秦玉春 蔡林再 謝景臣 鄺向東

(海南西部中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,海南 儋州 571700)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)病率、死亡率較高,且具有惡性程度高、侵襲性強(qiáng)的特點(diǎn),目前主要治療方法是放療、手術(shù)和化療,但患者的預(yù)后仍不理想〔1,2〕。因此,亟待深入研究NSCLC病理機(jī)制以指導(dǎo)臨床治療。研究表明,長(zhǎng)非編碼RNA(LncRNA)為人類(lèi)多種癌癥的潛在治療靶點(diǎn),其中LncRNA CDKN2BAS與多種惡性腫瘤相關(guān)。研究表明,LncRNA CDKN2BAS可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移,也可通過(guò)miR-153-5p/Rho GTP酶激活蛋白(ARHGAP)18信號(hào)軸促進(jìn)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移,與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良相關(guān),亦能靶向微小RNA-98-5p抑制骨肉瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為〔3～5〕。但是LncRNA CDKN2BAS對(duì)肺癌細(xì)胞是否具有類(lèi)似作用及作用機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道。miR-627-3p在肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),LncRNA RP11-284F21.9通過(guò)調(diào)節(jié)miR-627-3p促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲〔6〕。盡管已有相關(guān)研究報(bào)道m(xù)iR-627-3p在肺癌中的表達(dá),但LncRNA CDKN2BAS是否與其相關(guān)目前仍不明確。本文采用LncBase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)LncRNA CDKN2BAS與miR-627-3p間的關(guān)系,體外實(shí)驗(yàn)研究LncRNA CDKN2BAS對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取2017年1月至2019年1月于海南西部中心醫(yī)院肺癌患者42例,手術(shù)收集原發(fā)腫瘤組織及癌旁組織,患者均知情且同意,手術(shù)切除后立即將樣本保存在-80 ℃。其中男25例,女17例;年齡30～60歲,平均(43.14±6.78)歲;病理分型：腺癌30例,鱗癌12例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例,未轉(zhuǎn)移19例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2材料 人正常肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B和肺癌細(xì)胞系NCI-H1299、NCI-H2170、PNCI-H1975(中科院上海細(xì)胞庫(kù)),DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司),Trziol、反轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(寶日醫(yī)生物),引物合成(上海生工),噻唑藍(lán)(MTT)、膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)凋亡檢測(cè)試劑盒(上海晶抗生物),RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(上海研謹(jǐn)生物),si-NC、si-LncRNA CDKN2BAS、miR-NC、miR-627-3p、anti-miR-NC、anti-miR-627-3p(上海吉瑪制藥),pcDNA、pcDNA-LncRNA CDKN2BAS(上海索寶生物),Lipofectamine2000(美國(guó)Invitrogen)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將NCI-H1299細(xì)胞接種于6孔板(1×105/ml),分為si-NC組、si-LncRNA CDKN2BAS組、miR-627-3p組和miR-NC組,分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-LncRNA CDKN2BAS、miR-627-3p,miR-NC組的NCI-H1299細(xì)胞不做任何處理,另設(shè)si-LncRNA CDKN2BAS+anti-miR-NC組和si-LncRNA CDKN2BAS+miR-627-3p組,分別轉(zhuǎn)染si-LncRNA CDKN2BAS+anti-miR-NC和si-LncRNA CDKN2BAS+miR-627-3p,轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量(RT-q)PCR實(shí)驗(yàn) Trizol法分別提取臨床收集組織及各組細(xì)胞總RNA,檢測(cè)純度和濃度并定量,并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,配制PCR擴(kuò)增體系,在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,獲取各組細(xì)胞Ct值,LncRNA CDKN2BAS、miR-627-3p的內(nèi)參分別為GAPDH、U6,各組細(xì)胞中LncRNA CDKN2BAS和miR-627-3p的mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞接種6孔板,每孔約為1×103,按照源靶距15 cm給予用不同劑量X線照射(0、2、4、6、8 Gy),繼續(xù)培養(yǎng)14 d左右至肉眼可見(jiàn)明顯集落形成,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細(xì)胞,經(jīng)多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色后,顯微鏡下計(jì)數(shù)集落數(shù)(細(xì)胞數(shù)>50個(gè)),計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)和放射生物學(xué)參數(shù)。

1.6MTT實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞接種于96孔板(2.5×103/ml),繼續(xù)培養(yǎng)48 h,加MTT 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,去除上清,加二甲基亞砜150 μl,震蕩孵育5 min,檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的各組細(xì)胞吸光度A值(OD450)。

1.7流式細(xì)胞術(shù) 收集各組細(xì)胞,PBS沖洗2次,按試劑盒說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)試劑后,37 ℃反應(yīng)20 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.8Western印跡實(shí)驗(yàn) 提取細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行蛋白定量,95 ℃水浴變性,制備電泳分離膠、濃縮膠,每個(gè)電泳槽上樣60 μg,常規(guī)電泳、電轉(zhuǎn)后,蛋白條帶用5%脫脂牛奶封閉2 h,孵育一抗稀釋液(1∶800),4 ℃過(guò)夜,室溫孵育二抗稀釋液2 h(1∶2 000),以β-actin為內(nèi)參,化學(xué)發(fā)光顯色,凝膠系統(tǒng)成像后分析條帶灰度值,計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.9雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 根據(jù)LncRNA CDKN2BAS與miR-627-3p的結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體,將NCI-H1299細(xì)胞分為4組,分別轉(zhuǎn)染LncRNA CDKN2BAS野生型(WT)熒光素酶表達(dá)載體+miR-NC,LncRNA CDKN2BASWT熒光素酶表達(dá)載體+miR-627-3p和LncRNA CDKN2BAS突變型(MUT)熒光素酶表達(dá)載體+miR-NC,LncRNA CDKN2BASMUT熒光素酶表達(dá)載體+miR-627-3p,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,檢測(cè)熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1臨床收集組織中LncRNACDKN2BAS、miR-627-3p表達(dá)情況 與癌旁組織(1.00±0.16)比較,肺癌組織中LncRNA CDKN2BAS mRNA相對(duì)表達(dá)量(3.28±0.37)顯著上調(diào)(t=36.655,P<0.001);肺癌組織miR-627-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.45±0.06)較癌旁組織(1.00±0.13)顯著下調(diào)(t=24.895,P<0.001)。

2.2在肺癌細(xì)胞系中LncRNA CDKN2BAS和miR-627-3p表達(dá) 與BEAS-2B細(xì)胞比較,其余各組細(xì)胞中LncRNA CDKN2BAS mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào),miR-627-3p顯著下調(diào)(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 在肺癌細(xì)胞系中LncRNA CDKN2BAS和miR-627-3pmRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3低表達(dá)LncRNA CDKN2BAS對(duì)NCI-H1299細(xì)胞的影響 與si-NC組相比,si-LncRNA CDKN2BAS組LncRNA CDKN2BAS mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào),CyclinD1蛋白表達(dá)水平明顯降低,Cleaved-caspase-3和γ-H2AX蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率明顯升高,細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05);以不同劑量(0、2、4、6、8 Gy)照射N(xiāo)C組、si-NC組、si-LncRNA CDKN2BAS組NCI-H1299細(xì)胞,細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)呈劑量依賴(lài)性降低,且si-LncRNA CDKN2BAS組低于si-NC組(P<0.05),見(jiàn)圖1、圖2、表2。單擊多靶模型參數(shù)見(jiàn)表3。

1～7：NC組、si-NC組、si-LncRNA CDKN2BAS組、miR-NC組、miR-627-3p組、si-LncRNA CDKN2BAS+anti-miR-NC組、si-LncRNA CDKN2BAS+anti-miR-627-3p組圖1 各組細(xì)胞CyclinD1、Cleaved-caspase-3、γ-H2AX蛋白表達(dá)

圖2 低表達(dá)LncRNA CDKN2BAS及高表達(dá)miR-627-3p對(duì)NCI-H1299細(xì)胞凋亡的影響

表2 低表達(dá)LncRNA CDKN2BAS對(duì)肺癌細(xì)胞NCI-H1299增殖、凋亡和放射敏感性的影響

表3 低表達(dá)LncRNA CDKN2BAS對(duì)NCI-H1299細(xì)胞放射敏感性的影響

2.4高表達(dá)miR-627-3p對(duì)肺癌細(xì)胞NCI-H1299的影響 與miR-NC組相比,miR-627-3p組miR-627-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào),CyclinD1蛋白表達(dá)明顯降低,Cleaved-caspase-3、γ-H2AX蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡率明顯升高,細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05);細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)呈劑量依賴(lài)性降低,miR-627-3p組低于miR-NC組(P<0.05),見(jiàn)圖1、圖2、表4。放射敏感性相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表5。

表4 高表達(dá)miR-627-3p對(duì)NCI-H1299細(xì)胞的影響

表5 高表達(dá)miR-627-3p對(duì)NCI-H1299細(xì)胞放射敏感性的影響

2.5LncRNA CDKN2BAS 靶向miR-627-3p,調(diào)控miR-627-3p的表達(dá) LncRNA CDKN2BAS與miR-627-3p互補(bǔ)的核苷酸序列見(jiàn)圖3。與轉(zhuǎn)染miR-NC的LncRNA CDKN2BAS-WT比較,轉(zhuǎn)染miR-627-3p的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表6。比較各組miR-627-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量,pcDNA-LncRNA CDKN2BAS組明顯低于pcDNA組,si-LncRNA CDKN2BAS組則高于si-NC組(P<0.05),見(jiàn)表7。

表6 miR-NC或miR-627-3p與LncRNA CDKN2BAS-WT及MUT報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染NCI-H1299細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)

表7 RT-qPCR檢測(cè)各組miR-627-3p 的表達(dá)

2.6下調(diào)miR-627-3p能夠逆轉(zhuǎn)LncRNA CDKN2BAS低表達(dá)對(duì)NCI-H1299細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響 與si-LncRNA CDKN2BAS+anti-miR-NC組比較,si-LncRNA CDKN2BAS+anti-miR-627-3p組miR-627-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào),CyclinD1蛋白水平和細(xì)胞活力明顯升高,Cleaved-caspase-3和γ-H2AX蛋白水平和細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05);細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)呈照射劑量依賴(lài)性降低,且si-LncRNA CDKN2BAS+anti-miR-627-3p組顯著高于si-LncRNA CDKN2BAS+anti-miR-NC組(P<0.05),見(jiàn)圖1、圖4、表8。單擊多靶模型參數(shù)見(jiàn)表9。

1,2：si-LncRNA CDKN2BAS+anti-miR-NC組、si-LncRNA CDKN2BAS+anti-miR-627-3p組圖4 下調(diào)miR-627-3p 能夠逆轉(zhuǎn)LncRNA CDKN2BAS低表達(dá)對(duì)NCI-H1299細(xì)胞凋亡的影響

表8 下調(diào)miR-627-3p 能夠逆轉(zhuǎn)LncRNA CDKN2BAS低表達(dá)對(duì)NCI-H1299細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性的影響

表9 下調(diào)miR-627-3p 能夠逆轉(zhuǎn)LncRNA CDKN2BAS低表達(dá)對(duì)NCI-H1299細(xì)胞放射敏感性的影響

3 討 論

眾多研究表明,LncRNA異常表達(dá)與肺癌細(xì)胞的惡性表型有關(guān)。如過(guò)表達(dá)LncRNA鋅指蛋白674反義RNA(ZNF674-AS)1抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、集落形成和腫瘤發(fā)生,并伴隨細(xì)胞周期阻滯〔7〕。LncRNA叉頭框轉(zhuǎn)錄因子D3反義RNA(FOXD3-AS)1低表達(dá)與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性和腫瘤分級(jí)較高密切相關(guān),上調(diào)FOXD3-AS1可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲,下調(diào)其表達(dá)則效果相反〔8〕。LINC01089可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔9〕。高表達(dá)LncRNA TPTEP1對(duì)NSCLC表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用〔10〕。Lnc-THOR與胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)2 mRNA結(jié)合蛋白結(jié)合后可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖〔11〕。LncRNA H19在抗輻射N(xiāo)SCLC細(xì)胞中高表達(dá),敲除LncRNA H19可提高NSCLC細(xì)胞對(duì)X射線和碳離子照射的敏感性〔12〕。敲除LncRNA PKMYT1AR可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和異種移植瘤形成能力〔13〕。體內(nèi)敲除LINC01296可抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移并促進(jìn)其凋亡〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相似,提示低表達(dá)LncRNA CDKN2BAS可降低NCI-H1299細(xì)胞的增殖能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡和提高放射敏感性。

研究表明,LncRNA CDKN2BAS可作為ceRNA負(fù)調(diào)控腫瘤相關(guān)miR表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)生〔4,5〕。研究表明,miR-627-3p可在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮抑癌基因作用。下調(diào)miR-627-3p表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,而其過(guò)表達(dá)則具有相反效果〔15〕。miR-627-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)下降,低表達(dá)miR-627-3p與食管鱗狀細(xì)胞癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),不利于預(yù)后,通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-627-3p能調(diào)控食管鱗狀癌細(xì)胞遷移、侵襲〔16〕。本研究與上述研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,miR-627-3p調(diào)控NSCLC細(xì)胞增殖、凋亡和放射敏感性,且靶向干擾miR-627-3p表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)低表達(dá)LncRNA CDKN2BAS對(duì)NSCLC細(xì)胞的影響,表明LncRNA CDKN2BAS可靶向miR-627-3p調(diào)控NSCLC細(xì)胞的增殖、凋亡和放射敏感性。

綜上,LncRNA CDKN2BAS在肺癌組織中表達(dá)上調(diào),靶向miR-627-3p調(diào)控NCI-H1299細(xì)胞的增殖、凋亡和放射敏感性,具有成為治療肺癌的新靶點(diǎn)的潛力,本研究的局限性在于僅進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn),未來(lái)將開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。