崔亞斌 綜述,沈 娜,蘇衛(wèi)東△ 審校

天津市第四中心醫(yī)院:1.檢驗科;2.中心實驗室,天津 300140

銅綠假單胞菌(PA)是由世界衛(wèi)生組織(WHO)提出必須迅速開發(fā)的新抗菌藥物廣泛清單上最優(yōu)先病原體ESKAPE(屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、PA、腸桿菌屬)的成員之一,其對生存環(huán)境變化具有很強的遺傳靈活性和生理適應(yīng)性,表現(xiàn)在對抗菌藥物耐受性增強(MDR-PA、XDR-PA、PDR-PA、CR-PA)、細(xì)菌生存方式改變(生物膜形成)以及細(xì)菌表型改變(小菌落變異株、黏液型菌株)[1]。PA通過分泌黏性和保護性基質(zhì),菌體以群體的形式存在于胞外聚合物(EPS)中,形成“生物膜”。生物膜形成能幫助PA實現(xiàn)免疫逃逸和(或)增強抗菌藥物耐受性[2];另外生物膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞的最小抑菌濃度(MIC)可能比浮游狀態(tài)高10～10 000倍[3],因此一旦生物膜形成,臨床感染就很難根除。

宿主感染期間,宿主通過“營養(yǎng)免疫”來限制PA對鐵的攝取。作為回應(yīng),菌細(xì)胞能分泌鐵載體、還原血紅素等機制獲取鐵,以滿足生存需要。鐵爭奪戰(zhàn)是宿主-病原體相互作用中的一個重要過程,病原體獲得這種金屬的有效性可以決定感染的成敗。因此,阻斷鐵獲取正成為預(yù)防和/或治療PA感染的一種新策略。本文僅就鐵元素在PA生物膜發(fā)生發(fā)展及抗生物膜感染的新進(jìn)展做以下綜述。

1 PA的鐵攝取系統(tǒng)

PA通過多種鐵攝取系統(tǒng)來獲取鐵元素:(1)鐵載體系統(tǒng);(2)血紅素系統(tǒng);(3)Feo和BqsR/BqsS雙組分的Fe2+攝取系統(tǒng);(4)PQS系統(tǒng)介導(dǎo)鐵攝取;(5)鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。

1.1鐵載體系統(tǒng) 鐵載體是PA最主要的鐵攝取途徑,其對Fe3+有很強的親和力,是在鐵缺乏條件下合成和分泌的。PA能合成兩種內(nèi)源性鐵載體:熒光嗜鐵素(PVD)和鰲鐵蛋白(PCH)。PVD是一種肽類鐵載體,含有兩個異羥肟基團和一個熒光二羥基喹啉發(fā)色團;而PCH是以水楊酸為基礎(chǔ)的鐵載體,相比PVD而言,PCH對鐵的親和力較低。PA優(yōu)先合成PCH,但在環(huán)境鐵濃度非常低時,PVD的合成明顯增多[4]。二者在與各自特定的TonB依賴性轉(zhuǎn)運蛋白(TBDT)結(jié)合(FptA和FpvA)后,借助質(zhì)膜上TonB-ExbB-ExbD復(fù)合物提供的能量將Fe3+鐵載體轉(zhuǎn)運到細(xì)胞周質(zhì);Fe3+在周質(zhì)中完成解離并還原成Fe2+,Fe2+經(jīng)周質(zhì)三磷酸腺苷(ATP)依賴的通透酶(ABC轉(zhuǎn)運蛋白)跨質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[5]。

在鐵充足的培養(yǎng)基中,PVD突變體(PvdA-)菌株僅在介質(zhì)表面形成平坦均勻的菌層,而PCH突變體(PchA-)則形成類似野生型的復(fù)雜生物膜[6],表明PVD對生物膜生成影響更大。事實上,PVD發(fā)揮雙重作用,既是鐵載體,也是毒力因子(胞外蛋白酶PrpL和外毒素A)的激活信號。PVD對鐵的高親和力允許其能從宿主的轉(zhuǎn)鐵蛋白中螯合鐵,是引起小鼠燒傷模型和肺病模型的感染所必需的[7]。PCH-Fe3+復(fù)合物不僅通過鐵攝取促進(jìn)PA毒力表達(dá),而且還通過氧化還原反應(yīng)引起宿主的氧化損傷和炎癥反應(yīng)。囊性肺纖維化(CF)患者痰標(biāo)本中,PCH合成量顯著增加,并引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)和導(dǎo)致組織損傷[8]。因此PVD和PCH二者都是顯著影響PA致病性的關(guān)鍵毒力因子。

PA可以利用多種異源性鐵載體,如腸桿菌素(大腸桿菌產(chǎn)生)、鐵絡(luò)素(構(gòu)巢曲霉和黃青霉產(chǎn)生)和外螯合素(新金分枝桿菌產(chǎn)生)。鐵絡(luò)素可以影響PA生物膜的發(fā)育和彈性蛋白酶的活性,外螯合素介導(dǎo)的鐵攝取系統(tǒng)對生物膜的形成至關(guān)重要[5]。PA利用異源性鐵載體能力有助于增強其在多種微生物混合感染中的競爭力,機制可能是通過對鐵的競爭來抑制其他微生物的生長。

1.2血紅素攝取系統(tǒng) 血紅素?zé)o法以游離形式存在,因此鐵元素必須從血紅蛋白或血液結(jié)合素中攝取,PA可通過Phu系統(tǒng)、Has系統(tǒng)和Hxu系統(tǒng)獲得鐵。在Phu和Hxu系統(tǒng)中,分別通過PhuR和HxuR直接結(jié)合血紅素將其轉(zhuǎn)運到細(xì)胞周質(zhì);而在Has系統(tǒng)中,首先胞外血紅素結(jié)合蛋白(HasAp)結(jié)合血紅素,形成“HasAp-血紅素”復(fù)合物輸送至HasR,而后再將血紅素轉(zhuǎn)運到細(xì)胞周質(zhì)[9]。

周質(zhì)中,血紅素結(jié)合蛋白PhuT結(jié)合血紅素并將其輸送到PhuUV ABC轉(zhuǎn)運蛋白,然后穿過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。血紅素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi),血紅素被血紅素分子伴侶Phus結(jié)合,運輸給血紅素加氧酶(Hemo),進(jìn)一步裂解生成膽綠素Ⅸβ(BVⅨβ)和Ⅸδ(BVⅨδ)、CO和Fe3+[10]。PA產(chǎn)生另一種血紅素加氧酶BphO切割血紅素產(chǎn)生BVⅨα。BVⅨα是PA色素BphP的發(fā)色團,能感知紅光和遠(yuǎn)紅光,這種感光調(diào)節(jié)能力與生物膜的形成和毒力高度相關(guān)[10]。

在Hxu系統(tǒng)被鑒定出之前,盡管在PA感染期間,HasAp和PhuR表達(dá)上調(diào),但是血紅素系統(tǒng)在影響PA毒力的重要性長期被低估。最新研究發(fā)現(xiàn)血流感染中分離出的PA,Hxu系統(tǒng)呈高表達(dá),并且Hxu系統(tǒng)缺失能降低了PA的致病力。另外Hxu系統(tǒng)過表達(dá)會增加PA敗血癥的風(fēng)險[11]。

1.3Feo系統(tǒng)和BqsR/BqsS雙組分?jǐn)z取系統(tǒng) 在囊性纖維化(CF)患者的肺部黏液層或生物膜的底部極易形成厭氧和(或)較低pH值的微需氧環(huán)境,Fe3+還原為水溶性的Fe2+,Fe2+成為鐵的主要來源。細(xì)胞胞外Fe2+通過未定義的孔蛋白通道自由擴散到周質(zhì),通過周質(zhì)中β-1,2葡聚糖螯合Fe2+,選擇性實現(xiàn)富鐵條件下限制游離鐵誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和限鐵條件下促進(jìn)菌株生長[6]。

周質(zhì)中Fe2+大部分通過Feo ABC系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至胞內(nèi),該系統(tǒng)由FeoB滲透酶、FeoA和FeoC蛋白組成;同時PA在生物膜中形成另一個Fe2+轉(zhuǎn)運系統(tǒng),即BqsR/BqsS雙組分系統(tǒng)[10]。二者都受到吩嗪的調(diào)節(jié),吩嗪是PA產(chǎn)生的二級代謝產(chǎn)物。吩嗪-1-羧酸(PCA)是綠膿菌素(PYO)的前體,PCA和PYO均具有氧化還原能力,能將Fe3+還原為Fe2+。BqsR/BqsS系統(tǒng)可通過調(diào)節(jié)假單胞菌喹諾酮信號(PQS)(pqsA和phnA)和鼠李糖脂(rhlA)的生物合成而調(diào)節(jié)生物膜形成。當(dāng)病情加重時,CF患者肺部檢測到吩嗪和Fe2+的大量積累,給予Fe2+和Fe3+兩種離子的螯合劑聯(lián)用可以很大程度上降低PA生物膜形成能力[12]。

1.4PQS系統(tǒng)介導(dǎo)的鐵攝取 群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS)是細(xì)菌細(xì)胞間信號交換的過程,依賴于對稱為自動誘導(dǎo)劑的細(xì)胞外信號分子的產(chǎn)生、檢測和反應(yīng),并允許細(xì)菌群同步改變行為,以響應(yīng)鄰近群落的種群密度和物種組成的變化。QS對于PA多重毒力表達(dá)和生物膜形成至關(guān)重要。

PA有PQS、LasIR和RhlIR 3種主要QS系統(tǒng)。PQS系統(tǒng)產(chǎn)生特異性的2-烷基-4-喹諾酮信號(AQs),包括信號分子2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(PQS)及其前體2-庚基-4-喹諾酮(HHQ)。PQS中3′-OH基團能螯合生理pH下的Fe3+,降低環(huán)境中鐵的濃度,最終誘導(dǎo)PVD和PCH基因表達(dá),借此增強鐵攝取。另外PA還能通過H3型Ⅵ分泌系統(tǒng)(H3-T6SS)效應(yīng)分子TseF利用PQS與FptA的連接來實現(xiàn)螯合的Fe3+,但其利用效率低于其他鐵攝取途徑[13]。

1.5鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié) 過量攝取鐵會出現(xiàn)不良后果,鐵通過Fenton反應(yīng)和Haber-Weiss反應(yīng)與氧結(jié)合生成活性氧(ROS),導(dǎo)致大分子(如脂質(zhì)和蛋白質(zhì))的破壞,引起細(xì)菌死亡。因此保持鐵穩(wěn)態(tài)是至關(guān)重要的。

PA鐵穩(wěn)態(tài)主要由鐵攝取調(diào)節(jié)因子(Fur)進(jìn)行調(diào)節(jié),而且Fur的調(diào)節(jié)作用是PA必不可少的。Fur不僅作為基因轉(zhuǎn)錄的直接抑制因子,直接激活Fur與靶基因的啟動子區(qū)域的結(jié)合;而且作為基因轉(zhuǎn)錄的間接抑制因子,通過間接激活小RNA的Fur依賴性表達(dá)(即PrrF1、PrrF2和PrrH)、置換絲氨酸蛋白樣蛋白或阻斷結(jié)合絲氨酸蛋白抑制劑[14]。Fur不僅調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)基因的表達(dá),還參與調(diào)節(jié)許多其他重要功能的基因,如毒力、呼吸、中樞代謝和應(yīng)激反應(yīng)等。

PrrF1和PrrF2的表達(dá)在富鐵條件下被Fur阻斷;而在限鐵條件下被激活,通過下調(diào)非必需含鐵蛋白質(zhì)的表達(dá)來滿足鐵需求。PrrH被編碼在prrF位點內(nèi),鐵和血紅素都能通過血紅素運輸?shù)鞍譖huS抑制PrrH的表達(dá)[15]。血紅素合成基因(hemB和nirL)和PVD基因pvdL是prrF 位點的靶標(biāo),通過調(diào)節(jié)prrF/prrH sRNA基因的轉(zhuǎn)錄,PhuS可以整合胞外血紅素的代謝進(jìn)入鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[16]。另外PA的毒力也依賴于PrrF和PrrH調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)來實現(xiàn),比如抗氧化應(yīng)激蛋白質(zhì)的基因表達(dá),如超氧化物歧化酶和過氧化氫酶;鐵螯合相關(guān)蛋白,如細(xì)菌鐵蛋白以及有氧或無氧呼吸相關(guān)蛋白,如烏頭酸酶、富馬酶和琥珀酸脫氫酶等[17]。

鐵載體能夠充當(dāng)誘導(dǎo)自身合成的信號分子,但PVD的生物合成和吸收不是由Fur直接調(diào)控的,而是通過兩個ECF σ因子PvdS和FpvI間接調(diào)節(jié)PVD生物合成。這兩個ECFσ因子被跨內(nèi)膜抗σ因子(FpvR)的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域隔離,當(dāng)在Fe3+PVD復(fù)合物與外膜FpvA-TBDT復(fù)合物結(jié)合后,觸發(fā)FpvR蛋白水解,從而釋放PvdS和FpvI,使其能夠與核心RNA聚合酶結(jié)合來促進(jìn)鐵代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[18]。

總之,PA通過動態(tài)調(diào)節(jié)限鐵條件下的鐵攝取和富鐵條件下的鐵外排,一方面應(yīng)對宿主感染期間的營養(yǎng)免疫帶來的鐵缺乏,另一方面消除胞內(nèi)鐵富足導(dǎo)致的細(xì)胞毒性,保證自身鐵穩(wěn)態(tài)來實現(xiàn)生存需求。

2 鐵元素參與生物膜形成調(diào)控

外源添加鐵螯合劑乳鐵蛋白明顯抑制PA生物膜的形成,而適宜的高鐵濃度環(huán)境反而可促進(jìn)PA生物膜的形成,說明鐵可作為一種信號調(diào)節(jié)PA生物膜的發(fā)育[6]。PA生物膜生成受多個系統(tǒng)調(diào)控,包括QS系統(tǒng)、Gac/Rsm和c-di-GMP雙組分調(diào)控系統(tǒng)。

PA 3個主要QS系統(tǒng)(即PQS、LasI和RhlI系統(tǒng)),通過這3個QS系統(tǒng)的相互作用來調(diào)控多種毒力基因表達(dá)和生物膜發(fā)育。LasI和RhlI系統(tǒng)分別產(chǎn)生N-3-氧代十二烷?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯(3-oxo-C12-HSL)和N-丁?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯(C4-HSL),并與相應(yīng)的受體蛋白(轉(zhuǎn)錄因子LasR 和RhlR)結(jié)合后激活一系列基因(包括lasI和rhlI基因)的轉(zhuǎn)錄;PQS系統(tǒng)產(chǎn)生信號分子PQS及其前體HHQ。

3-oxo-C12-HSL的降解產(chǎn)物3-(1-羥基茚基)-5-(2-羥乙基)吡咯烷-2,4-二酮(C12-TA)對Fe3+具有很高的親和力,C12-TA能夠溶解金黃色葡萄球菌并進(jìn)入其胞內(nèi)鐵存儲池來獲取鐵[19]。PQS系統(tǒng)螯合Fe3+,誘導(dǎo)鐵饑餓和鐵載體介導(dǎo)的鐵攝取。PA外膜囊泡(OMV)通常存儲有含鐵的PQS分子,可作為鐵饑餓條件鐵的替代來源[13]。LIU等[20]發(fā)現(xiàn)PCH合成基因簇(包括pchDCBA操縱子、PCH合成酶基因phcF和Fe3+-PCH外膜受體fptA)和PVD合成酶基因(pvdJ、pvdA和pvdD)在響應(yīng)PQS時上調(diào)。RhLI系統(tǒng)調(diào)控表面活性劑鼠李糖脂的表達(dá),在生物膜形成的早期,限制鐵能誘導(dǎo)鼠李糖脂的產(chǎn)生,使細(xì)胞發(fā)生抽搐運動,形成扁平的無結(jié)構(gòu)生物膜[21]。鐵可以通過干擾PrrF1和PrrF2的表達(dá),與PQS建立聯(lián)系,促進(jìn)HHQ和PQS的產(chǎn)生[22]。

Gac/Rsm和c-di-GMP通過調(diào)節(jié)EPS,與細(xì)菌在浮游生物和生物膜之間的生活方式轉(zhuǎn)換有關(guān)。細(xì)胞胞外多糖作為EPS的基本成分,構(gòu)成了PA的生物膜結(jié)構(gòu),藻酸鹽、Pel和Psl是PA產(chǎn)生的主要胞外多糖。環(huán)境低鐵可以加速藻酸鹽的表達(dá),而增加鐵能通過抑制ArmZ來刺激Psl的合成,ArmZ是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,能夠滅活Psl基因操縱子并激活藻酸鹽的產(chǎn)生。鐵還可以通過抑制鼠李糖脂的合成來促進(jìn)Psl的生成[23]。此外,還發(fā)現(xiàn)胞外多糖能夠結(jié)合鐵。Psl既能結(jié)合Fe2+,又能結(jié)合Fe3+,Pel常與Fe2+結(jié)合,而藻酸鹽僅與Fe3+結(jié)合。CF患者痰液樣本中Fe2+濃度與肺纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān),高濃度鐵能誘導(dǎo)刺激Psl的合成及Psl介導(dǎo)的生物膜形成[24]。Gac和c-di-GMP通過促進(jìn)PVD的表達(dá),協(xié)同作用增強鐵攝取。Gac和c-di-GMP需要Pel和Psl來介導(dǎo)PVD的產(chǎn)生。細(xì)胞外DNA(eDNA)也是生物膜基質(zhì)的組成部分,由裂解細(xì)胞釋放,促進(jìn)細(xì)胞間最初的黏附和表面聚集。YANG等[25]發(fā)現(xiàn)低鐵通過提高eDNA的表達(dá)促進(jìn)銅綠假單胞菌生物膜的發(fā)育,而高鐵水平則抑制eDNA的表達(dá)。

PA生物膜發(fā)育成熟與QS系統(tǒng)精細(xì)調(diào)節(jié)密切相關(guān),鐵元素在其中發(fā)揮重要作用,因此對鐵攝取的干預(yù)也成為阻斷PA生物膜形成的潛在靶點。

3 鐵元素抗生物膜感染的策略

生物膜形成是臨床抗PA感染失敗的主要原因之一,因此破壞或阻斷參與生物膜發(fā)育成熟可作為抗生物膜感染的有效策略。鑒于鐵在生物膜發(fā)育成熟中的作用,因此通過靶向干預(yù)鐵攝取和/或通過鐵螯合劑調(diào)節(jié)鐵攝取來影響生物膜的發(fā)育成熟是抗感染的新策略。

3.1鐵拮抗劑 金屬鎵(Ga3+)與Fe3+有相同的原子大小和氧化態(tài),但不能進(jìn)行氧化還原反應(yīng)。Ga3+通過模擬鐵元素和抑制多種酶的催化活性,阻斷依賴于鐵的氧化還原循環(huán)過程來發(fā)揮抗菌活性。Ga3+能抑制PA生物膜的生長,并能分散已形成的生物膜。給予局部給藥,Ga3+明顯促進(jìn)PA感染傷口愈合[26]。鎵可以在胞外與PVD結(jié)合,減少胞外Fe3+-PVD合成和依賴PVD的鐵攝取來抑制PA生長[7]。

基于鎵的組合策略比單獨使用鎵更能增強抗感染的作用。鎵-原卟啉Ⅸ (Ga-PPⅨ)化合物,通過PhuR進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),靶向結(jié)合血紅素依賴性b型細(xì)胞色素并抑制細(xì)胞呼吸實現(xiàn)抗生物膜作用[27]。鎵-去鐵胺比鎵鹽更好地抑制PA浮游生長,并通過減少細(xì)胞內(nèi)鐵的量來阻止生物膜的形成[28]。目前一些含鎵生物材料,包括介入生物活性玻璃支架、含鎵磷硅酸鹽玻璃和鎵接枝鈦植入物,正被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)假體設(shè)備和涂層導(dǎo)管中,以減少生物膜形成。

需要注意的是GA是一種腎毒性藥物,使用過程中應(yīng)當(dāng)緩慢靜脈輸注,同時要求患者在輸注期間補充水份,一方面不會影響腎功能、電解質(zhì)水平和血細(xì)胞計數(shù),另一方面能改善CF患者的肺功能[29]。

3.2鐵螯合劑 鐵螯合劑能螯合生長環(huán)境中的鐵達(dá)到限制病原體的可用鐵源而實現(xiàn)抗菌目的。乳鐵蛋白是中性粒細(xì)胞和外分泌腺產(chǎn)生的內(nèi)源性螯合劑,是一種急性期蛋白質(zhì),在感染引起炎癥期間就會產(chǎn)生并增加,該分子的抗菌特性也存在于乳鐵蛋白衍生肽和合成類似物肽中。乳鐵蛋白螯合Fe3+,刺激PA抽搐運動,使細(xì)菌在表面上移動而不是附著和形成生物膜[17]。Alaxia SAS開發(fā)的乳鐵蛋白和硫氰酸鹽組成的螯合劑ALX-009,用于治療CF患者的PA感染[30]。轉(zhuǎn)鐵蛋白是由人體肝臟合成內(nèi)源性螯合劑,使用去鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白可來螯合游離鐵,發(fā)揮抗菌活性[31]。

FDA已批準(zhǔn)的鐵螯合劑,去鐵胺、地拉羅司和去鐵酮臨床應(yīng)用表現(xiàn)出比其他治療方案更高的安全性。去鐵胺可作為治療CF肺炎的替代方案之一[32]。盡管2,20-聯(lián)吡啶、二乙烯三胺五乙酸和EDTA被證實具有抑制PA生長和生物膜形成的能力,但是使用鐵螯合劑作為抗菌藥物的佐劑比單獨使用具有更明顯的抗生物膜作用。鐵螯合劑N,N′-雙(2-羥芐基)乙二胺-N,N′-二乙酸(HBED)已被證明是黏菌素的有效佐劑。二者聯(lián)用成功地抑制了需氧和厭氧條件下的PA生物膜形成[33]。妥布霉素和去鐵胺或地拉羅司的聯(lián)合治療使生物膜形成減少了90%,且增強妥布霉素的抗菌作用[34]。

臨床應(yīng)用中要注意細(xì)胞毒性是鐵螯合劑治療的缺點,專家建議通過吸入給藥途徑,這不僅減少了鐵螯合劑的潛在全身不良反應(yīng),而且還增加了藥物對肺部的局部作用[32,35]。

3.3“特洛伊木馬”策略 生物膜耐藥性的原因在于細(xì)菌胞外膜和生物膜通透性降低。大多數(shù)抗PA感染的抗菌藥物必須穿透細(xì)胞膜才能到達(dá)胞內(nèi)靶點發(fā)揮作用?！疤芈逡聊抉R”策略基于抗菌藥物與鐵載體的偶聯(lián),通過外膜上特異性鐵載體的TBDT,促使與鐵載體偶聯(lián)藥物透過低滲透性PA外膜從而進(jìn)入胞內(nèi),實現(xiàn)藥物跨膜轉(zhuǎn)運。

頭孢地爾-鐵載體偶聯(lián)物基于此原理,該偶聯(lián)物一方面增強了對β內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性,同時利用其鐵載體樣特性進(jìn)入周質(zhì)空間的能力大大提高,因此頭孢地爾-鐵載體被認(rèn)為比頭孢他啶-阿維巴坦和美羅培南對所有耐藥的PA更有效[36]。環(huán)丙沙星-鐵載體偶聯(lián)物,能明顯提高膜內(nèi)環(huán)丙沙星的藥物濃度,對環(huán)丙沙星耐藥菌株AM85也有抗菌活性[37]。

3.4QS抑制劑 鑒于QS在生物膜發(fā)育中的重要作用,具有抗QS活性的藥物,也稱為QS抑制劑(QSIs),這些抑制劑具有特定的小范圍靶標(biāo),不會對有益菌造成傷害,同時降低了細(xì)菌耐藥性的風(fēng)險。近年來,使用QSIS來治療PA感染已被廣泛研究。姜黃素、兒茶素、咖啡因、水楊酸、丁香酚、姜黃素、迷迭香酸、柚皮苷、綠原酸、桑色素、植物醇和2,5-哌嗪二酮等QSIS可通過抑制QS信號分子及其前體的合成,或作為信號分子的拮抗劑或抗體,以非殺菌或非抑菌的方式減弱PA毒力和抑制生物膜形成[38-39]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明,給予姜黃素后,PVD上調(diào)和亞鐵氧化酶的下調(diào)伴隨胞內(nèi)Fe3+含量升高,隨之Fe3+通過Fenton反應(yīng)轉(zhuǎn)化為Fe2+,最終導(dǎo)致大分子的損傷[40]。

3.5納米粒子 具有體積小、可修飾、比表面積大、對疏水性和親水性藥物分子適應(yīng)性強、在生理體液中的穩(wěn)定性高、對靶點的特異性等特點,被認(rèn)為是理想的抗菌材料。納米銀顆粒(AgNPs)破壞Fe-S簇,通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生Fe2+,引起羥基自由基的產(chǎn)生,破壞DNAs、蛋白質(zhì)和脂質(zhì),從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。AGNPs還可以通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的完整性、破壞二硫鍵和干擾細(xì)胞信號通路來破壞生物膜。AGNPs與妥布霉素或氨曲南聯(lián)合用藥能顯著降低生物膜內(nèi)細(xì)菌濃度和細(xì)菌生物活性[41]。

小鼠肺炎模型,納米顆粒微泡(Mbs)內(nèi)含封裝哌拉西林和Fe3O4納米粒子的核芯。在超聲波刺激下,Mbs能物理地破壞生物膜的結(jié)構(gòu),并增強Fe3O4納米顆粒和哌拉西林對生物膜的滲透。一方面在哌拉西林的幫助下,Fe3O4納米粒子能降解生物膜基質(zhì)并殺死細(xì)菌;再者Fe3O4微粒可通過將巨噬細(xì)胞極化為促炎表型來激活生物膜消除的免疫逃逸,有效地治療小鼠模型的慢性肺部感染[42]。

此外通過研發(fā)鐵代謝途徑的疫苗,制備單克隆抗體來與鐵攝取競爭;利用晶體學(xué)方法確定細(xì)菌鐵代謝途徑中酶的結(jié)構(gòu)成分,合成針對鐵代謝過程酶的人工抑制劑。盡管這些都尚未形成針對PA的許可疫苗和藥物,但這都是值得高度重視的抗PA生物膜感染的新靶點。

總之,生物膜形成賦予PA對外界環(huán)境更強的適應(yīng)能力并增強抗菌藥物耐藥性,是PA感染性疾病難以治療的重要原因。鐵元素是PA生物膜生長所必需的。PA的鐵攝取能力被認(rèn)為是其毒力和生物膜形成的重要標(biāo)志,因此以干預(yù)和阻斷鐵代謝為目標(biāo)的藥物正在成為抗菌研究領(lǐng)域的新熱點。令人鼓舞的是,一系列鐵拮抗劑和螯合劑已經(jīng)開發(fā)出來,有的已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗?？梢灶A(yù)見,隨著對鐵元素在PA生物膜形成中作用認(rèn)識的不斷深入,在不久的將來,靶向鐵穩(wěn)態(tài)藥物將在臨床上應(yīng)用于PA及其生物膜感染相關(guān)疾病的治療。