湯 茜,宋冬明,王方明,劉敏黎

江南大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,江蘇無錫 214000

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種系統(tǒng)性慢性自身免疫性疾病,其特征是血液中的各種自身抗體和多個器官受到影響,表現(xiàn)從輕度到重度,甚至危及生命[1-2]。中國SLE的患病率為30～70/100 000,世界排名第二,且大多數(shù)SLE患者是育齡的年輕女性[3]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,SLE患者的生活質(zhì)量得到了顯著改善,但其通常具有與其他自身免疫性疾病重疊的癥狀、自身抗體和易感基因等,導(dǎo)致在臨床中經(jīng)常被誤診[4]。SLE的確切病理病因尚不明確,因此,尋找與SLE進展密切相關(guān)的生物標(biāo)志物,對其臨床研究開展新的方向十分必要。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)是先天免疫應(yīng)答的細胞內(nèi)銜接蛋白之一,參與各種細胞過程中的信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié),且TRAF3主要通過核因子-κB激酶(NIK)降解作為替代NF-κB通路的抑制劑[5]。微小RNA(miRNA)是一種基因調(diào)控分子,通過影響靶基因的表達來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥途徑,例如miR-107可在膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷中產(chǎn)生重要作用[6-7]。因此,猜測TRAF3與miR-107可能參與SLE進程,本研究通過檢測SLE患者血清TRAF3、miR-107表達水平分析TRAF3、miR-107與SLE疾病活動度的相關(guān)性,探討其用于SLE病情監(jiān)測和作為治療靶點的可能性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年1月至2022年1月本院接收的80例SLE患者作為研究對象(SLE組)。根據(jù)SLE疾病活動指數(shù)(SLEDAI)評分[8]進一步將研究對象分為輕中度組(SLEDAI評分<10分)32例和重度組(SLEDAI評分≥10分)48例。納入標(biāo)準:(1)臨床確診為SLE[8];(2)臨床資料完整。排除標(biāo)準:(1)患其他自身免疫性疾病者;(2)有嚴重感染者;(3)患惡性腫瘤者;(4)患心腦血管疾病者;(5)患其他肝、腎疾病者。另外納入同期體檢健康者80例為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2方法

1.2.1熒光定量PCR測定血清TRAF3、miR-107的表達水平 取入組者空腹血清5 mL,保存于-80 ℃待測。使用RNeasy Mini Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)純化血清中的總RNA,并用PrimeScript RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄。計算A260/A280比值以評估RNA質(zhì)量和純度。在推薦的熱循環(huán)設(shè)置下,使用RotorGene 6000系統(tǒng)(Corbett Life Science,QIAGEN)上使用SensiFASTTMSYBRNo-ROX試劑盒(美國Bioline公司)進行熒光定量PCR測定。以U6、GAPDH為內(nèi)參?；蛳嚓P(guān)序列見表1。反應(yīng)結(jié)束后TRAF3、miR-107 mRNA的相對表達水平采用2-ΔΔCt法計算。

表1 qPCR引物序列

1.2.2資料收集 收集SLE患者信息:(1)一般資料:年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、臨床癥狀(發(fā)熱脫發(fā)、紅斑、黏膜損傷、關(guān)節(jié)痛、尿檢異常、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀)、SLEDAI評分等。(2)實驗室指標(biāo):采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定檢測血小板(PLT)、白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(CRP);采用酶偶聯(lián)速率法檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr);采用魏氏法檢測檢測紅細胞沉降率(ESR);采用免疫印跡法檢測抗SSA抗體(SSA)、抗SSB抗體(SSB)、抗Sm抗體(Sm)、抗RNP抗體(RNP);采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定抗dsDNA抗體(dsDNA)、補體C3(C3)、C4。

2 結(jié) 果

2.1SLE患者與對照組一般資料與血清中TRAF3、miR-107表達水平的比較 SLE組血清中TRAF3表達水平顯著高于對照組,miR-107表達水平顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組年齡、性別、BMI比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 SLE患者與對照組一般資料與血清中TRAF3、miR-107表達水平的比較或n(%)]

2.2SLE患者輕中度組和重度組臨床資料及血清TRAF3、miR-107表達水平比較 相較于輕中度組,重度組發(fā)熱脫發(fā)比例、SLEDAI評分、IL-6、IL-1β、TNF-α、CRP、TRAF3顯著較高,miR-107、PLT、C3、C4表達水平顯著較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組間年齡、性別、BMI、紅斑、黏膜損傷、關(guān)節(jié)痛、尿檢異常、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、BUN、ESR、SCr、SSA、SSB、Sm、RNP、dsDNA比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 SLE患者輕中度組和重度組臨床資料及血清中TRAF3、miR-107表達水平的比較或n(%)]

2.3TRAF3、miR-107與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 SLE患者血清TRAF3與SLEDAI評分、IL-6、IL-1β、TNF-α呈正相關(guān)(r=0.680、0.537、0.556、0.574,P<0.05),與PLT呈負相關(guān)(r=-0.527,P<0.05),與C3、C4、CRP呈弱相關(guān)(r=-0.380、-0.337、0.245,P<0.05)。血清miR-107與SLEDAI評分、IL-6、IL-1β、TNF-α呈負相關(guān)(r=-0.692、-0.541、-0.563、-0.579,P<0.05),與PLT呈正相關(guān)(r=0.536,P<0.05),與C3、C4、CRP呈弱相關(guān)(r=0.392、0.351、-0.273,P<0.05)。

2.4TRAF3與miR-107的相關(guān)性 TRAF3和miR-107存在靶向關(guān)系,SLE患者血清TRAF3與miR-107呈負相關(guān)(r=-0.581,P<0.05)。見圖1。

2.5血清TRAF3、miR-107對重度SLE患者發(fā)生的預(yù)測價值 以SLE患者血清中TRAF3、miR-107表達水平為檢驗變量,以是否發(fā)生重度SLE為狀態(tài)變量(否=0,是=1)繪制ROC曲線,結(jié)果顯示血清中TRAF3、miR-107表達水平及二者聯(lián)合預(yù)測發(fā)生重度SLE的曲線下面積(AUC)分別為0.760、0.762、0.850,其中聯(lián)合預(yù)測AUC顯著高于二者單獨預(yù)測AUC(Z=1.269、1.201,P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 血清TRAF3、miR-107預(yù)測重度SLE患者發(fā)生的ROC曲線

表4 血清TRAF3、miR-107預(yù)測重度SLE患者發(fā)生的價值

3 討 論

SLE特征是由免疫細胞、因子和途徑的復(fù)雜相互作用而導(dǎo)致的不同臨床表現(xiàn),其發(fā)病機制包括核酸清除受損,Ⅰ型干擾素反應(yīng)增加,B細胞耐受失調(diào)導(dǎo)致自身抗體合成增加,免疫復(fù)合物形成和沉積,進而導(dǎo)致多器官損傷[9]。SLE的發(fā)病率相當(dāng)高,器官損傷是該疾病不可逆轉(zhuǎn)的后果,大約50%的SLE患者在接受診斷后10年內(nèi)會出現(xiàn)一定程度的損傷,包括肌肉骨骼系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟的損傷[10]。狼瘡性腎炎(LN)發(fā)生在40%～75%的SLE患者中,是SLE最嚴重的并發(fā)癥之一,也是SLE產(chǎn)生短期和長期并發(fā)癥的主要原因,在早期階段對SLE進行及時診斷、治療可有效改善患者身體狀況[11]。由于SLE具有異質(zhì)性,還沒有單一的臨床特征或?qū)嶒炇覚z查可以診斷它,因此,尋找有效可靠的生物標(biāo)志物來更好地對SLE進行監(jiān)測至關(guān)重要。

TRAF家族蛋白調(diào)節(jié)抗原、細胞因子和模式識別受體下游不同水平的NF-κB活化[12]。TRAF3是TRAF家族成員,是免疫的中樞調(diào)節(jié)因子,具有多種細胞功能,包括對B細胞活化、分化和存活的負調(diào)節(jié),例如TRAF3缺陷的B細胞表現(xiàn)出組成型NF-κB活化[13]。有研究報道,TRAF3在LN患者中表達水平升高,其可通過調(diào)節(jié)小鼠的Th17細胞和Treg細胞平衡以及NF-κB信號通路在LN中發(fā)揮作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn),SLE患者血清中TRAF表達水平顯著增高,重度組SLE患者血清中TRAF表達水平高于輕中度組,與上述研究結(jié)果相似。此外,SUN等[14]還發(fā)現(xiàn)TRAF3敲低減少了促炎細胞因子(IL-1β、TNF-α)的表達水平。SLEDAI評分為目前常用的評價SLE活動度的臨床指標(biāo),可反映SLE疾病嚴重程度,評分越高,疾病相應(yīng)越嚴重[15]。本研究進一步發(fā)現(xiàn),SLE患者的TRAF與SLEDAI評分、IL-6、IL-1β、TNF-α呈正相關(guān),與PLT呈負相關(guān)。提示SLE患者血清TRAF3表達水平與炎癥反應(yīng)有關(guān),且其表達水平高低可反映SLE的疾病活動度。此外,TRAF3預(yù)測發(fā)生重度SLE的AUC為0.760,表明TRAF3對重度SLE的發(fā)生具有一定的預(yù)測價值。

miRNA已被證實通過多種非常規(guī)途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達,在SLE的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[16]。有研究表明,LN患者尿液和腎組織中的miR-107表達水平顯著降低[17]。與本研究中SLE患者血清中miR-107表達水平顯著降低,重度組SLE患者血清中miR-107水平低于輕中度組結(jié)果類似。同時本文還發(fā)現(xiàn),血清miR-107與SLEDAI評分、IL-6、IL-1β、TNF-α呈負相關(guān),與PLT呈正相關(guān)。以上研究表明機體處于高炎狀態(tài),miR-107可作為SLE疾病活動度的血清指標(biāo)。此外,miR-107預(yù)測發(fā)生重度SLE的AUC為0.762,對重度SLE的發(fā)生有一定的預(yù)測價值。進一步研究發(fā)現(xiàn),TRAF3與miR-107聯(lián)合預(yù)測重度SLE發(fā)生的AUC和靈敏度相對于單一預(yù)測較高,且TRAF3與miR-107之間有靶向作用,提示二者在SLE中相互作用,均有望成為重度SLE發(fā)生的預(yù)測因子[13,18-19]。NF-κB信號通路在SLE中發(fā)揮重要作用,而miR-107和TRAF3均受NF-κB信號通路調(diào)控。因此猜測,本實驗結(jié)果可能與NF-κB信號通路有關(guān),具體機制還需進一步研究。

綜上所述,SLE患者血清TRAF3表達水平較高、miR-107較低,均與患者SLEDAI評分、IL-6、IL-1β、TNF-α、PLT有關(guān),能夠反映SLE疾病活動度。本研究結(jié)果顯示,對TRAF3、miR-107的研究可能有助于揭示SLE的發(fā)病機制,預(yù)測SLE病情進展,并篩選新的治療靶點。但本文未能深入分析TRAF3、miR-107與重度SLE患者發(fā)生的具體機制,后續(xù)可進一步進行研究。