柏小金 徐林 劉福英 艾敏 黃文良

(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 遵義市第一人民醫(yī)院骨科,貴州 遵義 563000)

糖尿病足是糖尿病性肢端壞疽,是通過神經(jīng)病變感染、糖尿病外周血管病變等引起下肢或足損傷的一類病變〔1〕。有研究發(fā)現(xiàn)〔2,3〕,出現(xiàn)壞疽或足潰瘍的糖尿病患者占比≥15%。血管基底膜加厚、血液高黏滯綜合征、內(nèi)皮受損、微循環(huán)異常等為造成糖尿病足的重要病理特征,而低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α在缺氧的環(huán)境下可對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)轉(zhuǎn)錄予以調(diào)控以控制VEGF的表達水平;VEGF為促血管生成的重要因子,可有效促使血管的修復(fù)與生成,改善體內(nèi)微循環(huán),促進糖尿病足潰瘍愈合〔4,5〕。血管腔內(nèi)介入、血管移植術(shù)等下肢血供重建手段為臨床診治糖尿病足潰瘍較為常用的方法,但無法改善微循環(huán)?；谠偕墙M織前先新生血管網(wǎng)絡(luò)的原理,臨床對下肢慢性缺血性病通過伊里扎洛夫(Ilizarov)技術(shù)進行治療,效果顯著〔6,7〕?；诖?本文探究Ilizarov技術(shù)治療糖尿病足潰瘍及對創(chuàng)面組織中HIF-1α/VEGF信號通路的調(diào)節(jié)效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取SPF級的大鼠35只,7～8周齡,體質(zhì)量200～255 g,平均為(230.38±15.10)g,大鼠許可證號：SYXK(川)2021-246,大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：55%～70%濕度,22～27 ℃溫度,且在標準鼠籠中喂養(yǎng),光照24 h,明暗循環(huán)12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開始試驗。本試驗均嚴格按動物實驗標準予以操作,且取得遵義市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2建模與分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后,參照于澤洋等〔8〕方法建模。隨機選10只大鼠為對照組并喂普通飼料,剩余25只用高糖高脂的飼料進行喂養(yǎng),喂養(yǎng)4 w后,對照組一次性腹腔輸注檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L),剩余的25只大鼠一次性腹腔注入60 mg/kg 鏈脲佐菌素〔STZ,在pH4.5的檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L)內(nèi)溶解〕,72 h后對血糖水平進行測定,空腹下血糖水平超過16.5 mmol/L的大鼠視為糖尿病模型大鼠,最終有20只大鼠完成建模。經(jīng)腹腔輸注4% 水合氯醛麻醉大鼠,在無菌的條件下通過5 mm的皮膚活檢打孔器于大鼠的背側(cè)后足建立單個圓形全程皮膚潰瘍創(chuàng)面?zhèn)?以完成建模,即為糖尿病足潰瘍模型大鼠。將建模完成的20只大鼠隨機分成模型組與Ilizarov技術(shù)組,每組10只。對照組與模型組灌胃生理鹽水6 ml/kg,每天灌胃1次,連續(xù)干預(yù)4 w。

1.3Ilizarov技術(shù)干預(yù) 首先在術(shù)前控制飲食的基礎(chǔ)上,皮下輸注胰島素進行血糖控制,盡量使空腹血糖<8.0 mmoI/L,按創(chuàng)面分泌物監(jiān)測培養(yǎng)細胞的結(jié)果,選取有效的抗生素,且在治療后按培養(yǎng)與藥敏的結(jié)果調(diào)節(jié)使用抗生素的方法,大鼠均施以活血化瘀以改善機體微循環(huán)、神經(jīng)代謝及營養(yǎng)治療等。術(shù)中先進行全身麻醉或硬膜外麻醉,不使用止血帶,在患病肢體的脛骨內(nèi)前方的中下段畫出截骨的范圍,長度約占脛骨長度1/4,長20 mm,寬10 mm,先在截骨的部位施以3個縱向約10 mm的切口,選取閉合截骨器(1.5 mm)在脛骨的內(nèi)側(cè)嵴處切口約10 mm×5 mm大小的脛骨骨窗,于骨塊處鉆有2個1.5 mm直徑的孔,放置2根橫拉牽引針,且平行于牽引針,在脛骨的上下端平行鉆進4根2.0 mm直徑的固定針,后使用薄骨刀將骨皮質(zhì)切透,裝置橫向的骨搬移儀器。固定安裝各個固定釘與提位釘,切口縫合、消毒、包扎,完成手術(shù)。

1.4創(chuàng)面愈合率及創(chuàng)面平均愈合時長檢測 分別于成功建模與Ilizarov技術(shù)干預(yù)后對創(chuàng)面予以拍攝,且經(jīng) ImageJ 軟件檢測創(chuàng)面面積,通過公式分析創(chuàng)面的愈合狀況：創(chuàng)面愈合率=(完成建模后創(chuàng)面的面積-干預(yù)治療后的創(chuàng)面面積)/建模完成后的創(chuàng)面面積×100%。對各組大鼠創(chuàng)面完全愈合的時間進行統(tǒng)計分析,算出各組大鼠創(chuàng)面的平均愈合時間。

1.5血清炎癥因子檢測 在Ilizarov技術(shù)干預(yù)后抽取腹部血3 ml,以離心轉(zhuǎn)速3 000 r/min、半徑5 cm、10 min,分離上清,-60 ℃冰箱中保存,待檢。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對各組白細胞介素(IL)-6、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF)-α進行檢測。ELISA試劑盒分別由武漢菲恩生物科技有限公司提供。

1.6病理組織學(xué)觀察 腹腔輸注4%水合氯醛麻醉大鼠,且將其斷頸處死,分別取各組大鼠的足潰瘍創(chuàng)面組織,制成樣本,于-70 ℃冰箱儲存,備用。取部分組織置于10%多聚甲醛溶液內(nèi)進行固定,24 h后取出,進行脫水、脫蠟、切片等處理,用蘇木素-伊紅染色(HE),監(jiān)測各組足潰瘍創(chuàng)面的病理狀況。

1.7創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF mRNA水平檢測 取冰凍創(chuàng)面組織,冰上溶解15 min,采取Trizol試劑對組織內(nèi)總RNA予以提取,選用PrimeScriptRTMaster Mix 試劑盒用逆轉(zhuǎn)錄程序?qū)DNA進行合成,通過實時熒光定量法檢測HIF-1α、VEGF mRNA水平,采用Primer5.0軟件設(shè)計引物序列,開啟PCR儀,引物序列：HIF-1α正向：5′-CTGTGCATGCACAGAAGTGTGTGCTA-3′,HIF-1α反向：5′-TGTGACTGACTTGCGCTCGACTGTAG-3′;VEGF正向：5′-TGTGACTGACTTGCTGTGTGTCGTA-3′,VEGF反向：5′-GTACTACCTGGCTCTGTGTGCGCGT-3′。β-actin正向：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,反向：5′-CAGGGG CCATGCTAATCTT-3′。PCR擴增的條件：95 ℃ 1 min,后行45個70 ℃ 10 s及60 ℃ 20 s的循環(huán),并采取2-△△Ct方法計算HIF-1α、VEGF mRNA水平表達,β-actin作內(nèi)參。

1.8HIF-1α/VEGF信號通路蛋白相對表達量檢測 應(yīng)用Western印跡法檢測各組大鼠創(chuàng)面組織中的HIF-1α、VEGF水平,取各組大鼠冷凍組織,冰上溶解15 min,以比例100 mg：1 ml放等量體積的蛋白液內(nèi)行裂解反應(yīng),于5 ℃靜置5 min,將各組的樣本放于離心機中,分離清液,使用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白液體的含量,試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司(貨號：PA115-01)提供,計算樣本值,后將50 μg 蛋白樣本行凝膠電泳分離1.0～1.5 h,后將凝膠中的蛋白標本放置聚偏氟乙烯(PVDF)膜上2 h,加HIF-1α、VEGF抗體為一抗,按1∶1 000比例予以稀釋,維持5 ℃過夜,Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)清洗膜3～5次,次日加入辣根過氧化物酶(HRP)標記作二抗,室溫培養(yǎng)1 h,加顯色劑,放于光鏡下,行顯色、顯影、定形約2 min,獲取數(shù)值,試驗重復(fù)3次。內(nèi)參為GAPDH。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗、t檢驗、配對t檢驗、F檢驗。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學(xué)觀察 如圖1所示,對照組皮膚組織表皮構(gòu)造清晰完整,細胞整齊排列且緊密,胞質(zhì)均勻、紅染,細胞核的形態(tài)正常;模型組創(chuàng)面組織復(fù)層扁平的上皮層顯著增厚,細胞核崩解固縮,表皮層的細胞發(fā)生壞死,壞死的區(qū)域呈現(xiàn)較多的炎性細胞浸潤,真皮層大量膠原纖維壞死;Ilizarov技術(shù)組真皮層膠原纖維的壞死區(qū)域可呈現(xiàn)纖維細胞的增生與淋巴細胞浸潤,有生成新的毛細血管,皮下肌層能清楚顯示,細胞核的形態(tài)正常,與模型組相比,病理損傷顯著改善。

圖1 各組皮膚組織學(xué)觀察(HE染色,×400)

2.2各組治療后創(chuàng)面愈合率及創(chuàng)面平均愈合時長對比 如表1所示,與對照組比較,模型組、Ilizarov技術(shù)組的創(chuàng)面平均愈合時長增加,創(chuàng)面愈合率下降,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,Ilizarov技術(shù)組的創(chuàng)面平均愈合時長降低,創(chuàng)面愈合率升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組治療后創(chuàng)面愈合率及創(chuàng)面平均愈合時長、血清炎癥因子、創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白水平對比

2.3各組血清炎癥因子表達對比 如表1所示,與對照組對比,模型組、Ilizarov技術(shù)組IL-6、CRP、TNF-α表達升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組對比,Ilizarov技術(shù)組的IL-6、CRP、TNF-α表達下降,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.4各組創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白水平對比 如表1、圖2所示,與對照組對比,模型組、Ilizarov技術(shù)組創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表達降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組對比,Ilizarov技術(shù)組創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表達升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 Western印跡檢測各組HIF-1α/VEGF信號通路蛋白

3 討 論

糖尿病足潰瘍的中位愈合時長約12 w,與截肢的風(fēng)險密切相關(guān)〔9,10〕。部分的新生血管生成下降及外周血流下降為造成糖尿病患者傷口難以愈合的主要因素,又因營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的轉(zhuǎn)移能力較差,較多的微血管疾病會延緩膠原蛋白生成、細胞浸潤、肉芽組織生成等〔11,12〕。

修復(fù)或重建糖尿病足潰瘍功能異常的血管為治療糖尿病足潰瘍的重點,而Ilizarov技術(shù)在進行脛骨橫向骨搬移時,因持續(xù)性進行牽引可有效促進細胞增殖與生物合成,骨窗周圍有較豐富的血管網(wǎng)出現(xiàn),進而促使下肢微循環(huán)再生血管或加快周圍神經(jīng)的改善及改善下肢血管的側(cè)支微循,以有效治療糖尿病足潰瘍引起的缺血閉塞〔13,14〕。研究顯示〔15〕,術(shù)后脛骨橫向骨搬移方法可有效改善糖尿病足潰瘍的創(chuàng)面愈合狀況,以更好地促使患肢血管及神經(jīng)的再生,建立缺血肢體的側(cè)支微循環(huán)。本文研究發(fā)現(xiàn),通過Ilizarov技術(shù)治療糖尿病足潰瘍可有效加快創(chuàng)面的修復(fù),減緩IL-6、TNF-α、CRP水平,加快病情改善,與其他學(xué)者研究相似〔16,17〕。本文表明,糖尿病足潰瘍患者通過接受Ilizarov技術(shù)進行治療效果較佳,可更好地促進創(chuàng)面愈合,降低炎癥因子水平。

研究表示〔18,19〕,新生血管生成損傷的潛在機制為誘導(dǎo)缺氧的VEGF水平下降,這是因HIF-1α的反向激活所導(dǎo)致的。這種變化是通過高糖暴露下降了HIF-1α與其共激活因子p300進行結(jié)合,活性氧簇(ROS)對甲基乙二醛進行誘導(dǎo)對p300予以修飾而造成,而高血糖經(jīng)干擾HIF-1α的平穩(wěn)性,進而減緩HIF-1α及其下游基因的VEGF水平〔20〕。因此,HIF-1α/VEGF信號通路功能損傷可作為是糖尿病足潰瘍患者血管形成損害及傷口延遲愈合的重要原因。本研究顯示,通過Ilizarov技術(shù)治療糖尿病足潰瘍可有效對HIF-1α/VEGF信號通路的表達水平進行調(diào)節(jié),以改善病情,在糖尿病足潰瘍中HIF-1α、VEGF水平呈低表達,經(jīng)治療后HIF-1α、VEGF水平能有效進行緩和,與其他學(xué)者研究較一致〔21,22〕。HIF-1α/VEGF信號通路可作為Ilizarov技術(shù)治療糖尿病足潰瘍疾病的主要靶點,提升創(chuàng)面愈合效果,緩減炎癥反應(yīng)。綜上所述,使用Ilizarov技術(shù)可對糖尿病足潰瘍癥狀進行干預(yù),療效明顯,以發(fā)揮出緩和創(chuàng)面壞死組織,提高創(chuàng)面愈合率,降低炎癥因子水平的作用,改善病情,其作用機制可能與調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF信號通路蛋白的表達有密切的聯(lián)系。