魏 剛 袁利娟 路建國 劉灃濤 段森森 包國強

(1 陜西中醫(yī)藥大學,陜西省咸陽市 712046; 2 空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院普通外科, 陜西省西安市 710038)

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一。2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示,結直腸癌新發(fā)病例數(shù)占所有癌癥新發(fā)病例數(shù)的10%,結直腸癌死亡病例數(shù)在癌癥相關死亡病例數(shù)中占9.4%[1]。2020年我國結直腸癌新發(fā)病例共555 477例,在全球和我國所有癌癥中分別位列第1、第2,死亡病例數(shù)共286 162例,在全球和我國分別位列第1、第5[2-3]。深入研究結直腸癌的發(fā)病機制對預防結直腸癌的發(fā)生及降低患者病死率尤為重要。目前有關結腸癌發(fā)病機制的研究主要以人結腸癌細胞系作為研究對象,或是采用結腸癌細胞系建立動物模型,而直接采用人正常結腸上皮細胞建立惡性轉化細胞模型的相關研究報告較為罕見。本研究采用永生化的人正常結腸上皮細胞NCM460細胞作為實驗細胞,經(jīng)1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)和佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)多代誘導處理,使其發(fā)生惡性轉化,最終建立結腸癌的惡性轉化細胞模型,旨在為進一步研究結腸癌的發(fā)病機制及治療方法提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 NCM460細胞購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司,MNNG購自Adamas-beta公司(貨號:70-25-7),PMA購自Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司(貨號:16561-29-8),神經(jīng)鈣黏附蛋白(neural-cadherin,N-cadherin)抗體(貨號:bs-20623R)、轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)抗體(貨號:bs-0103R)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)單克隆抗體(貨號:bsm-33140M)購自北京博奧森生物技術有限公司,β-actin抗體(貨號:AF5003)、辣根過氧化物酶-羊抗兔二抗(貨號:A0208)、RIPA裂解液(貨號:P0013B)和二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(貨號:P0012S)均購自上海碧云天生物技術有限公司,ECL化學發(fā)光液(貨號:36222ES60)購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司,酶標儀(型號:iMark)購自BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):使用含1%青-鏈霉素(均為100 U/mL)和10%胎牛血清的DMEM,并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)NCM460細胞。2～3 d傳代一次,取處于對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 惡性轉化細胞模型的建立:取對數(shù)生長期的NCM460細胞,過夜培養(yǎng)后,棄去培養(yǎng)液,用PBS洗滌細胞后加入含50 μg/mL MNNG的DMEM,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)8 h,棄去培養(yǎng)液。用PBS洗去殘留的MNNG后,加入含100 ng/mL PMA的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)液。用PBS洗去殘留的PMA,然后更換為正常DMEM,于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h,按照1 ∶2的比例進行傳代。去除傳代后細胞,按照上述培養(yǎng)方法,反復誘導培養(yǎng),一直培養(yǎng)至30代。

1.2.3 惡性轉化細胞模型的鑒定

1.2.3.1 MTT實驗:取正常NCM460細胞、誘導后的第17代NCM460細胞(下文用NCM460-M-P17細胞表示)和誘導后的第30代NCM460細胞(下文用NCM460-M-P30細胞表示),用胰酶消化細胞,以1 000 r/min離心5 min后棄去上清液,用DMEM將細胞制成單細胞懸液,以每孔1×104個細胞接種于96孔板(每孔200 μL,設3個復孔),于37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后,加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入150 μL二甲基亞砜,室溫震蕩10 min,用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度值,采用GraphPad Prism 8.0繪制細胞增殖曲線。實驗重復3次。

1.2.3.2 細胞克隆形成實驗:取對數(shù)生長期的正常NCM460細胞、NCM460-M-P17細胞和NCM460-M-P30細胞,用胰酶消化細胞后,以1 000 r/min離心5 min,留取細胞沉淀。用DMEM將細胞制成單細胞懸液,按每孔200個細胞接種于6孔板(設3個復孔),將細胞置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)14 d后終止培養(yǎng)。用PBS洗滌細胞3次后,用甲醇固定20 min,再用吉姆薩染液染色15 min,沖洗晾干后在顯微鏡下觀察細胞團,計數(shù)細胞克隆形成數(shù)量。實驗重復3次。

1.2.3.3 細胞劃痕實驗:取對數(shù)生長期的正常NCM460細胞、NCM460-M-P17細胞和NCM460-M-P30細胞,用胰酶消化細胞后,以1 000 r/min離心5 min,留取細胞沉淀,用DMEM將細胞制成單細胞懸液,按每孔200個細胞接種于6孔板(設3個復孔),將細胞置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細胞貼壁融合率達100%時,用20 μL槍頭在細胞培養(yǎng)板底部垂直劃痕,此時兩條線之間的距離記為D0。用PBS洗滌細胞3次后,加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h,然后在鏡下觀察細胞遷移情況。測量培養(yǎng)48 h后兩條線之間的距離D48(細胞48 h遷移距離),計算細胞遷移率。細胞遷移率(%)=(D0-D48)/D0。實驗重復3次。

1.2.4 Western blot 實驗:取對數(shù)生長期的正常NCM460細胞、NCM460-M-P30細胞,用胰酶消化細胞后,以1 000 r/min離心5 min,留取細胞沉淀,加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞蛋白,用二喹啉甲酸法對蛋白樣品進行定量后,每孔上樣20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE,分離蛋白后采用濕轉膜方法將蛋白轉移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉于4 ℃封閉12 h后,加入用TBST稀釋的N-cadherin抗體(1 ∶1 000)、TGF-β1抗體(1 ∶1 000)、EGFR單克隆抗體(1 ∶1 000)及內參β-actin抗體(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜后,用TBST清洗,然后加入經(jīng)TBST稀釋的辣根過氧化物酶-羊抗兔二抗(1 ∶1 000),室溫孵育90 min,用TBST清洗后加入發(fā)光液并立即進行顯影。用ImageJ軟件計算蛋白條帶的灰度值,目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。實驗重復4次。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3種細胞的形態(tài)學變化 鏡下可見正常NCM460細胞呈單層生長,排列有序,形態(tài)為梭形,細胞結構清晰。與正常NCM460細胞比較,NCM460-M-P17細胞形態(tài)無明顯變化,但細胞呈現(xiàn)團塊生長的趨勢;而NCM460-M-P30細胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化,細胞形態(tài)多樣、大小不一,排列紊亂且緊密,呈團塊狀生長,無細胞間接觸抑制或密度抑制,鋪滿培養(yǎng)瓶底后出現(xiàn)重疊生長現(xiàn)象,見圖1。

圖1 3種細胞的形態(tài)學變化

2.2 3種細胞增殖能力的比較 培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,3種細胞的增殖能力差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中,與正常NCM460細胞比較,NCM460-M-P17細胞、NCM460-M-P30細胞的增殖能力增強,且NCM460-M-P30細胞的增殖能力強于NCM460-M-P17細胞(P<0.05),見表1。

表1 培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后3種細胞增殖能力的比較(x±s,吸光度值)

2.3 3種細胞克隆形成能力的比較 與正常NCM460細胞比較,NCM460-M-P17細胞、NCM460-M-P30細胞的克隆形成數(shù)量增多,且NCM460-M-P30細胞的克隆形成數(shù)量多于NCM460-M-P17細胞(P<0.05),見表2。大多數(shù)NCM460-M-P17細胞和NCM460-M-P30細胞的克隆團細胞數(shù)大于50個,見圖2。

表2 3種細胞克隆形成數(shù)量的比較(x±s,個)

圖2 吉姆薩染色觀察細胞克隆形成情況(×10)

2.4 3種細胞遷移能力的比較 劃痕48 h后,鏡下可見NCM460-M-P17細胞、NCM460-M-P30細胞的劃痕處有細胞生長,見圖3。與正常NCM460細胞比較,NCM460-M-P17細胞、NCM460-M-P30細胞的48 h遷移距離增加、遷移率升高,且NCM460-M-P30細胞的48 h遷移距離和遷移率長于或高于NCM460-M-P17細胞(P<0.05),見表3。

表3 3種細胞遷移情況的比較(x±s)

圖3 3種細胞的遷移情況

2.5 正常NCM460細胞與NCM460-M-P30細胞中N-cadherin、EGFR、TGF-β1蛋白表達水平的比較 NCM460-M-P30細胞中N-cadherin、EGFR、TGF-β1的蛋白表達水平高于正常NCM460細胞(P<0.05),見圖4和表4。

表4 正常NCM460細胞與NCM460-M-P30細胞中N-cadherin、EGFR、TGF-β1 蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖4 TGF-β1、EGFR和N-cadherin的蛋白表達條帶圖

3 討 論

惡性轉化細胞模型是指運用外源性因素逐漸改變體外培養(yǎng)細胞的環(huán)境,導致在這種環(huán)境下生長的細胞發(fā)生惡性表型的改變,主要包括細胞形態(tài)、增殖速度、遷移能力及克隆形成能力等方面的改變。由于動物細胞與人類細胞存在種屬差異,兩組免疫機能也不同,所以動物和人類對致癌劑的耐受程度不同,在研究癌變過程中,如果采用動物細胞進行實驗會導致研究結果存在差異。另外,一些促癌劑普遍存在于人類生活環(huán)境,考慮到促癌過程的長期性和可逆性,采用人類細胞深入研究促癌劑促癌的分子作用機制,對于人類腫瘤的發(fā)生機制研究及防治研究具有重要意義。結腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多階段的復雜過程[4]。采用人類細胞進行體外培養(yǎng)及惡性轉化實驗探討結腸癌的發(fā)生機制既能排除免疫系統(tǒng)的干擾,又能更深入地研究長期暴露于致癌物質的細胞在惡性轉化過程中的各種生物學特征變化。

MNNG是一種人工合成的亞硝基化合物,是胃腸道腫瘤的化學致癌物。PMA是一種強促癌劑兼誘導分化劑[5]。本研究聯(lián)合運用MNNG和PMA分階段誘導NCM460細胞8 h和24 h后,再更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,以減輕誘導劑對細胞的毒性損傷,提高細胞的存活率,保證細胞連續(xù)傳代誘導的順利實施。結果顯示,經(jīng)過30代連續(xù)誘導的NCM460細胞呈團塊狀生長,排列紊亂,無細胞間接觸抑制,提示該細胞已表現(xiàn)出惡性轉化細胞的特性[6]。

腫瘤細胞具有無限增殖的特性,本研究的MTT實驗結果顯示,經(jīng)過多代連續(xù)誘導后,NCM460-M-P17細胞、NCM460-M-P30細胞的增殖能力均較正常NCM460細胞明顯提高,且以NCM460-M-P30細胞的增殖能力最強(P<0.05),提示長期生長在含有低濃度MNNG和PMA環(huán)境中的NCM460細胞,其增殖能力會隨促癌劑作用時間的延長而增強。

克隆形成能力是指細胞能夠無限制地分裂并形成一個細胞團的能力。這種能力使得細胞能夠形成腫瘤組織,促進腫瘤的進展。正常細胞由于生長受限,不能無限生長,而腫瘤細胞因失去接觸抑制且具有單克隆生長能力,能夠呈克隆樣生長。因此,細胞在體外培養(yǎng)時形成的克隆樣細胞團是細胞發(fā)生惡性轉化的重要標志[7]。本研究中的克隆形成實驗結果顯示,經(jīng)過MNNG和PMA多代誘導處理的NCM460細胞的克隆形成能力顯著提高。這提示經(jīng)促癌劑長期誘導的NCM460細胞對環(huán)境依賴性降低,適應能力、自主生存能力及克隆形成能力增強,具有惡性轉化的趨勢。

轉移能力是腫瘤細胞的關鍵生物學特征之一,它可以使腫瘤細胞能夠從原發(fā)病灶轉移到其他組織或器官。這種轉移過程是腫瘤進展和復發(fā)的重要原因之一,也是導致腫瘤治療失敗的主要因素。本研究的劃痕實驗結果顯示,NCM460-M-P17細胞及NCM460-M-P30細胞的遷移能力較正常NCM460細胞提高(P<0.05),說明促癌劑可能會導致NCM460細胞遷移能力異常增強,進而使其具有腫瘤細胞的轉移特性。

N-cadherin、TGF-β1、EGFR是最常見的與腫瘤侵襲和遷移有關的分子標志物。本研究結果顯示,與正常NCM460細胞比較,NCM460-M-P30細胞中N-cadherin、TGF-β1和EGFR蛋白表達水平升高,這進一步從分子水平說明了促癌劑長期誘導NCM460細胞可使其發(fā)生惡性轉化。

綜上所述,經(jīng)過MNNG和PMA促癌劑連續(xù)多代誘導處理后,NCM460細胞的生物學功能(增殖、克隆形成和遷移能力)發(fā)生明顯改變,具備惡性細胞的生物學特征。該建模方法為深入研究結腸癌的發(fā)生和發(fā)展機制提供了新思路。但本研究未深入分析MNNG和PMA誘導NCM460細胞惡性轉化的分子機制,也未進行體內轉化細胞實驗,今后需要進一步完善研究內容,以更好地探討結腸癌發(fā)生的分子機制。