胡 冬,莊利東,陳 剛,朱華強,陳 曦△

1.九〇三醫(yī)院醫(yī)學檢驗科,四川綿陽 621700;2.電子科技大學醫(yī)學院附屬綿陽醫(yī)院·綿陽市中心醫(yī)院醫(yī)學檢驗科,四川綿陽 621000

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種臨床表現復雜,?？蓪е氯矶嗥鞴俸投嘞到y(tǒng)受累的自身免疫性疾病[1]。腎臟是SLE中最易受累的器官之一,有研究顯示30%～80%的SLE患者會發(fā)展為狼瘡性腎炎(LN)。即使接受積極治療,仍有10%～30%的LN患者進展到終末期腎病(ESKD)。因此,腎臟受累也是造成SLE患者死亡的主要原因之一[2-3]。LN若能早期診斷,則可通過積極地干預,阻止或延緩ESKD的發(fā)生。目前臨床上診斷LN的“金標準”是腎活檢,并通過評估腎組織形態(tài)變化來區(qū)分LN(Ⅰ～Ⅵ類)的不同階段,進而決定治療方案。腎活檢的特異度高,但最顯著的缺點就是創(chuàng)傷性和不能實現早診斷,臨床迫切需要建立早期診斷和指導LN治療的無創(chuàng)方法或者發(fā)掘早期預警標志物[4]。

抗核抗體(ANA)是以真核細胞各種成分為靶抗原的非器官特異性自身抗體,目前被臨床廣泛應用于自身免疫性疾病篩選。ANA在患者出現典型臨床特征或被確診之前數年即可檢出,其結果不僅對多種自身免疫性疾病的診療及病情評估具有重要作用,一些ANA類型也能夠預測某些自身免疫性疾病的發(fā)展[5]。2019年歐洲風濕病聯(lián)盟/美國風濕病學會提出了SLE新的分類標準[6],將至少一次ANA陽性作為SLE強制進入標準,并推薦以人喉癌細胞(HEp-2細胞)為基質,采用間接免疫熒光法檢測外周血中ANA作為參考方法[7],該方法特異度高,結果易于觀察,不僅可以檢測到多種核分子抗體,還可以檢測到位于細胞質或由有絲分裂細胞表達的抗體,對于陽性結果可同時報告細胞熒光染色的滴度和模型類別。通過ANA熒光核型模式類別初步推斷其相對應的特異性自身抗體,可為疾病診斷提供支持證據。

SLE患者進展為LN的過程復雜,其確切的機制尚不明了,現有LN的生理病理研究結果支持SLE患者蛋白尿的出現,蛋白尿是腎小球損傷的結果,SLE患者體內的自身抗原與抗體形成免疫復合物,其與腎小球基底膜結合,沉積于腎臟,造成腎小球濾過率(eGFR)下降,繼而出現蛋白尿[8-9]。本文旨在探討SLE患者慢性腎臟病(CKD)發(fā)生與血清ANA熒光核型模式的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2019年1月至2022年11月,四川省綿陽市中心醫(yī)院診治的SLE患者796例,其中男54例,女742例,年齡16～82歲。納入標準:(1)符合2012年SLE國際合作組織(SLICC)公布的SLE分類標準,受試者必須滿足至少四項診斷標準,其中包括至少一項臨床診斷標準和至少一項免疫學診斷標準,或受試者經腎活檢證實為LN,伴ANA或抗ds-DNA抗體陽性,即可確診為SLE;(2)可收集到患者完整的臨床資料、實驗室資料及重要病程記錄;(3)選取時間段內反復就診的患者抽取SLE確診時的臨床資料和實驗室資料。排除標準:(1)合并其他自身免疫性疾病患者,如類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、多發(fā)性肌炎、混合性結締組織疾病、系統(tǒng)性血管炎等;(2)合并惡性腫瘤者;(3)合并其他易致腎損傷疾病,如糖尿病、原發(fā)性高血壓、泌尿系統(tǒng)感染、藥物性腎損害和原發(fā)性腎臟疾病的患者。

受試者診斷為CKD標準:任一腎臟損傷指標異?；騟GFR<60 mL·min-1·(1.73 m2)-1,持續(xù)時間>3個月。腎臟損傷指標包含:蛋白尿[尿蛋白/肌酐比值(UACR)≥30 mg/g]、尿沉渣異常、腎小管相關病變、組織學異常、影像學所見結構異?；蚰I移植史。

1.2樣本采集與處理 (1)血液樣本:研究對象禁食8～12 h,用一次性含分離膠/纖維蛋白酶促凝劑真空采血管(美國BD 公司)采集空腹靜脈血約5 mL,輕輕顛倒混勻,靜置。2 h內以3 000 r/min速度離心15 min。將血清平分為2份,分別用于ANA和胱抑素C(CysC)檢測。若當日未能及時檢測ANA,將所分離的血清樣本置2～8 ℃冷藏,3 d內完成檢測。(2)尿液樣本:受試者血液采集后,30 min內使用一次性尿液采集管收集中段隨機尿至少5 mL,于2 h內完成蛋白尿和肌酐檢測。

1.3實驗室檢測 (1)血清ANA檢測:采用間接免疫熒光法檢測ANA IgG抗體,試劑盒和全自動免疫熒光判讀儀由歐蒙醫(yī)學診斷(中國)有限公司生產。先用EUROPattern 全自動免疫熒光核型模式及滴度判讀系統(tǒng)初篩,再經人工復檢判定ANA核型和滴度,以熒光滴度大于或等于1∶100判為陽性,陽性ANA核型報告以2015年德國德累斯頓會議形成的ANA熒光核型模式國際共識為判斷標準。(2)CysC及eGFR估算: CysC采用透射比濁法,試劑盒由四川邁克生物科技股份有限公司生產,在LST008型生化分析儀(日本HITACHI公司)上測定。估算eGFR用本實驗室建立的等式進行計算[10],eGFRCysC=78.64×CysC-0.964。(3)UACR:蛋白尿和尿肌酐用西班牙BioSystems公司的 A25全自動特定蛋白分析儀其配套試劑檢測,結果用以計算UACR,公式為UACR(mg/g)=蛋白尿(mg/L)/尿肌酐(g/L)。

2 結 果

2.1受試者實驗室檢測結果分析 796例受試者中有519例被診斷為CKD,根據診斷結果將受試者分為CKD組(n=519)和非CKD組(n=277),兩組間臨床資料統(tǒng)計分析結果顯示受試者以女性SLE患者為主,占93.22%(742/796);觀察組間性別(Z=-0.653,P=0.514)和年齡(Z=-0.579,P=0.563)差異無統(tǒng)計學意義; eGFR(Z=-12.818,P<0.001)和UACR(Z=-20.229,P<0.001)差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 受試者實驗室檢測結果[n/n或M(P25～P75)]

2.2受試者熒光核型模式特征分析 796例受試者共檢出單一熒光核型229例,多核型疊加567例,檢出不同類別熒光核型模式13種,累計1 563次,其中細胞核類7種1 195次(76.46%),細胞質類3種365次(23.35%),其他類3種3次(0.19%),結果見表2。該結果顯示:(1)不同組間熒光核型疊加數量構成比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=29.894,P<0.001),隨疊加熒光核型數量增加CKD發(fā)生比例呈上升趨勢;(2)不同組間熒光核型滴度構成比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.521,P=0.004),隨熒光滴度增加CKD發(fā)生比例呈上升趨勢;(3)不同組間ANA熒光核型類別構成比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=75.802,P<0.001),CKD組核均質型檢出頻數構成比顯著高于非CKD組(P<0.05),而核斑點型、核仁型、致密顆粒型和其他胞漿型顯著低于非CKD組(P<0.05)。

表2 受試者檢出熒光核型模式特征[n(%)]

2.3受試者檢出核均質型與其他核型eGFR和UACR檢測結果分析比較 352例受試者檢出核均質型,經K-S法進行正態(tài)性檢驗,eGFR和UACR測定值呈非正態(tài)分布。比較受試者檢出和未檢出核均質型eGFR和UACR值,結果顯示:檢出核均質型的受試者其eGFR值更低,UACR值更高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表3。

表3 受試者核均質型與其他核型eGFR和UACR檢測結果分析比較或M(P25～P75)]

519例CKD 患者eGFR和UACR測定值經K-S法檢驗,eGFR值呈正態(tài)分布,UACR值為非正態(tài)分布。比較CKD患者中檢出和未檢出核均質型eGFR和UACR值,結果顯示:檢出核均質型的CKD患者UACR值更高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),而eGFR值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

277例非CKD 患者eGFR和UACR測定值經K-S法檢驗,eGFR值呈正態(tài)分布,UACR值為非正態(tài)分布。比較非CKD患者中檢出和未檢出核均質型eGFR和UACR值,結果顯示:eGFR值和UACR值差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4受試者中CKD患者預后風險評估分組 519例CKD患者以eGFR聯(lián)合UACR值評估預后風險程度[11-12],按照風險高低分為4組,低風險組(LR組)42例,中風險組(MR組)161例,高風險組(HR組)186例和極高風險組(VHR組)130例。見表4。

表4 受試者中CKD患者預后風險分組(n)

2.5CKD患者預后不同風險組間熒光核型特征分析 519例CKD患者共檢出單一熒光核型126例(24.28%),多核型疊加393例(75.72%),檢出不同類別熒光核型累計1 074次,結果顯示:(1)不同風險組間熒光核型疊加數量構成比差異有統(tǒng)計學意義(G=0.141,P=0.016),隨疊加熒光核型數量增加CKD預后風險呈上升趨勢;(2)不同風險組間熒光核型滴度構成比差異無統(tǒng)計學意義(G=0.044,P=0.247);(3)不同風險組間ANA熒光主要核型類別構成比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=37.959,P<0.001),兩兩比較,HR組和VHR組核均質型構成比顯著高于LR組,HR組核均質型構成比顯著高于MR組,差異有統(tǒng)計學意義,HR組核仁型占比顯著低于LR組。見表5。

表5 CKD患者預后不同風險組熒光核型模式特征[n(%)]

3 討 論

腎臟是SLE最易受累的器官之一[13-14],按照KDIGO指南對CKD的定義,所有LN患者都有CKD,SLE患者都是CKD的風險人群[15]。ANA檢測陽性是SLE確診標準之一[16],間接免疫熒光法為檢測ANA的參考方法,該方法可報告陽性熒光核型類別和滴度,通過熒光核型類別判斷自身抗體種類,熒光滴度的高低估算抗體水平的多少。本研究通過分析SLE患者腎損傷指標、ANA熒光核型和滴度等,發(fā)現SLE患者中不同ANA熒光核型類別、核型疊加數量和滴度高低與CKD的發(fā)生和預后風險相關。

ANA按核內各個分子的性質不同可分為不同性質的自身抗體,如抗DNA抗體、抗組蛋白抗體、抗非組蛋白抗體和抗核仁抗體等[17-18]。不同性質的自身抗體通過抗原抗體反應定位在特定的細胞基質,發(fā)生免疫效應,造成器官或組織損傷[18]。SLE發(fā)展為LN的過程,其實是SLE患者體內自身抗體介導的免疫復合物與腎小球基底膜結合,沉積于腎臟,隨后發(fā)生腎臟炎癥的過程[19]。ANA熒光核型模式反映了不同性質自身抗體在特定細胞基質的相同定位,雖然自身抗體類別和熒光核型模式之間不是一一對應關系[20-22],同一種自身抗體可以出現不同類別的熒光核型模式,不同的自身抗體也可出現相同類別的熒光核型模式[23-24],但間接免疫熒光法檢測ANA,其陽性結果報告的熒光核型模式和熒光滴度,可大致反映體內自身抗體類別和含量,對疾病發(fā)生發(fā)展具有提示意義。本試驗結果發(fā)現,受試者ANA疊加熒光核型數量越多,熒光滴度越高,發(fā)生CKD的比例越高,提示受試者體內自身抗體的異質性或類別越復雜,其抗體含量越多,沉積于腎臟的免疫復合物越復雜,所介導的免疫反應可能越活躍,則腎臟受累越嚴重。

有研究已發(fā)現,SLE患者體內存在100多種不同性質的自身抗體,同一種自身抗體還可能存在多種異質體,但仍無法確定SLE患者全部自身抗體的類別,亦無法明確不同類別抗體之間、同一自身抗體不同異質體之間,是否存在對患者組織器官的具體累積傷害效應或協(xié)同保護效應。本試驗結果亦發(fā)現,受試者中CKD組與非CKD組其熒光核型類別差異有統(tǒng)計學意義,提示核斑點型、核仁型、致密顆粒型和其他胞漿型受試者其腎臟受累程度更輕,而核均質型SLE患者更易發(fā)生腎臟受累或累積傷害更嚴重。ANA檢測不同類別熒光核型差異主要表現為:(1)HEp-2細胞分裂間期細胞著染部位和形態(tài)差異;(2)分裂期濃縮染色體是否著染。著染部位及形態(tài)差異由靶抗原的類別決定,靶抗原類別不同,發(fā)生抗原抗體反應部位不同,產生免疫效應不同,對靶器官造成的累積效應也不同。核斑點型靶抗原來源于核糖核蛋白(Sm、RNP、SS-A、SS-B)、Ku和細胞周期蛋白(Ⅰ型和Ⅱ型)等[25],核仁型靶抗原來源于Scl-70、RNA多聚酶和原纖維蛋白等;核斑點型、核仁型陽性受試者表現出腎受累概率更低且受累更輕,是否此類自身抗體對腎臟累計傷害較小或是否具保護效應,這需要更深入的研究和更多的數據來驗證。

本試驗中核均質型陽性受試者eGFR更低和UACR更高,表現出更嚴重的腎臟受累,更高的CKD發(fā)病風險。核均質型在HEp-2細胞基片上呈現的熒光核型模式特點為:間期細胞核陽性,呈均勻的熒光,分裂期細胞濃縮染色體陽性,熒光更強[26]。核均質型熒光核型模式特征與對應來源于DNA、組蛋白和核小體等靶抗原相關,主要相關的自身免疫性疾病包括SLE、類風濕關節(jié)炎和藥物性狼瘡[27]等,此類患者體內免疫狀態(tài)活躍,細胞大多呈異常凋亡狀態(tài)[28-29],可釋放出大量細胞內容物,這些物質作為靶抗原,被機體免疫系統(tǒng)識別產生對應自身抗體,再與靶抗原結合,沉積于特定部位,作用于靶器官。本試驗中核均質型陽性受試者發(fā)生更嚴重腎損傷的原因可能為:核均質型陽性SLE可能會產生更多的凋亡核小體,釋放出大量的DNA、RNA和核糖體等,這些物質在凋亡過程中免疫活性增強,被體內髓系樹突狀細胞消化,并以自身抗原形式呈遞給T細胞,被激活的T細胞刺激B細胞產生相應抗體,如抗核小體抗體等,同時T細胞通過表位擴散誘導產生抗ds-DNA抗體和抗組蛋白抗體,形成核小體-自身抗體復合物并進入循環(huán)系統(tǒng),與腎小球基底膜結合,沉積于腎臟,免疫復合物誘導補體活化、發(fā)生炎癥細胞浸潤及釋放細胞因子等,導致局部炎癥發(fā)生,造成腎小球損傷[30-31]。在抗ds-DNA抗體或含DNA的免疫復合物刺激下小管間質免疫耐受被打破,發(fā)生獲得性免疫反應,產生大量的細胞因子,介導小管間質的炎癥反應,造成小管間質纖維化及小管的萎縮,發(fā)展為腎小管-間質病變,與腎小球損傷并存,加劇腎臟損傷[32]。

SLE患者都是CKD的風險人群,早期評估SLE進展為CKD的發(fā)生風險尤為重要,本試驗結果提示特定的ANA熒光核型模式與SLE腎損傷相關,ANA在SLE患者出現典型臨床特征或被確診之前數年即可檢出,通過ANA熒光核型模式對不同風險SLE患者做到早期識別,分層管理,或許可以降低SLE腎受累進展為ESRD的風險。