反而造成蛋白的浪費(fèi)。

圖7 凝膠過濾層析影響因素優(yōu)化Fig.7 Optimization of influential factors of gel filtration chromatography

由圖7E、F得知，Jug r 1含量和得率隨著洗脫流速的增加呈上升后下降的趨勢，當(dāng)洗脫流速為1 mL/min時(shí)，Jug r 1含量和得率分別達(dá)到最高（P＜0.05）。當(dāng)洗脫開始后，樣品質(zhì)量濃度隨著洗脫流速的增加而增加，此時(shí)Jug r 1含量和得率有所上升，但持續(xù)增加洗脫流速，洗脫流速過快造成部分樣品直接沒有分離而被洗脫，導(dǎo)致Jug r 1含量和得率下降。綜合而言，過快或過慢的洗脫流速都會(huì)降低對(duì)Jug r 1分離純化的效果，故選擇洗脫流速為1 mL/min。

綜上所述，確定凝膠層析最佳條件為上樣質(zhì)量濃度30 mg/mL、上樣體積4 mL、洗脫流速1 mL/min，在此條件下Jug r 1目標(biāo)蛋白含量和得率最高，分別為19.90 mg/120 mg上樣量和16.58%。

2.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)的表征

蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)是組成高級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，圓二色譜是研究蛋白質(zhì)溶液二級(jí)結(jié)構(gòu)的有效方法，其中肽鍵的吸收范圍在遠(yuǎn)紫外區(qū)能通過電子躍遷產(chǎn)生這個(gè)區(qū)域的信號(hào)，從而揭示肽鏈骨架結(jié)構(gòu)信息[33-34]。過敏原Jug r 1的圓二色譜圖及其二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲）的相對(duì)含量如圖8所示。由圖8A所示，過敏原Jug r 1在190～200 nm間有一正譜峰，于195 nm波長處為最大吸收峰，并顯示出209 nm和223 nm的雙負(fù)峰譜帶的存在，其中209 nm負(fù)峰是α-螺旋肽鍵的π-π*躍遷所致，223 nm負(fù)峰是α-螺旋肽鍵的n-π*躍遷所致[16,35]，表明過敏原蛋白Jug r 1明顯存在α-螺旋結(jié)構(gòu)。另外，通過圓二色譜在線軟件分析得到其二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量結(jié)果如圖8B所示，過敏原Jug r 1的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對(duì)含量最大為49.89%（P＜0.05），然后依次為無規(guī)卷曲（24.50%）、β-轉(zhuǎn)角（17.70%）、β-折疊（7.95%），這說明核桃過敏原Jug r 1以多種構(gòu)象共存，并以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。目前鮮見過敏原Jug r 1二級(jí)結(jié)構(gòu)的報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為核桃過敏原蛋白Jug r 1的后續(xù)研究提供一定參考。

圖8 Jug r 1的圓二色譜圖譜和二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組分圖Fig.8 CD spectrum and secondary structure composition of Jug r 1

2.8 核桃蛋白純化前后Jug r 1的含量

雙抗夾心ELISA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于致敏蛋白的定性和定量分析[36]。采用雙抗夾心ELISA法檢測核桃蛋白分離純化前后Jug r 1的含量變化如圖9所示，核桃蛋白的Jug r 1含量最低，經(jīng)40%～80%硫酸銨分級(jí)沉淀后，其Jug r 1含量呈顯著上升趨勢（P＜0.05），最后再經(jīng)凝膠過濾層析后，Jug r 1的含量最高（16.73 ng/L），顯著高于核桃蛋白和硫酸銨分級(jí)沉淀蛋白中Jug r 1含量（P＜0.05），說明經(jīng)過“兩步”分離純化可提高過敏蛋白Jug r 1的含量，為后續(xù)深入研究核桃蛋白的致敏性奠定基礎(chǔ)。

圖9 核桃蛋白純化前后Jug r 1的含量變化Fig.9 Changes in Jug r 1 content of walnut protein before and after purification

3 結(jié)論

針對(duì)云南不同產(chǎn)地的核桃，篩選出Jug r 1含量最高的保山隆陽產(chǎn)地核桃為原料，對(duì)其進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀、Superdex 200 pg凝膠過濾層析以分離純化Jug r 1，并采用SDS-PAGE、ELISA和LC-MS/MS等手段對(duì)Jug r 1進(jìn)行鑒定。在純化過程中，確定了目標(biāo)蛋白Jug r 1的最佳硫酸銨沉淀飽和區(qū)間以及凝膠過濾層析的最佳條件，“兩步”分離純化可獲得蛋白含量為19.90 mg/120 mg上樣量、蛋白純度占總蛋白96%以上的Jug r 1。圓二色譜表明，純化的Jug r 1以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主，雙抗夾心ELISA結(jié)果顯示，經(jīng)“兩步”分離純化后的核桃蛋白中Jug r 1含量顯著上升。本研究技術(shù)路線簡單、設(shè)備要求低、耗時(shí)短、重復(fù)性好，適合實(shí)驗(yàn)室少量制備，也可為核桃致敏蛋白Jug r 1后續(xù)的相關(guān)研究和應(yīng)用提供科學(xué)參考。