張婷婷 王靜 張茂全 王雅楠

(青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院(青島市中醫(yī)醫(yī)院) 1風(fēng)濕免疫科,山東 青島 266034;2骨關(guān)節(jié)與創(chuàng)傷外科中心;3藥劑科)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎多發(fā)于小關(guān)節(jié),以對稱性分布為主,能夠引發(fā)關(guān)節(jié)畸形、腫脹、脫位,并累及其他組織臟器,促進(jìn)心血管疾病、惡性腫瘤等疾病的發(fā)生與發(fā)展〔1〕。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以關(guān)節(jié)軟組織及骨組織破壞為主要病理改變,免疫功能異常和炎癥因子大量釋放破壞骨關(guān)節(jié)是主要發(fā)病機(jī)制〔2〕。由于年齡對免疫系統(tǒng)和性激素分泌的影響,老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病急,活動性較高,癥狀多樣、不典型,大關(guān)節(jié)受累比例較高〔3〕。臨床研究發(fā)現(xiàn),老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)外表現(xiàn)較多,患病2年內(nèi)骨侵蝕的發(fā)生率較高〔4〕;因此探索評估該類患者治療預(yù)后的血清學(xué)指標(biāo)對治療方案的選擇和療效監(jiān)測具有重要意義。本研究探討老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者免疫球蛋白(Ig)G、IgM、IgA、類風(fēng)濕因子、甘露糖凝集素(MBL)、長鏈非編碼RNA(LncRNA)MEG3水平變化及意義。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2020年3月至2022年2月間青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院收治的老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者54例為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2018年中華內(nèi)科雜志發(fā)表的中國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診治指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn);②年齡≥60歲,近3個月無激素、免疫調(diào)節(jié)藥治療史;③理解、溝通能力正常,自愿配合本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重感染性疾病,內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的患者;②有關(guān)節(jié)嚴(yán)重外傷史的患者。其中男21例,女33例;年齡61～76歲,平均(66.47±4.25)歲。病程0.6～4.2年,平均(2.63±0.81)年;首發(fā)癥狀：小關(guān)節(jié)腫痛28例,負(fù)重關(guān)節(jié)腫痛26例。收集同期志愿者36例為健康對照組,均無重要系統(tǒng)、臟器慢性病,男14例,女22例,年齡60～70例,平均(65.60±4.18)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn),受試者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 IgG、IgM、IgA免疫比濁檢測試劑盒購于上?？迫A生物工程有限公司;類風(fēng)濕因子乳膠凝集檢測試劑盒購于康知(杭州)生物科技有限公司;酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于深圳生科源生物有限公司;Trizol提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒購于研卉(上海)生物科技有限公司;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑盒購于上海海方生物有限公司。

1.3血清IgG、IgM、IgA、類風(fēng)濕因子、MBL水平檢測 采集老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和健康志愿者空腹外周靜脈血5 ml,4 ℃恒溫離心10 min,收集血清,-20 ℃保存待測。免疫比濁法檢測血清IgG、IgM、IgA水平。乳膠凝集法檢測血清類風(fēng)濕因子表達(dá)水平,根據(jù)試劑盒說明書將類風(fēng)濕因子濃度>20 IU/ml判斷為陽性。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清MBL水平。

1.4實時熒光(RT)-PCR檢測血清LncRNA MEG3表達(dá)水平 采集老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和健康志愿者空腹外周靜脈血3 ml,4 ℃恒溫離心10 min,收集血清,Trizol法從血清中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,按照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。LncRNA MEG3上游引物5′-GTCATCGTACGAGTAAAGGGTCTTCGCT-3′,下游5′-CTACCGGGATGCACCCCGTTTCCTGCACG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物片段131 bp。內(nèi)參GAPDH上游引物5′-TGGCGGCTTAGCCTTGGCGACTCAC-3′,下游5′-CACAATCCTTTCGGACTCCGTCGG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物片段176 bp;引物設(shè)計由上海捷瑞生物工程有限公司完成。PCR條件：95 ℃變性30 s,62 ℃ 變性40 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參計算LncRNA MEG3相對表達(dá)量。

1.5標(biāo)準(zhǔn)化治療后療效判定 老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者均給予標(biāo)準(zhǔn)化治療,包括：非甾體抗炎藥、免疫抑制劑等個體化藥物治療方案,功能鍛煉,患者教育等。治療后使用28個關(guān)節(jié)疾病活動度評分(DAS28)判定老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的療效,關(guān)節(jié)包括雙側(cè)手腕、肩部、肘、膝關(guān)節(jié),雙手指近端骨關(guān)節(jié),手掌指關(guān)節(jié)。參照PREVOO的計算方法計算28個關(guān)節(jié)的壓痛數(shù)、腫脹數(shù),根據(jù)治療預(yù)后分為：活動期組(DAS28>2.6分),緩解期組(DAS28≤2.6分)。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行t檢驗、χ2檢驗、Logistic回歸分析,免疫球蛋白、類風(fēng)濕因子、MBL、LncRNA MEG3對老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后的評估價值進(jìn)行受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組IgG、IgM、IgA水平比較 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組血清IgG、IgM、IgA水平明顯高于健康對照組(P<0.01)。見表1。

表1 兩組IgG、IgM、IgA水平、類風(fēng)濕因子陽性率及MBL、LncRNA MEG3表達(dá)水平比較

2.2兩組類風(fēng)濕因子陽性率及MBL、LncRNA MEG3表達(dá)水平比較 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組類風(fēng)濕因子陽性率明顯高于健康對照組,血清MBL、LncRNA MEG3水平明顯低于健康對照組(P<0.01)。見表1。

2.3治療后不同療效的老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者IgG、IgM、IgA水平比較 老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者治療后活動期組血清IgG、IgM、IgA水平明顯高于緩解期組(P<0.01)。見表2。

表2 治療后不同療效的老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者IgG、IgM、IgA、類風(fēng)濕因子、MBL、LncRNA MEG3水平比較

2.4治療后不同療效的老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者類風(fēng)濕因子、MBL、LncRNA MEG3水平比較 老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者治療后活動期組類風(fēng)濕因子陽性率明顯高于緩解期組,血清MBL、LncRNA MEG3水平明顯低于緩解期組(P<0.01)。見表2。

2.5老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析 將老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者治療預(yù)后情況作為因變量(0=緩解期,1=活動期),將IgG、IgM、IgA及類風(fēng)濕因子陽性率、MBL、LncRNA MEG3表達(dá)水平作為自變量,具體賦值情況為：類風(fēng)濕因子表達(dá)為分類變量(1=陽性,0=陰性),其余各自變量為連續(xù)變量。經(jīng)多因素Logistic回歸性分析顯示,IgG、IgM、IgA及類風(fēng)濕因子陽性率、MBL、LncRNA MEG3表達(dá)水平是老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后的獨立影響因素。見表3。

表3 老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.6IgG、IgM、IgA、類風(fēng)濕因子、MBL、LncRNA MEG3對老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后的評估價值 ROC曲線結(jié)果顯示,IgG、IgM、IgA及類風(fēng)濕因子陽性率、MBL、LncRNA MEG3表達(dá)水平對老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后均具有較高的評估價值(P<0.01)。將IgG、IgM、IgA及類風(fēng)濕因子陽性率、MBL、LncRNA MEG3納入Logistic回歸模型,得出各指標(biāo)聯(lián)合的數(shù)值計算公式,結(jié)果顯示各指標(biāo)聯(lián)合檢測的評估價值最高〔曲線下面積(AUC)=0.940〕,敏感度、陽性預(yù)測值均明顯高于各指標(biāo)單獨檢測。見表4、圖1。

圖1 IgG、IgM、IgA、類風(fēng)濕因子、MBL、LncRNA MEG3對老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后評估價值的ROC曲線

3 討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病率存在地理區(qū)域上有較大差異,全球發(fā)病率為0.50%～1.00%,中國發(fā)病率為0.46%〔5〕。目前我國關(guān)于老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病率的相關(guān)數(shù)據(jù)較少;國外研究顯示,過去10年期間,日本在快速老齡化趨勢下類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病年齡明顯增加〔6〕;美國近15年期間類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病率在65～75歲人群中最高,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎累積風(fēng)險在60歲左右快速上升〔7〕。受年齡、合并基礎(chǔ)病較多、免疫功能下降等因素影響,老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者起病急,癥狀多樣且偏重,預(yù)后不良發(fā)生率高〔8〕;因此探尋能夠準(zhǔn)確評估患者治療預(yù)后的血清學(xué)指標(biāo),對治療方案的合理選擇和療效監(jiān)測具有重要意義。IgG是人體血清Ig的主要成分,占70%～75%,以單體形式存在,是初級免疫應(yīng)答最持久的抗體〔9〕?？乖碳ふT導(dǎo)體液免疫過程中IgM是最先生成的Ig,參與人體的早期防御〔10〕。IgA分為血清型、分泌型,其中血清型IgA能夠介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用,分泌型IgA參與構(gòu)成人體黏膜防御系統(tǒng)〔11〕。本研究結(jié)果提示,老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者IgG、IgM、IgA高表達(dá),且經(jīng)有效治療后其表達(dá)水平明顯下降。

類風(fēng)濕因子是一種抗人、抗動物IgG分子片段抗原決定簇抗體,在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中高表達(dá),可作為診斷指標(biāo)之一〔12〕;但類風(fēng)濕因子在部分慢性感染性疾病、惡性腫瘤患者中表達(dá)水平也升高,因此單獨檢測的診斷特異性不理想,應(yīng)聯(lián)合其他指標(biāo)〔13〕。MBL是肝臟合成并分泌的急性時相期蛋白,可通過與病原微生物表面糖基配體結(jié)合,調(diào)節(jié)吞噬作用〔14〕;還可經(jīng)凝集素途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng),參與天然免疫防御〔15〕。LncRNA MEG3在多種人體腫瘤組織中通過調(diào)控基因缺失、啟動子超甲基化等發(fā)揮抑癌作用〔16〕。研究發(fā)現(xiàn),類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中LncRNA MEG3低表達(dá),通過白細(xì)胞介素-1β上調(diào)LncRNA MEG3表達(dá)后能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖,抑制軟骨細(xì)胞凋亡和胞外基質(zhì)降解〔17〕。本研究結(jié)果提示,老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者類風(fēng)濕因子高表達(dá),血清MBL、LncRNA MEG3低表達(dá),經(jīng)有效治療后能降低類風(fēng)濕因子表達(dá),升高血清MBL、LncRNA MEG3表達(dá)。

綜上,IgG、IgM、IgA及類風(fēng)濕因子陽性率、MBL、LncRNA MEG3表達(dá)水平是老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后的獨立影響因素,且上述指標(biāo)對老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者預(yù)后均具有較高的評估價值,各指標(biāo)聯(lián)合檢測的評估價值最高,可用于老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床診治。