劉莉銘，彭 斌，康保珊，吳會杰，劉 茜，古勤生

（1.河南省果樹瓜類生物學重點實驗室·中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所 鄭州 450009；2.中國農業(yè)科學院中原研究中心 鄭州 450009）

西 瓜 花 葉 病 毒（watermelon mosaic virus，WMV）屬于馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus），主要分布在溫帶和地中海地區(qū)，自然條件下通過蚜蟲以非持久性方式進行傳播，也可通過機械方式進行傳播。該病毒寄主范圍廣泛，可侵染西瓜、甜瓜等多種葫蘆科作物，也可侵染胡蘿卜[1]、刺槐[2]、芝麻[3]、甜椒[4]、蘭花[5]、百香果[5]、人參[6]、臭椿[7]、紫薇[8]、蜀葵[9]等作物，主要引起植株矮化、葉片花葉和畸形，影響作物的商品性。

WMV 是一種單鏈正義RNA 病毒，基因組全長約為10 kb，編碼一個多聚蛋白，該蛋白可被自身編碼的蛋白酶識別，切割成10 個成熟蛋白P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb 和CP，在P3 編碼區(qū)由轉錄滑動機制產生第11 個蛋白P3N-PIPO[10]?；赑1、NIb-CP 和CP 的N 端核苷酸序列，WMV 分成經典組（CL）、組2（G2）和新興組（EM）。CL 組包含法國流行的經典分離物，EM組包含法國東南部新發(fā)生的在西葫蘆上引起嚴重癥狀的分離物，G2 組分離物無特殊生物學性狀，來自世界不同地區(qū)[11-12]。研究顯示，該病毒基因組不同區(qū)域的分子變異性有所差異，且基因組內存在大量的重組斷裂點[4，13-17]，進行系統(tǒng)進化分析時有必要獲得病毒的全基因組序列。

病毒侵染性克隆的獲得使得研究RNA 病毒實現了在DNA 水平上進行各種分子操作，近年來，病毒侵染性克隆應用越來越廣泛[18-21]。前期中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組（本團隊）從西葫蘆發(fā)病植株上分離得到WMV分離物CH99/69[22]，在此基礎上，筆者擬通過擴增獲得該分離物的全基因組序列，并進行全基因組序列分析，同時通過構建它的全長cDNA 克隆，分析其在不同瓜類作物上的侵染性，為在瓜類作物上開展該病毒的致病和抗病相關的工作奠定基礎?？紤]到目前已有WMV 其他分離物侵染性克隆成功構建的報道[23-25]，該克隆的獲得也將有助于開展不同分離物之間分子變異性、致病性和適應性的聯合分析，以更好地揭示WMV 分子進化機制，為控制該病毒導致的病害探索新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2021 年4—9 月在中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所進行。供試WMV 分離物CH99/69來源于西葫蘆發(fā)病植株，由中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組鑒定和保存。植物表達載體pXT1 由南京農業(yè)大學陶小榮教授饋贈。

1.2 方法

1.2.1 載體構建 取約0.1 g 西葫蘆發(fā)病葉片，利用RNAsimple 總RNA 提取試劑盒和PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 提取葉片總RNA和合成cDNA，具體操作參照試劑盒說明書。從GenBank 數據庫中下載并比對分析WMV 的全基因組序列，根據序列的保守性，設計5 對引物HF-W-1F/W-1R、W-2F/W-2R、W-3F/W-3R、W-4F/W-4R、W-5F/HF-W-5R（表1），以合成的cDNA 為模板，將分離物CH99/69 的全基因組分成5 段進行擴增，隨后利用NEBuilder 高保真DNA 組裝預混液將擴增獲得的5 個PCR 產物與經StuI 和SmaI 雙酶切處理的植物表達載體pXT1 進行同源重組、轉化、菌液PCR 篩選、測序驗證，最終獲得含有CH99/69全基因組的cDNA 克隆pWMV-CH99。1.2.2 序列分析 對pWMV-CH99 進行測序、拼接，獲得CH99/69 分離物的全基因組序列。從Gen‐Bank 數據庫中下載38 條來自不同國家的WMV 分離物全基因組序列，利用ClustalW 軟件將它們與CH99/69 分離物進行序列比對，再用BioEdit 軟件對它們進行全基因組核苷酸和氨基酸序列一致性分析[26]。以大豆花葉病毒（soybean mosaic virus，SMV，NC_002634）為外組，基于以上WMV 分離物的全基因組核苷酸序列，利用Mega X 軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）進行系統(tǒng)進化分析[27]，1000 次重復。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.3 接種試驗 試驗于2021 年6—8 月在中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組溫室進行。其中，甜瓜品種為白玫，由新疆農業(yè)科學院哈密瓜研究中心提供；西瓜品種為紅和平，種子購自浙江浙農種業(yè)有限公司；西葫蘆品種為珍玉358，種子購自河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司；瓠瓜品種為親抗水瓜，種子購自湖南雪峰種業(yè)有限公司。將pWMV-CH99 轉入農桿菌菌株GV3101 中，隨后進行培養(yǎng)、接種，將pWMV-CH99轉入農桿菌菌株GV3101 中，隨后進行培養(yǎng)、接種，將pWMV-CH99 利用農桿菌介導的方法接種甜瓜、西瓜、西葫蘆和瓠瓜植株，并將發(fā)病葉片進行摩擦接種分析，具體方法參照劉莉銘等[28]的報道。采集系統(tǒng)發(fā)病葉片，以W-8674F/W-10047R 為引物（擴增的目的片段為1374 bp），利用HiScript? II One Step RT-PCR Kit（Dye Plus）對病毒的侵染情況進行檢測分析。另外，以W-9399F/W-T7-9782R 為引物，對CH99/69 基因組9399～9782 nt 區(qū)域進行擴增，經體外轉錄合成地高辛標記的RNA 探針，利用dot blot 方法檢測植株葉片中WMV 的侵染情況。

2 結果與分析

2.1 WMV分離物CH99/69基因組結構分析

CH99/69 分離物基因組全長為10 047 nt，它的5′UTR 和3′UTR 分別對應基因組的1～132 nt 和9796～10 047 nt，全基因組編碼1 個由3220 個氨基酸組成的多聚蛋白（133～9795 nt），經蛋白酶切割，形成10 個成熟的蛋白質，同時P3 編碼區(qū)內部通過+2 移碼產生PIPO，它可與P3 的N 端融合表達形成P3N-PIPO 蛋白，其基因組結構如圖1 所示，GenBank 登錄號為MN296125。

圖1 WMV 分離物CH99/69 的基因組結構示意圖Fig.1 Schematic representation of WMV isolate CH99/69 genome organization

2.2 分離物CH99/69序列分析

序列一致性分析結果（表2）顯示，不同WMV分離物之間的全基因組核苷酸、多聚蛋白核苷酸和多聚蛋白氨基酸序列一致性分別為81.10%～99.70%、81.10%～99.80%、87.20%～99.80%，分離物CH99/69 與這些分離物的序列一致性分別為81.40% ～94.80% 、81.40% ～94.70% 、88.40% ～97.20%。其中，CH99/69 與中國烏魯木齊的火參果分離物Urumqi（MW345911）的序列一致性最高，分別為94.80%、94.70%、97.20%，與中國陜西的西葫蘆分離物WMV-WS（KX664483）一致性次之，與中國遼寧的臭椿分離物WMV-GZca（MF418043）一致性最低。

表2 WMV 分離物CH99/69 與其他分離物全基因組核苷酸和氨基酸的序列一致性Table 2 The identity of nucleotide sequences and amino acid sequences of complete genome between WMV isolate CH99/69 and other isolates %

基于WMV 全基因組序列的系統(tǒng)進化分析結果顯示，供試39 個WMV 分離物可以分為4 組，本研究獲得的CH99/69 分離物與來自中國烏魯木齊的火參果分離物Urumqi（MW345911）、中國陜西的西葫蘆分離物WMV-WS（KX664483）和法國的西葫蘆分離物WMV-Fr（AY437609）親緣關系較近，它們均聚于Ⅰ組中，而與中國的人參分離物WMV-Pg（KX926428） 、臭 椿 分 離 物 WMV- GZca（MF418043）、蜀葵分離物hollyhock（MK217416）親緣關系最遠（圖2）。

圖2 基于全基因組序列的WMV 分離物系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of WMV isolates based on complete genome sequence

2.3 分離物CH99/69全長cDNA克隆的侵染性

將CH99/69 的cDNA 克隆pWMV-CH99 利用農桿菌介導的方法接種甜瓜、西瓜、西葫蘆和瓠瓜植株。接種后1 周左右，甜瓜、西葫蘆和瓠瓜接種植株開始產生脈帶、花葉或褪綠斑點，接種后2 周左右，西瓜接種植株開始產生花葉、卷葉癥狀（圖3-A）。隨著接種時間的延長，甜瓜和西瓜發(fā)病植株癥狀逐漸加重，葉片嚴重花葉、卷葉或畸形，植株矮化。PCR 檢測和dot blot 檢測證實發(fā)病植株確實被WMV 所侵染（圖3-B～C）。將甜瓜發(fā)病葉片通過摩擦方式接種以上4 種瓜類作物，發(fā)現在接種1～2 周內所有接種植株也均可發(fā)病。以上研究說明分離物CH99/69 的侵染性克隆構建成功，該克隆在4 種供試瓜類作物上均可系統(tǒng)侵染并引起典型的花葉癥狀。

圖3 WMV 分離物CH99/69 cDNA 克隆的侵染性Fig.3 Infectivity of WMV isolate CH99/69 cDNA clone

3 討論與結論

本團隊前期基于WMV CP 基因的序列對分離物CH99/69 進行了初步的系統(tǒng)進化分析，發(fā)現該病毒不同分離物之間具有一定的地理特異性，且CH99/69 與中國分離物WMV-CHN 親緣關系較近[22]。筆者的研究基于WMV 的全基因組序列對其進一步進行了進化分析，發(fā)現在中國分離物中，CH99/69 與Urumqi 和WMV-WS 親緣關系較近，與WMV-CHN 親緣關系稍遠，與WMV-Pg、hollyhock和WMV-GZca 親緣關系更遠，且來自其他國家（如法國、意大利、韓國和美國）的不同分離物在進化上也有一定的分化，說明WMV 分離物與地域差異不完全相關，該結果與前期結果[22]有所不同，而與Pozzi等、韓 盛 等[15，29]的 報 道 一 致。分 離 物CH99/69 與WMV-CHN、Urumqi 和WMV-WS 之間的序列比對結果顯示，CH99/69 與WMV-CHN 的CP 蛋白氨基酸序列一致性（98.90%）介于CH99/69 與WMV-WS 和Urumqi 的一致性（96.80%、99.20%）之間，而CH99/69和WMV-CHN 的全基因組核苷酸、多聚蛋白核苷酸和多聚蛋白氨基酸的序列一致性均低于與WMV-WS 和Urumqi CH99/69 的一致性，而這與CH99/69 和WMV-CHN 之 間 其 他 區(qū) 域 如P3、CI、NIa-VPg、NIa-Pro 和NIb 的差異有關，該差異將導致基于CP部分序列和全基因組序列進行的系統(tǒng)進化分析結果會有所不同。因此，為了彌補基于病毒部分序列進行分析的局限性，有必要獲得WMV 不同分離物的全基因組序列，并基于全基因組序列進行系統(tǒng)序列分析。

WMV 寄主范圍較為廣泛，既可侵染葫蘆科作物，也可侵染多種非葫蘆科作物[1-9]。任春梅等[30]分析了江蘇省葫蘆科作物WMV 的分子變異特征，發(fā)現各分離物與寄主之間的相關性不明顯，而Niu等[31]對來自世界各地的WMV 分離物進行了分析，發(fā)現不同分離物與其寄主有一定的相關性。筆者的研究對來自6 種葫蘆科作物（西葫蘆、甜瓜、西瓜、黃瓜、火參果、刺果瓜）、5 種非葫蘆科作物（紫薇、百香果、人參、臭椿、蜀葵）的39 個WMV 分離物進行了分析，發(fā)現來自同一寄主的不同分離物雖然可能分布在不同分支上，但來自葫蘆科作物的所有分離物均聚集于Ⅰ～Ⅲ組中，來自非葫蘆科作物的分離物均聚集于Ⅱ組和Ⅳ組中，且西葫蘆分離物主要分布在Ⅰ組中，西瓜分離物僅分布在Ⅱ、Ⅲ組中，說明WMV 分離物與寄主之間具有一定的相關性，與Niu 等[31]的結果一致。

在WMV 侵染性克隆構建方面，目前已有較多報道，Desbiez 等[23]通過酵母重組、添加內含子的方法獲得了WMV-FMF00-LL1 和WMV-FMF00-LL2兩個分離物的侵染性克隆，該克隆經基因槍接種，成功侵染西葫蘆。Aragonés 等[24]構建了弱毒株分離物Vera 的侵染性克隆，并通過農桿菌接種使其成功侵染甜瓜，引起較弱的癥狀。Moya-Ruiz 等[25]利用同源重組方法構建了MeWM7 分離物的侵染性克隆，經農桿菌接種，成功侵染甜瓜、西瓜、黃瓜、南瓜和西葫蘆。筆者則利用同源重組方法構建了CH99/69 分離物的侵染性克隆，經農桿菌接種，成功侵染甜瓜、西瓜、西葫蘆和瓠瓜。從系統(tǒng)進化分析結果來看，WMV-FMF00-LL1、Vera 和MeWM7 親緣關系較近，均屬于Ⅱ組成員，CH99/69 屬于Ⅰ組成員，與它們親緣關系較遠。已知Vera 為弱毒株，在甜瓜上致病性較弱，通過序列分析發(fā)現，與其他分離物相比，該分離物存在3 個氨基酸差異位點（aa173、aa1231 和aa2226），分別位于P1、P3 和NIa-Pro 區(qū)域，推測這3 個位點與該分離物的弱致病性有關。在此基礎上，可以進一步開展分子變異性、致病性和適應性的聯合分析，以揭示WMV 分子致病機制和進化機制，為該病毒病的防控提供指導。