李子騰 袁江 李鵬 馮凱

(1濱州醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院,山東 煙臺 264003;2濱州市人民醫(yī)院胸外科)

肺腺癌是男性和女性肺癌患者中最普遍的組織學(xué)亞型,占肺癌總數(shù)的35%～40%,近年來發(fā)病率顯著上升,尤其在女性中增長迅速,已超過鱗癌成為最常見的病理型〔1〕。在一些北歐國家,女性患者的肺腺癌發(fā)病率已超過男性。肺腺癌的轉(zhuǎn)移與侵襲能力是臨床分期的重要依據(jù)。腫瘤的轉(zhuǎn)移由一系列連續(xù)、相互關(guān)聯(lián)的步驟組成,多個(gè)基因與環(huán)節(jié)牽涉其中,其中腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸與腫瘤細(xì)胞對缺氧環(huán)境的適應(yīng)在轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。c-Myc作為一種原癌基因,在許多腫瘤中過表達(dá),與女性乳腺癌關(guān)系密切〔2〕,在肺腺癌中亦有表達(dá)〔3〕。c-Myc可增強(qiáng)程序性死亡配體(PD-L)1表達(dá),使免疫系統(tǒng)喪失對腫瘤細(xì)胞的監(jiān)管〔4〕。并參與營造實(shí)體腫瘤細(xì)胞微環(huán)境缺氧狀態(tài),調(diào)控碳酸酐酶(CA)Ⅸ表達(dá)升高,誘導(dǎo)癌細(xì)胞在缺氧環(huán)境中的適應(yīng)性變化〔5〕。全基因組分析研究表明,數(shù)千個(gè)基因表達(dá)可能直接受c-Myc調(diào)控〔6〕。PD-L1、CAⅨ是c-Myc的下游因子。但c-Myc與其下游因子在肺腺癌中的研究尚不充分。本實(shí)驗(yàn)擬分析c-Myc、PD-L1、CAⅨ在肺腺癌組織與良性肺組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)及臨床意義。

1 材料與方法

1.1材料 選取濱州市人民醫(yī)院于2021年1月至2022年12月因外科手術(shù)切除或活檢的肺腺癌病理標(biāo)本52例,所有患者術(shù)前沒有接受任何治療且病理診斷明確。另設(shè)20例良性肺組織(經(jīng)病理證實(shí))為對照組,以上標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定,石蠟包埋。其中肺腺癌患者中位年齡65歲;根據(jù)第8版AJCC腫瘤分期手冊嚴(yán)格分期,該研究已得到所在單位倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.2相關(guān)試劑 兔抗人c-Myc、兔抗人PD-L1、鼠抗人CAⅨ購自基因科技(上海)股份有限公司,檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、Maxvison檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化法,標(biāo)本切片4 μm,經(jīng)烘烤,脫蠟,水化后進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù),封閉內(nèi)源性過氧化氫酶后,滴加一抗?jié)窈兄? ℃過夜。次日棄掉一抗,滴加二抗,并用DAB染色,蘇木素復(fù)染、組織脫水、石蠟透明。以已知陽性的切片作為陽性對照,磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.4結(jié)果判定 c-Myc蛋白以細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標(biāo)記,CAⅨ蛋白主要定位在細(xì)胞膜,陽性者可觀察到胞膜染色為棕黃色,結(jié)果判讀采用半定量積分法,按每張切片著色深淺及陽性細(xì)胞比例進(jìn)行判斷,染色陽性程度：無染色0分,淺黃色1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;陽性細(xì)胞百分比：<5%為0分,5%～24%1分,25%～50%為2分,>50%為3分。兩個(gè)定量數(shù)字相乘,總分值<2為陰性,≥2為陽性。PD-L1蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜,陽性者可見細(xì)胞膜棕黃色染色。采用腫瘤比例評分(TPS),PD-L1表達(dá)陰性者TPS<1%,PD-L1表達(dá)陽性者TPS≥1%,其中TPS≥50%為PD-L1強(qiáng)陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Spearman檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1c-Myc在肺腺癌與良性肺組織中的表達(dá) 肺腺癌組織c-Myc陽性表達(dá)23例(44.23%),在良性組織中表達(dá)3例(15.00%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.350,P=0.021)。不同臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。c-Myc在不同性別、不同年齡、有無吸煙史、不同腫瘤分化程度中無明顯差異,見表1。

表1 c-Myc、PD-L1、CAⅨ陽性表達(dá)與肺腺癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性〔n(%)〕

2.2PD-L1在肺腺癌與良性肺組織中的表達(dá) 肺腺癌組織PD-L1陽性表達(dá)19例(36.54%),在良性組織中無表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.927,P=0.002)。有無吸煙、不同腫瘤分化程度陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PD-L1在不同性別、不同年齡、不同TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中無明顯差異(P>0.05),見表1。

2.3CAⅨ在肺腺癌與良性肺組織中的表達(dá) 肺腺癌組織CAⅨ陽性表達(dá)14例(26.92%),在良性組織中無表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.684,P=0.010)。不同腫瘤分化程度陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CAⅨ在不同性別、不同年齡、有無吸煙史、不同TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中無明顯差異,見表1。

2.4c-Myc、PD-L1、CAⅨ三者在肺腺癌中表達(dá)相關(guān)性 c-Myc與PD-L1、CAⅨ(r=0.691、0.594)、PD-L1與CAⅨ均呈正相關(guān)(r=0.710,均P<0.05)。

3 討 論

肺癌患者生存時(shí)間與其臨床診斷發(fā)現(xiàn)的早晚密切相關(guān)。雖然低劑量螺旋CT的普及及人群健康意識的提高對早期發(fā)現(xiàn)、改善預(yù)后、降低肺癌死亡率意義重大,我國肺癌年齡標(biāo)化5年生存率略有上升,但仍不超過20%,總體5年生存率仍偏低〔7〕,這主要是因?yàn)橹袊伟┗颊咧?0%是Ⅲ～Ⅳ期患者〔8〕。研究肺腺癌的分子機(jī)制,探究有助于肺腺癌診治與預(yù)后判斷的分子位點(diǎn),對進(jìn)一步提高肺腺癌的治愈率、降低死亡率等方面有重大意義。

原癌基因c-Myc屬于骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因Myc家族,作為一種原癌基因調(diào)節(jié)多種在腫瘤中至關(guān)重要的基因表達(dá)〔9〕。c-Myc可以通過調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá),增強(qiáng)腫瘤對機(jī)體免疫應(yīng)答的抑制作用。Xu等〔10〕發(fā)現(xiàn)肝癌中PD-L1在翻譯階段受到c-Myc的調(diào)節(jié),增強(qiáng)PD-1/PD-L1介導(dǎo)的免疫逃逸,在c-Myc依賴的腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔11〕;Casey等〔12〕研究顯示,無論體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn),c-Myc失活均會導(dǎo)致PD-L1 mRNA水平和蛋白質(zhì)水平及免疫熒光快速下調(diào)。PD-L1的下調(diào)增強(qiáng)了抗腫瘤免疫反應(yīng),腫瘤生長停止。

c-Myc還參與癌細(xì)胞的代謝重編程〔13〕,可直接激活多個(gè)糖酵解及谷氨酰胺分解代謝相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而直接促成癌細(xì)胞的Warburg 效應(yīng)(有氧糖酵解),誘導(dǎo)代謝重編程以促進(jìn)腫瘤發(fā)生〔14〕。而糖酵解的酸性代謝產(chǎn)物造成的細(xì)胞內(nèi)酸化又進(jìn)一步刺激了CAⅨ表達(dá)〔15〕。CAⅨ是一種跨膜二聚體鋅金屬酶,在癌細(xì)胞的pH調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,使這些細(xì)胞能夠適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的不利條件〔16〕。Hua等〔17〕研究發(fā)現(xiàn),在非小細(xì)胞肺癌中c-Myc可通過上調(diào)長非編碼RNA LINC01123促進(jìn)腫瘤增殖與有氧糖酵解;Yang等〔18〕發(fā)現(xiàn)在胰腺導(dǎo)管腺癌中糖酵解的活化使CAⅨ的表達(dá)上調(diào)。

同時(shí),缺氧環(huán)境對腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸存在促進(jìn)作用〔19〕。Karimi等〔20〕通過研究缺氧條件下培養(yǎng)的腦膜瘤細(xì)胞,利用免疫組化法發(fā)現(xiàn)PD-L1與CAⅨ的表達(dá)具有相關(guān)性;Brooks等〔21〕研究發(fā)現(xiàn),在頭頸癌中腫瘤微環(huán)境缺氧激活HIF信號傳導(dǎo),CAⅨ表達(dá)增加,并上調(diào)PD-L1等免疫細(xì)胞抑制配體的表達(dá)。Koh等〔22〕在一項(xiàng)基于免疫組織化學(xué)和RNA測序數(shù)據(jù)的研究中發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白和mRNA的表達(dá)與CAⅨ的表達(dá)顯著相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肺腺癌中c-Myc表達(dá)水平升高,繼而增加PD-L1、CAⅨ等基因的表達(dá)參與腫瘤的免疫逃逸、腫瘤細(xì)胞糖酵解代謝等過程,促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。聯(lián)合檢測這3個(gè)指標(biāo)可能有助于患者預(yù)后的評估。雖然直接靶向c-Myc存在困難,但間接靶向c-Myc是治療肺腺癌的研究方向之一,本研究提示選擇性抑制c-Myc下游因子的表達(dá)聯(lián)合抗PD-L1免疫療法可作為一種治療肺腺癌的新策略。