丁云錄 鄭明昱 南敏倫 金麗娜 延光海 赫玉芳

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長(zhǎng)春 130117;2延邊大學(xué))

鹿茸大補(bǔ)湯為收載于李濟(jì)馬的《東醫(yī)壽世保元》的朝醫(yī)經(jīng)方,由鹿茸、麥冬、薏苡仁、山藥、麻黃、杏仁、天冬、五味子八味藥材組成,具有健肺止咳,補(bǔ)肺益精的功效,為治療太陰人哮喘緩解期的有效方劑,在既往的研究中,通過(guò)鹿茸大補(bǔ)湯治療,支氣管哮喘緩解期患者臨床癥狀和體征顯著改善,臨床療效顯著,鹿茸大補(bǔ)湯能夠抑制氣道炎癥,可達(dá)到標(biāo)本兼治的功效〔1,2〕。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一員,是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分裂的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)樞紐,在哮喘氣道炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)從豚鼠肺組織病理?yè)p傷程度上衡量鹿茸大補(bǔ)湯顆粒對(duì)哮喘緩解期的治療作用,通過(guò)檢測(cè)ERK信號(hào)通路上的作用因子激活蛋白(AP)-1、原癌基因蛋白(C-Fos)的表達(dá)情況及其下游因子白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5的含量變化來(lái)探討鹿茸大補(bǔ)湯顆粒對(duì)哮喘緩解期的治療機(jī)制,明確鹿茸大補(bǔ)湯顆粒為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和安全有效的朝醫(yī)藥療法。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用3周齡Hartley豚鼠,普通級(jí),雌雄各半,體質(zhì)量200～230 g,分籠飼養(yǎng),室溫(21±2)℃,相對(duì)濕度50%～60%,通風(fēng)良好,室內(nèi)12 h明暗自動(dòng)切換,自由攝食、飲水。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(吉)2018-0006,購(gòu)于長(zhǎng)春市隆盛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。

1.2藥物及試劑 鹿茸大補(bǔ)湯顆粒劑,性狀：棕褐色顆粒,批號(hào)：20191001,吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植物化學(xué)研究中心提供。地塞米松片,規(guī)格：0.75 mg×100片/瓶,批號(hào)：1903052,安徽金太陽(yáng)生化藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。卵白蛋白(OVA,上海源葉生物科技,M04J10592182);組織固定液(廣州維格斯生物科技,18121204)。免疫球蛋白(Ig)E、IL-4、IL-5、干擾素(IFN)-γ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)RD,E20191101A);C-Fos 抗體(Santa Cruz,11364); AP-1抗體(Santa Cruz,D1375);5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液(boster,14A16B04);抗體稀釋液(boster,13G25C16)。

1.3儀器 美國(guó)UVP ChemiDoc-It 510凝膠成像分析系統(tǒng)(Ultra-Violet Products Ltd);BIO680酶標(biāo)儀(BIO RAD);OlympusBX51光學(xué)顯微鏡(Olympus);NIS-ELEMNT BR圖像分析系統(tǒng)(NIKON);Leica RM2255石蠟切片機(jī)(Leica);Leica EG1140石蠟包埋機(jī)(Leica)。DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠);Biofuge Stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)賀利氏)。

1.4分組、給藥、建立模型〔4～6〕將豚鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松2 mg/kg)、鹿茸大補(bǔ)湯顆粒高、中、低(4.500、2.250、1.125 g/kg)劑量組各8只。鹿茸大補(bǔ)湯顆粒,人口服日用量為30 g,每克顆粒相當(dāng)于1.5 g生藥量,根據(jù)體表面積折算豚鼠等效日用量為2.25 g/kg,藥效學(xué)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)劑量：分別取等效劑量1/2量1.125 g/kg、等效劑量2.25 g/kg、2倍等效劑量2.25 g/kg;地塞米松,豚鼠試驗(yàn)用藥效劑量采用人日用量等效劑量的2倍劑量,約為2 mg/kg。觀察無(wú)異常情況后,開(kāi)始制備哮喘氣道重塑模型。除正常對(duì)照組不作任何干預(yù)外,其余各組均進(jìn)行造模。第1天用10% OVA溶液1 ml/只進(jìn)行腹腔注射致敏,然后從第15天開(kāi)始用1% OVA溶液進(jìn)行霧化吸入造模,每天1次,連續(xù)7 d,直至各豚鼠出現(xiàn)嗆咳,躁動(dòng),呼吸頻率加速、幅度加大、節(jié)律不規(guī)整,腹肌痙攣,伏地、活動(dòng)減少等癥狀,則提示造模成功。造模成功后,正常對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃蒸餾水,給藥組灌胃相應(yīng)濃度的藥品,連續(xù)4 w。

1.5實(shí)驗(yàn)取材 治療結(jié)束后,以0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉豚鼠,腹主動(dòng)脈取血,靜置30 min,3 000 r/min離心15 min,分離血清。剪取肺右下葉,置于組織固定液中固定。另精確稱(chēng)量切取肺組織200 mg,置于液氮中,供Western印跡蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)用。

1.6Western印跡檢測(cè)〔7,8〕Western印跡法檢測(cè)AP-1、C-Fos蛋白的表達(dá),取組織200 mg剪碎后,加2 ml裂解液在冰上進(jìn)行勻漿裂解,12 000 r/min離心10 min后取上清即組織總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定總蛋白濃度。上樣緩沖液與蛋白樣品按1∶4的比例混勻,沸水加熱5 min,蛋白樣品充分變性、冷卻,2 500 r/min離心30 s,取上清加樣進(jìn)行電泳,每孔上樣量10 μl,電壓80 V。在冰浴條件下,80 V,300 mA進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。室溫?fù)u床下脫脂奶粉(TBST配制5%)封閉,4 ℃過(guò)夜。封閉結(jié)束后,脫脂奶粉溶液分別和AP-1、C-Fos一抗按200∶1比例配制,進(jìn)行37 ℃搖床孵育2 h,搖床上TBST洗膜3次(10 min/次);結(jié)束后脫脂奶粉溶液分別和AP-1、C-Fos二抗按2 000∶1配制,37 ℃搖床孵育1.5 h,搖床上TBST洗膜3次(10 min/次)。二抗孵育結(jié)束后顯影,將顯影液滴于膜上反應(yīng)2 min,在凝膠成像儀下曝光成像。

1.7ELISA 取血清,以ELISA檢測(cè)IgE、IL-4、IL-5、IFN-γ分泌水平,嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)。

1.8病理學(xué)觀察 豚鼠肺組織標(biāo)本,置于組織固定液中固定,乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察豚鼠肺部病理情況。依據(jù)肺內(nèi)炎癥變化,將動(dòng)物肺臟病理變化分級(jí)評(píng)價(jià)：0級(jí)：未見(jiàn)肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),未見(jiàn)肺泡融合,未見(jiàn)肺氣腫。1級(jí)：可見(jiàn)肺內(nèi)氣道旁輕度炎細(xì)胞聚集浸潤(rùn),肺內(nèi)間隔內(nèi)輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),肺間隔輕度增寬;2級(jí)：可見(jiàn)肺內(nèi)氣道中度炎細(xì)胞聚集浸潤(rùn),肺內(nèi)間隔內(nèi)中度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),肺間隔中度增寬;3級(jí)：可見(jiàn)肺內(nèi)氣道重度炎細(xì)胞聚集浸潤(rùn),肺內(nèi)間隔內(nèi)較多度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),肺間隔嚴(yán)重增寬,肺實(shí)變。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組肺組織AP-1、C-Fos蛋白表達(dá) 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組AP-1、C-Fos豚鼠肺組織蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01);與模型對(duì)照組比較,除鹿茸大補(bǔ)湯顆粒低劑量組外,鹿茸大補(bǔ)湯顆粒高、中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組中AP-1、C-Fos蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01,P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

1～6：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、鹿茸大補(bǔ)湯顆粒高劑量組、鹿茸大補(bǔ)湯顆粒中劑量組、鹿茸大補(bǔ)湯顆粒低劑量組圖1 Western印跡檢測(cè)肺各組組織AP-1、C-Fos蛋白表達(dá)

表1 鹿茸大補(bǔ)湯顆粒對(duì)OVA所致哮喘模型豚鼠肺組織AP-1、C-Fos蛋白表達(dá)的影響

2.2血清IgE、IFN-γ、IL-4和IL-5檢測(cè)含量 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組血清中IgE、IL-4、IL-5含量顯著升高,IFN-γ含量顯著降低(P<0.01,P<0.05)。與模型對(duì)照組比較,鹿茸大補(bǔ)湯顆粒高劑量可以明顯降低血清中IgE、IL-4、IL-5含量并明顯升高IFN-γ含量(P<0.01,P<0.05);陽(yáng)性對(duì)照組和鹿茸大補(bǔ)湯顆粒中劑量可以明顯降低血清中IgE、IL-4、IL-5含量(P<0.01,P<0.05);鹿茸大補(bǔ)湯顆粒低劑量可以明顯降低血清中IL-4、IL-5含量(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 鹿茸大補(bǔ)湯顆粒對(duì)OVA所致哮喘模型豚鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4和IL-5含量及肺組織病理?yè)p傷程度的影響

2.3肺組織病理?yè)p傷程度 模型對(duì)照組肺組織病理?yè)p傷程度較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01);鹿茸大補(bǔ)湯顆粒各劑量組豚鼠肺組織病理?yè)p傷程度與模型對(duì)照組比較,肺內(nèi)炎癥減輕,肺內(nèi)損傷程度改善。鹿茸大補(bǔ)湯顆粒高、中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組病理?yè)p傷程度分級(jí)與模型對(duì)照組比較,明顯減輕(P<0.01,P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4肺組織病理變化 HE染色結(jié)果示,正常對(duì)照組支氣管結(jié)構(gòu)正常,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型對(duì)照組支氣管炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,黏膜下層增寬,黏膜上皮增生,管腔黏液堵塞支氣管,肺間隔增寬;陽(yáng)性對(duì)照組支氣管炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較重,肺間隔增寬;鹿茸大補(bǔ)湯顆粒高、中、低劑量組雖可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理表現(xiàn),但較模型對(duì)照組明顯減輕。見(jiàn)圖2。

3 討 論

支氣管哮喘是一種慢性過(guò)敏反應(yīng)性氣道炎癥,其發(fā)病機(jī)制為氣道的過(guò)敏反應(yīng)性炎癥、變態(tài)反應(yīng)、氣道高反應(yīng)及氣道重構(gòu)等,ERK信號(hào)通路在哮喘氣道炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,參與了支氣管哮喘發(fā)病的各個(gè)環(huán)節(jié)〔9,10〕。ERK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)非常重要的一條信息通路,在細(xì)胞增殖分化方面起著至關(guān)重要的作用,參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和促炎癥細(xì)胞因子表達(dá),異常激活的ERK會(huì)促進(jìn)腫瘤和炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。AP-1處于ERK信號(hào)通路的下段,在人體的各種組織細(xì)胞上均有表達(dá),是體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子,主要由原癌基因編碼的蛋白質(zhì)C-Fos和C-Jun組成。AP-1作為轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)與DNA上相應(yīng)的靶序列結(jié)合參與細(xì)胞內(nèi)多種生理病理過(guò)程,如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)等,可參與調(diào)節(jié)多種炎性介質(zhì)的合成,在一定程度上調(diào)控了支氣管哮喘的炎癥反應(yīng),支氣管哮喘發(fā)病的關(guān)鍵〔11〕。AP-1的活化能夠接收信號(hào),從而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄與炎癥蛋白的合成,調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞因子如IL-4、IL-5的表達(dá),這是哮喘氣道炎癥的發(fā)生機(jī)制之一〔12,13〕。C-Fos作為一種即刻早期基因,在生理狀態(tài)下即有低水平表達(dá),調(diào)控著多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化,已證實(shí)C-Fos參與了氣道炎癥反應(yīng)〔14〕。本研究結(jié)果顯示,鹿茸大補(bǔ)湯顆粒對(duì)哮喘緩解期的治療有效,其機(jī)制可能是通過(guò)降低ERK信號(hào)通路中AP-1、C-Fos的表達(dá),從而減輕氣道炎性反應(yīng),抑制氣道重塑來(lái)實(shí)現(xiàn)。

另外,當(dāng)機(jī)體受到過(guò)敏原刺激時(shí),IgE交聯(lián)導(dǎo)致肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒釋放白三烯和組胺等炎性介質(zhì)進(jìn)而引發(fā)哮喘的炎癥反應(yīng),降低IgE水平,可有效緩解肺組織的炎癥程度〔15〕。當(dāng)機(jī)體受異?？乖碳r(shí),Th1細(xì)胞亞群功能低下,顯著表現(xiàn)為血清中IFN-γ濃度降低;Th2細(xì)胞亞群功能亢進(jìn),顯著表現(xiàn)為血清中IL-4 濃度升高〔16〕。大量IL-4可促進(jìn)機(jī)體Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)變,抑制其向Th1細(xì)胞的分化,導(dǎo)致Th2出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)表達(dá),大量釋放IL-5、IL-13,進(jìn)而釋放粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF);IL-5則與 GM-CSF共同作用,激活嗜酸性粒細(xì)胞的釋放,引發(fā)氣道炎癥,多種途徑協(xié)同作用,共同誘發(fā)哮喘〔17,18〕。研究表明,哮喘緩解期患者仍然存在Th1/Th2亞群失衡,主要表現(xiàn)為外周血IgE、IL-4、IL-5等仍高于正常,而IFN-γ降低〔19～21〕。本研究證實(shí)鹿茸大補(bǔ)湯顆粒可有效抑制IgE的合成,降低IL-4、IL-5含量,升高IFN-γ含量。

本文采用豚鼠哮喘緩解期模型,動(dòng)物在哮喘緩解期內(nèi)處于主要癥狀消失、病情基本緩解的哮喘緩解階段,但在此階段,氣道慢性炎癥及炎癥導(dǎo)致的氣道高反應(yīng)性和氣道重塑等病理特征依然存在。本研究結(jié)果可見(jiàn),鹿茸大補(bǔ)湯顆粒對(duì)豚鼠哮喘緩解期的調(diào)控作用機(jī)制與激活ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān),即激活ERK,進(jìn)而介導(dǎo)AP-1、C-Fos的轉(zhuǎn)錄活化,有效抑制IgE的合成,降低IL-4、IL-5含量,升高IFN-γ含量,保持Th1/Th2細(xì)胞亞群平衡,對(duì)哮喘緩解期病理改變及相關(guān)炎癥因子有較好的干預(yù)作用,有效改善肺內(nèi)損傷程度。