劉靜 李玉燕 伊俊豪 武雨俠 鄧永健

(新疆阿勒泰地區(qū)中醫(yī)醫(yī)院(阿勒泰地區(qū)哈薩克醫(yī)醫(yī)院),新疆 阿勒泰 836500)

深靜脈血栓(DVT)是一種靜脈回流障礙性疾病,血液在血管內(nèi)發(fā)生凝結(jié)后阻塞血管所導(dǎo)致的高發(fā)疾病〔1〕。DVT流行病學(xué)研究證實(shí),全球每年DVT死亡人數(shù)約1 500萬人,發(fā)病率高達(dá)1/1 000,因早期靜脈血栓栓子可隨著血液循環(huán)達(dá)到肺部誘發(fā)肺部栓塞,具有高死亡率及易漏診等特點(diǎn),嚴(yán)重威脅患者生命安全〔2〕。氧化應(yīng)激是指機(jī)體細(xì)胞或組織氧自由基升高或清除活性氧自由基(ROS)能力降低而誘發(fā)的氧化損傷過程。在病理?xiàng)l件下氧化應(yīng)激可增加血管內(nèi)皮功能損傷,主要是通過促進(jìn)炎癥因子激活而加快血管系統(tǒng)障礙而加快DVT形成〔3〕。這與以往學(xué)者研究的氧化應(yīng)激與多種心血管疾病發(fā)展密切相關(guān)的研究類似〔4〕。核因子-E2相關(guān)因子(Nrf)2是氧化應(yīng)激敏感因子,可被諸多因素如ROS、抗氧化劑等激活進(jìn)入細(xì)胞核,與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合,調(diào)控體內(nèi)多種抗氧化酶的表達(dá),從而發(fā)揮抗氧化作用〔5〕。血紅素加氧酶(HO)-1能夠通過降解亞鐵血紅素生成一氧化碳等產(chǎn)物參與氧化應(yīng)激損傷等病理生理過程。以往研究證實(shí),在DVT產(chǎn)生時(shí)存在血栓素(TX)A2/前列腺素(PG)F1α表達(dá)異常,TXA2具有促進(jìn)血小板聚集和加快血管收縮的作用,PGF1α與之存在相反作用,能夠抑制血小板聚集發(fā)揮血管擴(kuò)張作用,在非病理?xiàng)l件下兩者處于動(dòng)態(tài)平衡階段但是在DVT病理?xiàng)l件下兩者存在不穩(wěn)定性,可轉(zhuǎn)化為TXB2和 6-Keto-PGF1α,增加血管斑塊聚集從而加重病情〔6〕。

目前對DVT的治療主要以西藥為主,但是西藥用藥安全性和毒副作用仍處于討論階段。中藥在治療DVT具有較大優(yōu)勢和潛力。淫羊藿苷是從淫羊藿總黃酮中提取的有效成分,可在葉淫羊藿、柔毛淫羊藿等干燥莖葉中提取,具有改善腦缺血缺氧、減少心肌梗死及增加抗氧化酶活性的作用〔7〕。針刺是我國傳統(tǒng)治療方式之一,經(jīng)絡(luò)與五臟六腑之間關(guān)聯(lián)密切。長期以來,針灸在治療腦卒中、高血壓及糖尿病等方面療效較好,被認(rèn)為能夠發(fā)揮調(diào)氣利血、溫經(jīng)通絡(luò)作用〔8〕。但是將淫羊藿苷聯(lián)合針灸治療DVT的治療研究較少,因此本文通過建立DVT大鼠模型觀察淫羊藿苷聯(lián)合針灸的療效,為DVT臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)大鼠 SD成年雄性大鼠50只,體質(zhì)量225～260 g,4～5周齡,在廣東省醫(yī)學(xué)SD大鼠中心購買。動(dòng)物許可證號：SYXK(粵)2017-0026,5只大鼠1個(gè)籠子,溫度23 ℃左右,濕度要求50%左右,黑夜白晝交替循環(huán),自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料,飲干凈飲用水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于開始實(shí)驗(yàn)前,適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1 w。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的實(shí)施嚴(yán)格遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》,試驗(yàn)嚴(yán)格遵守國際疼痛學(xué)會(huì)使用指南,盡可能減少大鼠的使用量、對大鼠的傷害及導(dǎo)致的痛苦。

1.2藥物、試劑與儀器 淫羊藿苷〔默克生命科學(xué),高效液相色譜HPLC≥94%,美國化學(xué)文摘服務(wù)社(CAS)：489-32-7,國藥準(zhǔn)字：20150311〕;戊巴比妥鈉(上海上藥新亞,國藥準(zhǔn)字：31021724,注射用水稀釋為2% 溶液);Nrf2單抗、HO-1單抗〔艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)〕;蘇木素-伊紅(HE)試劑盒(上海莼試生物);毫針(蘇州神龍針灸醫(yī)療,規(guī)格：0.30 mm)、華佗牌電針治療儀(上海醫(yī)用電子儀器,SDZ-Ⅱ),蛋白電泳儀(北京六一生物 DYCZ-24DH)。

1.3分組及DVT模型建立 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字方法分為Sham組、DVT組、藥物組、針刺組及聯(lián)合組,均10只。大鼠均采用0.2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉,保持仰臥位及固定,消毒鋪巾,逐層分離腹部皮膚,沿著左下肢股靜脈行走切3.5 cm的皮膚,顯露且游離左側(cè)股靜脈,采用(1-0)結(jié)扎近心端股靜脈,肉眼可見左下肢腫脹則為建模成功。Sham組不進(jìn)行結(jié)扎,僅做一切口后縫合。

1.4干預(yù)方法 建模成功后,藥物組灌胃0.1 ml/kg的淫羊藿苷,連續(xù)干預(yù)3 w,針刺組根據(jù)華興邦制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜取穴,取足三里、脾俞及膈俞。大鼠固定在自制的操作臺(tái)上,暴露皮膚后標(biāo)色定位。采用0.30 mm不銹鋼無菌針針刺所選穴位,連接SDZ-Ⅱ行電針治療儀,采用連續(xù)波以局部皮肉輕度顫動(dòng)為易,留針15 min,每日1次,連續(xù)3 w。聯(lián)合組治療方法同藥物組和針刺組。Sham組和DVT組均灌胃等體積0.9%生理鹽水。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測TXB2及6-Keto-PGF1α水平 干預(yù)后大鼠空腹取靜脈血1.2 ml,保存在乙二胺四乙酸(EDTA)管,離心機(jī)按照3 000 r/min(半徑10 cm)分離10 min,離心完成后靜置10min,保留上清液保存于-20 ℃冰箱中,采用ELISA檢測TXB2及6-Keto-PGF1α水平。

1.6氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 干預(yù)后各組取血同上,保留血清采用黃嘌呤氧化酶法檢測各組血清中超氧化物歧化酶(SOD)水平,采用硫代巴比妥酸(TBA)方法檢測各組血清中丙二醛(MDA),可見光法分析檢測過氧化氫酶(CAT)及比色法方法檢測谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-px)水平。

1.7組織提取及HE染色 2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉后,固定于恒溫臺(tái)上,心臟穿刺致死,開腹部剝離左側(cè)下腔靜脈血管,Bonic液固定血管石蠟包。10%甲醛溶液中,固定過夜,自來水沖洗,浸泡于14% EDTA溶液中脫鈣,逐層脫水后石蠟包埋后4 μm切片后備用。組織切片放入37 ℃復(fù)溫15 min,二苯甲脫蠟后按照100%～95%～85%及75%乙醇進(jìn)行逐層脫水,蘇木素染色10 min,鹽酸(1%)處理,伊紅復(fù)染,100%～95%～85%及75%乙醇脫水,封片后觀察組織形態(tài)。

1.8TUNEL法檢測各組血管組織內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 血管組織與蛋白酶K室溫孵育,切片浸入TUNEL反應(yīng)液中,后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次。過氧化氫沖洗淬滅酶活性,后聯(lián)合抗生物蛋白過氧化氫酶和二氨基聯(lián)苯胺覆蓋,光學(xué)高倍顯微鏡下進(jìn)行觀察凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色,隨機(jī)選擇5個(gè)視野下的細(xì)胞觀察凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9免疫印跡檢測血管組織中Nrf2/HO-1表達(dá) 取血管組織50 mg,采用PBS沖洗后切碎,加入1 ml的細(xì)胞裂解液,10 000 r/min 4 ℃離心5 min,取上清液,加入樣孔中,采用二喹啉甲酸(BCA)法測總蛋白濃度,每孔上樣蛋白量20 μg,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。轉(zhuǎn)印緩沖液配制好后放入4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷,然后全部轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,再把脫脂奶粉加入,全程封閉時(shí)長1 h。加入1抗Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶1 000),TBS-吐溫2緩沖液(TTBS)漂洗3次,每次10 min;4 ℃過夜,加入羊抗兔IgG二抗(1∶2 500),電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑系統(tǒng)JY-Clear分析蛋白值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血清中TXB2、6-Keto-PGF1α及TXB2/6-Keto-PGF1α水平比較 與Sham組相比,其余4組血清中TXB2、TXB2/6-Keto-PGF1α水平顯著升高,6-Keto-PGF1α水平顯著降低(P<0.05);與DVT組相比,藥物組、聯(lián)合組及針刺組TXB2、TXB2/6-Keto-PGF1α水平顯著降低,6-Keto-PGF1α水平顯著升高(P<0.05);與藥物組及針刺組相比,聯(lián)合組血清中TXB2及TXB2/6-Keto-PGF1α水平顯著降低,6-Keto-PGF1α水平顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 各組血清中TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-Keto-PGF1α及SOD、MDA、CAT、GSH-px水平比較

2.2各組血清中氧化應(yīng)激SOD、MDA、CAT及GSH-px水平比較 與Sham組相比,其余4組血清中MDA顯著升高,SOD、CAT及GSH-px水平顯著降低(P<0.05);與DVT組相比,藥物組、聯(lián)合組及針刺組血清中MDA顯著降低,SOD、CAT及GSH-px水平顯著升高(P<0.05);與藥物組及針刺組相比,聯(lián)合組血清中MDA顯著降低,SOD、CAT及GSH-px水平顯著升高(P<0.05),見表1。

2.3HE染色檢測各組靜脈血管組織病理改變 Sham組下腔靜脈管腔無明顯擴(kuò)張,血管腔內(nèi)無實(shí)質(zhì)性血栓形成,血管靜脈結(jié)構(gòu)及內(nèi)膜完整,未見壞死內(nèi)皮細(xì)胞;DVT組下腔靜脈內(nèi)可見大量血栓形成,顏色呈現(xiàn)暗紅色,血管壁組織疏松、水腫及內(nèi)膜呈現(xiàn)不規(guī)則的同時(shí)存在大量炎癥細(xì)胞浸潤。藥物組及針刺組炎癥細(xì)胞減少,血栓減少但血管內(nèi)膜呈現(xiàn)不規(guī)則;聯(lián)合組靜脈管腔出現(xiàn)擴(kuò)張,管腔內(nèi)血栓減少及未見炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組靜脈血管組織病理改變(HE染色,×200)

2.4TUNEL法檢測各組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率比較 與Sham組〔(3.14±0.23)%〕相比,DVT組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率〔(14.25±2.55)%〕顯著升高(P<0.05);與DVT組相比,藥物組及針刺組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率〔分別為(9.25±1.44)%、(8.69±1.50)%〕顯著降低(P<0.05);與藥物組及針刺組相比,聯(lián)合組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率〔(6.85±1.24)%〕顯著降低(P<0.05),見圖2。

2.5免疫印跡檢測各組血管組織中Nrf2、HO-1蛋白水平 與Sham組相比,其余4組血管組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與DVT組相比,藥物組、聯(lián)合組及針刺組血管組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與藥物組及針刺組相比,聯(lián)合組血管組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),見表2、圖3。

表2 各組血管組織中Nrf2、HO-1蛋白水平

3 討 論

DVT疾病常發(fā)生在髖關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后并常伴隨脊髓損傷,發(fā)生率高達(dá)80%～100%,且5%的患者合并肺栓塞。DVT形成早期常導(dǎo)致靜脈血栓脫落,其可隨血液循環(huán)而達(dá)到肺部誘發(fā)肺栓塞,升高患者死亡率。DVT疾病形成與機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)存在相關(guān)性,DVT發(fā)生早期機(jī)體存在炎癥損傷,可生存大量ROS,打破了機(jī)體氧化-抗氧化平衡,導(dǎo)致血液中存在大量ROS,形成內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷而增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本研究表示,DVT大鼠氧化應(yīng)激損傷加劇,通過灌胃淫羊藿苷聯(lián)合針刺能夠通過抑制氧化應(yīng)激而改善內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,減少血管內(nèi)皮損傷,并通過上調(diào)血管組織中Nrf2/HO-1活性而發(fā)揮作用。

DVT的發(fā)生機(jī)制與血流緩慢及血管內(nèi)膜損傷相關(guān),血管內(nèi)膜損傷可導(dǎo)相關(guān)因子異常,共同促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展。前列環(huán)素(PGI)2是主要產(chǎn)生于血管內(nèi)皮細(xì)胞并能夠具有抑制血小板聚集抑制血栓形成的因子。TXA2是一種主要由血小板分泌,存在血管收縮及聚集作用因子。在正常生理環(huán)境下上述兩種因子可保持動(dòng)態(tài)平衡以維持凝血功能正常,但當(dāng)上述指標(biāo)出現(xiàn)極不穩(wěn)定時(shí)能夠轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的TXA2/6-Keto-PGF1α而加重血管損傷〔9〕。在中醫(yī)學(xué)中DVT可歸為“脈痹”或腫脹范疇,根據(jù)現(xiàn)在中醫(yī)診療規(guī)范將其統(tǒng)一稱之為“股腫”,認(rèn)為其發(fā)生機(jī)制與瘀、濕及熱相關(guān),臨床治療以益氣活血化瘀為治療根本〔10〕。清代唐宗?！堆撟C·吐血》中認(rèn)為淤血不去,新血不生,認(rèn)為活血化瘀是治療總原則。淫羊藿苷屬于小檗科淫羊藿植物葉中提取的總黃酮的主要活血成分,現(xiàn)代藥理認(rèn)為其具有增加免疫功能、改善心腦血管功能及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用〔11〕。淫羊藿在《本草綱目》中被稱為具有“益糟氣,堅(jiān)筋骨,補(bǔ)腰膝,強(qiáng)心力”之功效?，F(xiàn)代理論認(rèn)為其能夠通過增加血管內(nèi)皮血流量,改善微循環(huán)而減少組織缺氧缺血,發(fā)揮血管保護(hù)作用〔12〕。DVT疾病血瘀為標(biāo)本,針刺百會(huì)穴能夠振奮周身陽氣達(dá)到舒筋通絡(luò)而健腦補(bǔ)髓發(fā)揮調(diào)和氣血等功能,而有利于減少血瘀,發(fā)揮減少血栓的作用。周宇博等〔13〕研究表示,采用針刺風(fēng)池穴、百會(huì)穴及雙側(cè)風(fēng)池穴能發(fā)揮祛除血瘀而改善腦血管血瘀的作用。本研究說明,淫羊藿苷聯(lián)合針刺能夠通過抑制TXA2/6-Keto-PGF1α表達(dá)而抑制血管血栓形成。

氧化應(yīng)激是廣泛存在于生物體內(nèi),受到刺激產(chǎn)生的一種防御反應(yīng)。在創(chuàng)傷、炎癥反應(yīng)等病理?xiàng)l件下,其氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)的同時(shí)導(dǎo)致大量氧化應(yīng)激因子水平異常,加快血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及凋亡〔14〕。SOD水平升高表示機(jī)體總抗氧化能力減弱。SOD屬于一種細(xì)胞自由基清除劑,具有促進(jìn)超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的作用,同時(shí)可抑制MDA等氧化因子的表達(dá),具有內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)和穩(wěn)定的作用。DVT發(fā)生后可存在大量ROS及羥自由基生成,CAT及GSH-ps降低,MDA表達(dá)升高是脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物,能夠參與機(jī)體氧化系統(tǒng)失衡,較好反應(yīng)血管內(nèi)皮過氧化損傷程度〔15〕。以往研究證實(shí),淫羊藿苷能夠較好改善微血管心肌缺血,還能通過改善血管氧化應(yīng)激而增加內(nèi)皮細(xì)胞活性〔16〕。淫羊藿苷是淫羊蕾的主要成分,屬于補(bǔ)腎溫陽藥物,具有抗氧化應(yīng)激損傷及保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。胡彥武〔17〕研究表示,淫羊藿苷能夠減少半胱氨酸(Hcy)誘導(dǎo)的血管損傷,主要通過抑制MDA表達(dá)、增加SOD水平,進(jìn)一步減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗血栓作用。針刺具有抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)自由基而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。針刺的抗氧化作用通過調(diào)節(jié)體內(nèi)自由基動(dòng)態(tài)平衡,從而發(fā)揮抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷等作用。在卵巢細(xì)胞中,磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是細(xì)胞活性調(diào)節(jié)因子,針刺能夠調(diào)節(jié)信號通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡機(jī)制。本研究說明,淫羊藿苷聯(lián)合針刺可通過抑制氧化損傷而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

在氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中Nrf2/HO-1活性失活,其表達(dá)升高后能夠抑制由糖代謝異常導(dǎo)致的氧化損傷,DVT發(fā)生過程中炎癥因子被激活可促進(jìn)巨噬細(xì)胞活性并聚集,進(jìn)而形成斑塊阻塞血管〔18〕。在DVT小鼠模型中激活Nrf2可增加下游Ⅱ相酶表達(dá),減少低密度脂蛋白介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞聚集,減少血管內(nèi)泡沫細(xì)胞形成,減少血栓形成。HO-1是Nrf2信號的下游靶基因,兩者結(jié)合后能夠抑制DVT中斑塊形成,結(jié)合以往研究證實(shí)抑制血管氧化損傷能夠上調(diào)Nrf2/HO-1表達(dá)并與減少血管損傷相關(guān)〔19〕。淫羊藿苷可通過激活Nrf2水平而發(fā)揮抗氧化作用,能夠減少炎癥反應(yīng)而發(fā)揮血管保護(hù)作用。針灸具有調(diào)節(jié)微循環(huán)而發(fā)揮抗炎及抗氧化應(yīng)激功能,其被認(rèn)為在創(chuàng)傷性腦出血大鼠中能夠通過抗氧化作用激活Nrf2/HO-1表達(dá),而發(fā)揮腦血管保護(hù)作用。陳明霞等〔20〕研究表示,淫羊藿苷劑量依賴性地通過激活Nrf2/HO-1/醌氧化還原酶(NQO)1信號通路改善缺血再灌注引起的大鼠腎損傷。潘亮等〔21〕研究表示,銀杏達(dá)莫聯(lián)合針灸通過上調(diào)Nrf2/HO-1通路活性改善大鼠創(chuàng)傷性腦出血后神經(jīng)功能,這與抑制氧化應(yīng)激損傷相關(guān)。本研究結(jié)果表明,淫羊藿苷聯(lián)合針刺可激活Nrf2/HO-1抗氧化損傷,發(fā)揮血管保護(hù)作用。

綜上,淫羊藿苷聯(lián)合針灸能夠通過抑制TXB2/6-Keto-PGF1α及氧化應(yīng)激水平改善血管內(nèi)皮損傷,與激活Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)。本文仍存在一定不足之外,未進(jìn)行細(xì)胞有關(guān)試驗(yàn)及樣本量較少,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容單一,今后應(yīng)擴(kuò)大樣本量充實(shí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,為相關(guān)研究提供有利依據(jù)。