韋明月，郭孝文，邱嘉鑫，宋怡穎，柴乖強，2，段義忠，2

（1.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 陜西榆林 719000； 2.陜西省陜北礦區(qū)生態(tài)修復(fù)重點實驗室 陜西榆林 719000）

植物表皮是植物體與其所處的環(huán)境直接接觸的部位，包括角質(zhì)層和蠟質(zhì)層[1-2]。其中，植物表皮蠟質(zhì)是覆蓋在陸生植物表面的一層透明晶狀體，是一種不溶于水的有機混合物，其主要成分由烷烴、脂肪酸、醛、初級醇、次級醇、酯類等組成。研究表明，植物表皮蠟質(zhì)具有調(diào)節(jié)植物非氣孔性水分散失、抵御病蟲害等功能[3-4]，因此，在植物抵抗生物、非生物脅迫中發(fā)揮著越來越重要的作用。不同植物表皮蠟質(zhì)的化學(xué)成分不同，使得植物表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)存在一定的多樣性[5]。Barthlott 等[6]借助電鏡對10 000 多種植物的表皮進行了掃描分析，將植物表皮蠟質(zhì)晶體歸納為片狀、板片狀、柱狀、條狀、管狀、顆粒狀、光滑狀等。擬南芥莖稈蠟質(zhì)晶體為柱狀[7]，小麥、水稻苗期葉片蠟質(zhì)形態(tài)以片狀為主[8-9]，番茄葉片蠟質(zhì)呈現(xiàn)出光滑狀[10]；即使同一種植物的不同器官，其蠟質(zhì)晶體也存在差異，如小麥旗葉正面和反面的蠟紙晶體分別呈現(xiàn)出片狀和密集的管狀[11]。

對擬南芥表皮蠟質(zhì)合成途徑的研究表明，擬南芥蠟質(zhì)合成主要分為在質(zhì)體內(nèi)的從頭合成、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上超長鏈脂肪酸的合成以及在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蠟質(zhì)合成[12]。其中，超長鏈脂肪酸的合成是在頭合成形成16 碳和18 碳的脂酰CoA 的基礎(chǔ)上，再經(jīng)過碳鏈的延長形成各種碳鏈長度的脂酰CoA，此過程需要碳鏈延長酶（fatty acid elongase）的催化；而控制脂肪酸碳鏈延長的酶是一個包括多種酶的復(fù)合體，至少需要4 種酶參與脂肪酸碳鏈延長反應(yīng)，共同完成超長鏈脂肪酸的合成[13]。其中，β-酮脂酰輔酶A 合成酶（KCS）是脂肪酸碳鏈延長酶復(fù)合體催化反應(yīng)中第一步反應(yīng)的酶，也是整個超長鏈脂肪酸延長合成中的限速酶，因此，鑒定并研究KCS 的功能對植物表皮蠟質(zhì)合成與調(diào)控機制的解析具有重要意義[14-15]。

KCS 主要存在于植物體中，其種類和數(shù)量在不同物種間存在較大差異。模式植物擬南芥和水稻中分別有21 個和34 個KCS基因[16-17]。目前對KCS基因家族的研究主要集中在擬南芥上，如FAE1是首個從擬南芥中克隆出的KCS基因，該基因主要在種子中表達，催化C20 和C22 脂肪酸的生物合成[18]；CER6/CUT1 參與鏈長大于24 個碳以上的脂肪酸合成，并促進莖和花粉的表皮蠟質(zhì)積累[19]。此外，在其他植物如甘藍型油菜、小麥、水稻和紫花苜蓿中都已經(jīng)克隆了KCS相關(guān)基因[20]。

黃瓜為主要的蔬菜作物，其葉片以及果實表皮具有較厚的蠟質(zhì)，但當前對于黃瓜表皮蠟質(zhì)合成相關(guān)研究的報道還較少。王世峰[21]研究了CsCER10在黃瓜中的表達模式，并利用RNAi 技術(shù)解析了其在蠟質(zhì)合成中的功能。王文嬌[22]從黃瓜中分離克隆了CsCER1和CsWAX2，并利用轉(zhuǎn)基因等方法，闡明了黃瓜中CsCER1和CsWAX2基因表達量異常影響了黃瓜表皮蠟質(zhì)中的烷烴含量。此后，黃瓜蠟質(zhì)合成相關(guān)基因CsCER4、CsCER7也相繼被克隆出來[23-24]。Zhang 等[25]在黃瓜中鑒定了1 個AP2/ERF型轉(zhuǎn)錄因子CsWIN1，研究表明，CsWIN1通過調(diào)控CsCER1、CsCER1-1、CsCER4等的表達促進蠟質(zhì)的積累。最近，Zhai 等[26]通過圖位克隆首次明確了調(diào)控黃瓜果實亮度的關(guān)鍵基因D，該基因編碼一種C2H2類型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，并通過一系列生理試驗及轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，D基因通過調(diào)控黃瓜果實表皮角質(zhì)層的發(fā)育來影響果實亮度。此外，Yang 等[27]也通過圖位克隆的方法獲得了調(diào)控黃瓜亮度的主效基因CsZFP6，發(fā)現(xiàn)該基因能通過與CsMAH1、CsCER1等共表達，參與黃瓜果皮蠟質(zhì)的合成。

筆者的研究擬通過分析黃瓜轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)庫，鑒定黃瓜β-酮脂酰輔酶A 合成酶KCS，克隆黃瓜CsKCS11基因，并利用生物信息學(xué)分析、轉(zhuǎn)基因功能驗證和干旱脅迫下的表達分析等方法解析CsKCS11的生物功能，以期為黃瓜遺傳育種和品種改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃瓜品種全興優(yōu)冠F1是抗病耐高溫材料，由山東寧陽金興種業(yè)有限公司培育，種植在榆林市榆林學(xué)院西區(qū)種植園區(qū)玻璃日光溫室，生育期內(nèi)水肥管理同溫室其他植物。待黃瓜幼苗生長6～8 周時，取黃瓜幼嫩葉片樣品，置于液氮中保存?zhèn)溆?。黃瓜表皮蠟質(zhì)合成基因CsKCS11轉(zhuǎn)化載體 pCX‐SN-CsKCS11由榆林學(xué)院植物資源化利用及生態(tài)修復(fù)課題組構(gòu)建，詳見圖1。試驗于2020 年7 月至2022 年3 月在榆林學(xué)院植物分子遺傳育種實驗室進行。

圖1 植物過表達載體pCXSN-CsKCS11Fig.1 The construction of pCXSN-CsKCS11 overexpression vector

1.2 方法

1.2.1 黃瓜葉片總RNA 的提取和cDNA 的合成從溫室中取黃瓜葉片用無菌錫箔紙包裹住葉片置于液氮中，在液氮超低溫環(huán)境中保存，提取RNA時，在研缽中加入液氮，將黃瓜葉片研磨至粉末狀，利用多糖多酚RNA 試劑盒（全式金）提取RNA，提

XcmIXcmI取過程嚴格按照說明書進行。RNA 的完整性通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成cDNA 第一鏈的合成，并于-20℃保存。

1.2.2 黃瓜CsKCS11基因的克隆 根據(jù)實驗室前期構(gòu)建的黃瓜葉片和果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過植物蠟質(zhì)合成通路及注釋分析，從中發(fā)現(xiàn)了在黃瓜葉片及果皮中表達量均較高的一條KCS序列，并依據(jù)開放閱讀框，設(shè)計特異引物F1：CATCGCAAT‐GGGAAATGACGGAG 和 R1： GATCTTG‐GCACCCCAAATTAGAGA。以稀釋15 倍的cDNA為模板，擴增CsKCS11基因，擴增體系為50 μL：2×Pfu Mix buffer 25 μL，dNTP 4 μL，引物F、R 各2 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 16.5 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃60 s；95 ℃50 s，53 ℃40 s，72 ℃60 s，35個循環(huán)；72 ℃5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后回收目標基因片段。將目標基因片段末端加A 后，連接到EZ-T 載體，并轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素（100 mg·L-1）的LB 固體培養(yǎng)基上篩選出陽性克隆，通過菌落PCR 鑒定陽性克隆[28]。最后挑選出至少3 個陽性克隆，送至上海生物工程有限公司測序，篩選出正確的CsKCS11基因序列。

1.2.3 黃瓜CsKCS11基因的生物信息學(xué)分析 分別 通 過ProtScale analysis（https://web.expasy.org/）、NPSA- Prabi （https://npsa- prabi.ibcp.fr/） 、SWISS- MODEL（http://swissmodel.expasy.org/inter‐active）在線分析軟件對CsKCS11 蛋白的親疏水性、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。同時分別運用DNAMAN 和MEGA7.0 分析CsKCS11 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和物種親緣關(guān)系。

1.2.4 植物遺傳表達載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 利用高保真酶從測序成功的質(zhì)粒上擴增CsKCS11目標片段，并對該片段末端進行加A處理；同時，使用XcmI 對pCXSN進行單酶切，回收大片段載體，將pCXSN與末端加過A 的CsKCS11進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10 感受態(tài)細胞，并在LB 固體培養(yǎng)基（含有卡那霉素100 mg·L-1）上培養(yǎng)出菌落，對單克隆進行PCR 篩選鑒定[29-30]。挑選至少3 個陽性單克隆，送至上海生物工程有限公司測序。測序驗證成功后，提取pCXSN-CsKCS11質(zhì)粒，并借助農(nóng)桿菌GV3101 采用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥[31]。在1/2MS 培養(yǎng)基（潮霉素質(zhì)量濃度為50 mg·L-1）上對T1和T2代轉(zhuǎn)化單株的擬南芥種子進行篩選、鑒定，獲得轉(zhuǎn)CsKCS11的T3代純合株系，最后進行干旱脅迫處理，處理方法如下[32]：將T3代種子播于營養(yǎng)基質(zhì)中，放于光照培養(yǎng)箱中（14 h（L）/10 h（D）光周期，光照度8000 lx，溫度22 ℃，相對濕度50%～55%）生長約4 周，再進行控水15 d 處理，待大多數(shù)葉片萎蔫并開始變黃時，進行復(fù)水處理10 d。最后統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因株系和對照的成活率。每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)選用32 株植株。

1.2.5 黃瓜CsKCS11在干旱脅迫下的表達分析選取約108 粒飽滿的黃瓜種子，用0.55%的NaClO溶液消毒，在玻璃溫室中播種于花盆內(nèi)，正常澆水。待黃瓜苗長至5 葉期時，將黃瓜苗從基質(zhì)中輕輕挖出，小心沖洗掉根上的基質(zhì)，進行逆境脅迫處理[33-34]。干旱處理：取108 株幼苗，每4 株為1 個重復(fù)，用漂浮板固定好，將其漂浮在含有10%的PEG 6000 溶液中處理96 h。處理完成后，剪取葉片，轉(zhuǎn)入無RNAase 的離心管中，液氮速凍。每個處理設(shè)3 次重復(fù)。樣品RNA 的抽提按照國產(chǎn)君諾德RNA提取試劑盒進行，提取出黃瓜葉片總RNA 后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選取黃瓜CsACTIN為內(nèi)參基因（表1），以相應(yīng)的cDNA 為模板，選用TaKaRa 的SYBR?Premix ExTaqTMII 試劑盒，采用CFX96TM Real-Time PCR Detection System 進行qRT-PCR 擴增，并進行表達量分析，分析方法參考所用儀器說明[32]。每個處理設(shè)3 次重復(fù)。數(shù)據(jù)分析按照2-ΔΔCt法計算[35]。

表1 基因表達分析所使用的引物Table 1 List of primers used for qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2016 和SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用SigmaPlot 12.5 完成作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜KCS相關(guān)基因的鑒定

利用課題組前期建立的黃瓜果實與葉片轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，通過通路和表達分析，鑒定出黃瓜CsKCS相關(guān)序列39 個（圖2），其中目標序列Cs‐Gy1G019580.1 在黃瓜果實和葉片中均有較高的表達水平，因此選其作為目標基因，命名為CsKCS11，并進行后續(xù)的克隆與功能分析。

圖2 黃瓜CsKCS 相關(guān)基因的熱圖分析Fig.2 Heat map analysis of CsKCS-related genes in cucumber

2.2 黃瓜CsKCS11基因的克隆

提取黃瓜葉片總RNA（圖3-A），并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以稀釋15 倍的cDNA 為模板，進行PCR 擴增，獲得了一條長度約為1500 bp 的特異條帶（圖3-B）。將產(chǎn)物回收后，連接測序載體、轉(zhuǎn)化DH5α細胞，經(jīng)過篩選獲得陽性單克?。▓D3-C），選取陽性克隆經(jīng)測序驗證后，將目標序列提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫中（登錄號為：OL660537），同時將該基因命名為CsKCS11，其開放閱讀框（ORF）大小為1542 bp，編碼513 個氨基酸。

圖3 黃瓜CsKCS11 的克隆Fig.3 CsKCS11 Cloning of cucumber

2.3 黃瓜CsKCS11的生物信息學(xué)分析

通過在線分析數(shù)據(jù)庫ProtScale analysis 對基因編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)以及物理性質(zhì)進行了分析，預(yù)測出黃瓜CsKCS11編碼513 個氨基酸，其中亮氨酸數(shù)量最高，占總氨基酸含量的12.3%，蛋白分子質(zhì)量為57.76 kDa，理論等電點為9.26。由此可知，該序列編碼蛋白CsKCS11 為堿性蛋白。CsKCS11編碼的氨基酸化學(xué)分子式為C2609H4125N85O734S29，原子總數(shù)為7582 個。對CsKCS11 蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測表明，CsKCS11 蛋白主要由44.64%的α-螺旋、35.48%無規(guī)則卷曲、4.68%的β-轉(zhuǎn)角和15.20%的延伸鏈組成（圖4-A～B）。對CsKCS11 蛋白質(zhì)的親疏水性進行預(yù)測（圖4-C），該蛋白質(zhì)親疏水性平均值（Gravy）為-0.083，說明黃瓜CsKCS11 蛋白屬于親水性蛋白。

圖4 黃瓜CsKCS11 蛋白的結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Protein structural analysis of CsKCS11 in cucumber

利用DNAMAN 軟件將黃瓜CsKCS11 氨基酸序列與NCBI 中已登錄的冬瓜（Benincasa hispi‐da）、蘋果（Malus domestica）、擬南芥（Arabidop‐sis thaliana）、甜瓜（Cucumis melo）、南瓜（Cucurbi‐ta moschata）和筍瓜（Cucurbita maxima）等植物氨基酸序列進行多重序列比對。結(jié)果表明，不同物種中KCS 蛋白在保守區(qū)域具有高度的同源性，同源性高達91.14%（圖5-A）。同時，通過MEGA 7.0 軟件構(gòu)建了不同植物KCS11 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)不同植物的KCS11 蛋白主要分為4 個分支，其中月季、蘋果和歐李的KCS11 聚為第一類；柑橘和榴蓮的KCS11 聚為第二類；棗樹的KCS11 單獨聚為第三類；黃瓜的KCS11 與冬瓜、甜瓜、南瓜、筍瓜和苦瓜的KCS11 聚為第四類，且黃瓜與冬瓜的KCS11 的親緣關(guān)系最近（圖5-B）。

2.4 黃瓜CsKCS11在擬南芥中的表達分析

為了進一步研究CsKCS11的生物功能，構(gòu)建了CsKCS11過表達載體pCXSN-CsKCS11，并將基因CsKCS11轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，同時結(jié)合熒光定量PCR 檢測，最終獲得轉(zhuǎn)CsKCS11基因擬南芥株系。在T3代選擇1 個轉(zhuǎn)基因株系Line1，進行干旱脅迫處理，并鑒定其表型，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)CsKCS11基因擬南芥株系在干旱15 d 并復(fù)水10 d后，其成活率極顯著高于野生型（圖6-A～C），初步證明了CsKCS11在擬南芥中具備抵御干旱脅迫的能力。

2.5 黃瓜CsKCS11在干旱脅迫下的表達分析

為了研究CsKCS11在干旱脅迫下的表達模式，用10% PEG6000 干旱模擬處理黃瓜幼苗96 h。分別在0、1、2、4、6、12、24、48、96 h 采集干旱脅迫處理后的黃瓜葉片提取出RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后應(yīng)用熒光定量PCR 檢測CsKCS11在黃瓜中的表達量。熒光定量PCR 結(jié)果表明，CsKCS11能夠被干旱脅迫誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)表達程度存在一定差異（圖7），隨著干旱脅迫時間的延長，其表達量呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，在干旱脅迫12 h 時表達量達到最高值，并且顯著高于其他處理。

圖7 CsKCS11 在黃瓜苗期干旱脅迫下的表達分析Fig.7 CsKCS11 expression analysis under drought stress in seedling of cucumber

3 討論與結(jié)論

隨著全球氣候的逐年變化，干旱、高溫、低溫、高鹽等生物脅迫也隨之頻繁發(fā)生，這些極端環(huán)境造成的滲透脅迫直接影響著植物生長發(fā)育和產(chǎn)量[36]。黃瓜為主要的設(shè)施蔬菜作物，在我國的年種植面積超過6000 萬hm2，而我國一半以上的地區(qū)屬于干旱半干旱地區(qū)，嚴重缺水直接影響著蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此培育抗旱黃瓜新品種已經(jīng)成為一項迫切的工作[37]。黃瓜葉片和果實表皮含有大量的蠟質(zhì)晶體，其中果皮表皮蠟質(zhì)的主要成分有超長鏈烷烴、脂肪酸、脂肪醛、次級醇和酯類化合物等，并以超長鏈烷烴含量最高。同時，筆者在本試驗前期發(fā)現(xiàn)（結(jié)果未發(fā)表），黃瓜果皮蠟質(zhì)總含量隨著果實發(fā)育進程呈現(xiàn)出逐漸增高的趨勢。因此本試驗前期通過分析黃瓜果實和成熟葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)蠟質(zhì)合成通路信息和基因注釋結(jié)果，鑒定了39 個β-酮脂酰輔酶A 合成酶KCS 相關(guān)基因，并根據(jù)熱圖分析發(fā)現(xiàn)序列CsGy1G019580.1 在黃瓜果實2 個不同的發(fā)育階段均具有較高的表達量，結(jié)合該序列的功能注釋信息，將其命名為CsKCS11。同源比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，黃瓜CsKCS11與其他物種的KCS11具有相似的結(jié)構(gòu)，可能都參與超長鏈脂肪酸的生物合成。這與Yang 等[38]在柑橘表皮中發(fā)現(xiàn)的KCS11的研究結(jié)果相似。

植物的抗逆性是基因與外界環(huán)境相互作用的結(jié)果，為了提高植物的抗旱性，科學(xué)家們選擇將抗旱相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入植物中，獲得過量表達的轉(zhuǎn)基因株系，最終應(yīng)用于生產(chǎn)實踐[39]。轉(zhuǎn)基因植物之所以能表現(xiàn)出較強的抗逆特性，是因為當植物受到生物或非生物脅迫時，這些應(yīng)激反應(yīng)基因會迅速表達，應(yīng)激相關(guān)蛋白隨后與下游的靶蛋白相互作用，以減緩植物體內(nèi)活性氧的積累，維持細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，最終增強植物對不利環(huán)境的耐受性[40]。柴乖強[4]研究表明，在干旱脅迫條件下，小麥葉片表皮蠟質(zhì)含量顯著增高，并且蠟質(zhì)含量越高植株的抗旱能力也越強。因此，如何提高植物表皮蠟質(zhì)含量已經(jīng)成為當前研究的熱點之一。其中，在植物表皮蠟質(zhì)合成基因的應(yīng)用方面，已經(jīng)有許多基因被克隆出來，并且通過轉(zhuǎn)基因過表達、轉(zhuǎn)基因敲除或編輯技術(shù)，一部分基因的生物學(xué)功能已經(jīng)明晰。為了研究黃瓜CsKCS11的功能，筆者克隆了CsKCS11基因并將其連接到pCXSN 表達載體上，成功構(gòu)建了pCX‐SN-CsKCS11過表達載體，同時利用農(nóng)桿菌浸花法將CsKCS11轉(zhuǎn)入擬南芥中，通過后代篩選，成功獲得了T3代轉(zhuǎn)CsKCS11擬南芥純合株系，并對轉(zhuǎn)基因T3代植株進行了干旱脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CsKCS11的擬南芥植株具備了較強的抗旱能力，初步驗證了CsKCS11的生物學(xué)功能。這與Chai 等[30]在番茄中過表達小麥蠟質(zhì)合成基因TaFAR6和Ta‐FAR8的結(jié)果相同，進一步說明了在干旱脅迫下，植物表皮蠟質(zhì)的增加能增強植物對干旱脅迫的抵御能力。然而，黃瓜CsKCS11基因調(diào)控表皮蠟質(zhì)合成進而參與植物抵抗干旱脅迫的機制還有待深入研究。

植物體內(nèi)一些蠟質(zhì)合成相關(guān)基因?qū)ν饨绮煌{迫會作出迅速響應(yīng)。在本試驗中，筆者對黃瓜CsKCS11在干旱脅迫下的表達量進行了分析，結(jié)果表明CsKCS11能對持續(xù)干旱脅迫作出響應(yīng)，這與Li 等[41]的結(jié)論相似，而與Cheng 等[42]研究的結(jié)論不同，這可能與研究的植物類型以及植物的生長環(huán)境有關(guān)。綜上所述，筆者從黃瓜中克隆出一個CsKCS11基因，為進一步研究黃瓜抗旱特性，并且從分子水平上驗證其生物學(xué)功能和抗旱新品種培育提供了新的思路。此外，本試驗中獲得了轉(zhuǎn)CsKCS11擬南芥植株，CsKCS11是否通過調(diào)控蠟質(zhì)的合成途徑而提高擬南芥的抗旱能力，還有待進一步通過測定表皮蠟質(zhì)含量進行研究。

筆者從黃瓜中克隆了CsKCS11基因，并結(jié)合干旱脅迫下的表達分析和遺傳轉(zhuǎn)化等方法，研究了該基因的生物學(xué)功能，結(jié)果表明，黃瓜CsKCS11轉(zhuǎn)基因擬南芥后代植株具有抵御干旱脅迫的功能，為進一步闡明黃瓜CsKCS11參與蠟質(zhì)合成的機制提供了研究基礎(chǔ)。