張 穎,王 宇

長治市人民醫(yī)院病理科,山西長治 046000

食管癌是最具侵襲性的惡性腫瘤之一,被列為全球第六大常見的癌癥死亡原因[1]。流行病學(xué)研究表明,食管癌具有明顯的地理、種族和性別差異,食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是東亞地區(qū)最常見的食管癌組織學(xué)類型,在我國約90%的食管癌為ESCC[2-3]。與食管腺癌相比,ESCC惡性程度高、生物侵襲性強(qiáng),盡管近年來診斷與治療策略已取得了重大的進(jìn)展,但患者總體生存(OS)率仍然很低[4-5]。為了提高ESCC的早期診斷和改善患者預(yù)后,迫切需要尋找有價值的分子標(biāo)志物和新型治療靶點。

自噬是真核細(xì)胞降解、去除受損的細(xì)胞器或突變的細(xì)胞成分,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要途徑[6]。既往研究發(fā)現(xiàn),異常的細(xì)胞自噬與癌癥、阿爾茨海默病等多種疾病有關(guān)[7-9]。隨著腫瘤的惡性增殖,癌細(xì)胞由于營養(yǎng)缺乏,可以通過自噬獲得能量并降解其內(nèi)部成分以支持腫瘤的增殖和代謝。作為第一個自噬特異性基因,Beclin-1在細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[10-11]。目前,多項研究顯示Beclin-1在非小細(xì)胞肺癌、胃癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤組織中存在表達(dá)缺失,并參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-14]。然而,Beclin-1作為ESCC患者預(yù)后標(biāo)志物的臨床價值尚有待進(jìn)一步研究。N-myc下游調(diào)控基因2(NDRG2)是N-myc下調(diào)基因家族的成員之一,該家族的蛋白質(zhì)以α/β水解酶折疊為主要特征[15]。越來越多的證據(jù)表明,NDRG2作為一種腫瘤抑制因子,在癌細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[16-17]。此外,NDRG2的表達(dá)抑制被報道與多種腫瘤的治療結(jié)果及不良預(yù)后密切相關(guān)[18-19]。有研究表明,上調(diào)NDRG2可抑制食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等的生物學(xué)行為[20]。然而,NDRG2在ESCC患者中的潛在預(yù)后價值仍不清楚。因此,本研究的主要目的是通過免疫組織化學(xué)染色檢測Beclin-1與NDRG2在ESCC組織樣本中的表達(dá)水平,并分析兩者與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,旨在探討兩種蛋白作為ESCC預(yù)后分子標(biāo)志物的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選擇2015年6月至2018年10月在本院胸外科接受食管癌根治性切除手術(shù)的121例ESCC患者作為研究對象,前瞻性收集其手術(shù)切除標(biāo)本(包括未受腫瘤侵犯的癌旁正常組織)及臨床病理資料,其中男63例(52.1%)、女58例(47.9%),平均年齡為(67.3±11.4)歲,平均腫瘤最大徑(5.41±1.93) cm,高、中、低分化癌分別占42.1%(51/121)、38.0%(46/121)和19.9%(24/121);根據(jù)第8版食管癌TNM分期,Ⅱ～Ⅲ期病例占所有患者的54.5%。所有入選本研究的患者均應(yīng)符合以下條件:(1)ESCC的診斷經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)證實;(2)無肺、骨、肝等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;(3)臨床病理資料完整;(4)隨訪時間大于1個月。

本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn),所有組織樣本與臨床病理資料均在患者知情同意的情況下采集。

1.2免疫組化染色與結(jié)果判讀 將手術(shù)切除的ESCC腫瘤組織經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋后,制成厚度為4 μm的連續(xù)切片,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色與分析。組織切片用二甲苯脫蠟,在濃度遞增的乙醇中水化。使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后,置于pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中微波加熱孵育20 min,用以抗原修復(fù)。隨后,在切片上加入3%的H2O2溶液,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS沖洗后,將組織切片與1∶200比例稀釋的Beclin-1(產(chǎn)品編號:SC11427,Santa Cruz公司,美國)與NDRG2一抗混合,并在4 ℃下孵育過夜。次日,將組織切片與辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗繼續(xù)孵育30 min。使用二氨基聯(lián)苯胺顯色劑處理所有載玻片,并以蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水,中性樹膠封片固定。

由兩位高年資病理科醫(yī)生對組織切片進(jìn)行獨立評估,根據(jù)Beclin-1、NDRG2的染色強(qiáng)度和陽性染色細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度的評分標(biāo)準(zhǔn)如下:陰性為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕色為3分。陽性染色細(xì)胞數(shù)量的評分標(biāo)準(zhǔn):在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個高倍視野,每個視野計數(shù)200個細(xì)胞,陽性染色細(xì)胞比例<5%為0分,比例5%～25%為1分,比例>25%～50%為2分,比例>50%～75%為3分,陽性染色細(xì)胞比例>75%為4分。Beclin-1、NDRG2蛋白免疫組化染色的最終得分由染色強(qiáng)度與陽性染色細(xì)胞比例的分?jǐn)?shù)乘積計算得出。將≤4分者納入Beclin-1或NDRG2低表達(dá)組(陰性表達(dá)),>4分者分入Beclin-1或NDRG2高表達(dá)組(陽性表達(dá))。如果兩位評價者的結(jié)果有沖突,則由第3位病理學(xué)家進(jìn)行復(fù)核,并協(xié)商得出相對一致的結(jié)果。

1.3隨訪 本科負(fù)責(zé)對所有研究對象進(jìn)行定期隨訪,通過查閱門診或住院病例及電話探訪等方式了解患者的生存狀態(tài)。生存分析的主要研究結(jié)局為OS,所有患者的OS從手術(shù)當(dāng)天開始計算,直至因任何原因死亡或最后一次隨訪作為觀察終點。截至末次隨訪,全組無失訪病例,中位隨訪時間為35.0個月。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、處理和統(tǒng)計分析,采用Pearson相關(guān)評估Beclin-1、NDRG2表達(dá)與臨床病理變量之間的相關(guān)性。高、低表達(dá)組ESCC患者的生存概率通過Kaplan-Meier曲線計算,Log-rank檢驗用于生存分析的比較。采用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行單因素和多因素分析,確定ESCC患者的獨立預(yù)后因子,在單因素分析中的顯著變量被納入多因素分析進(jìn)一步評估。風(fēng)險比(HR)和95%置信區(qū)間(CI)用于評估測試參數(shù)對死亡事件的影響。上述所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Beclin-1、NDRG2在ESCC組織中的表達(dá)及其臨床意義 Beclin-1和NDRG2蛋白在ESCC組織中的免疫組化表達(dá)結(jié)果如圖1所示,Beclin-1、NDRG2的陽性表達(dá)主要定位于正常食管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。在檢測的121例樣本中,Beclin-1蛋白在ESCC腫瘤組織中的陽性表達(dá)率為40.5%(49/121),明顯低于癌旁組織的59.5%(68/121),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.973,P=0.015)。NDRG2蛋白在ESCC組織中的陽性表達(dá)率亦明顯低于癌旁組織,分別為46.3%(56/121)和61.2%(74/121),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.385,P=0.020)。免疫組化染色的結(jié)果證實與癌旁組織相比,Beclin-1和NDRG2蛋白在ESCC組織中呈明顯低表達(dá)。

注:A和C為Beclin-1和NDRG2蛋白在癌旁組織中呈高表達(dá);B和D為ESCC組織中呈低表達(dá)。

分析Beclin-1和NDRG2表達(dá)與ESCC臨床病理特征的關(guān)系,如表1、表2所示,Beclin-1低表達(dá)者有更為頻繁的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=6.158,P=0.013)和更為進(jìn)展的TNM分期(χ2=4.538,P=0.033),而NDRG2低表達(dá)與更晚的T分期(χ2=6.607,P=0.010)和TNM分期(χ2=5.744,P=0.017)相關(guān)。然而,未發(fā)現(xiàn)Beclin-1和NDRG2表達(dá)與患者年齡、性別、組織學(xué)分化或腫瘤最大徑之間存在顯著性關(guān)系(P>0.05)。

表1 Beclin-1表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表2 NDRG2表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表3 ESCC患者預(yù)后因素的單、多變量Cox回歸分析

2.2Beclin-1、NDRG2表達(dá)在ESCC患者中的預(yù)后意義 在這個隊列中,所有ESCC患者的3年和5年OS率分別為51.0%和31.4%,Kaplan-Meier生存曲線顯示Beclin-1低表達(dá)與高表達(dá)患者的3年OS率分別為44.3%和60.9%,Beclin-1低表達(dá)與ESCC患者不良預(yù)后顯著相關(guān)(χ2= 5.696,P=0.017),如圖2A所示。此外,NDRG2低表達(dá)者的預(yù)后亦明顯劣于NDRG2高表達(dá)者,3年OS率分別為43.9%和59.2%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=9.004,P=0.003),如圖2B所示。

圖2 Beclin-1、NDRG2表達(dá)與ESCC患者OS的關(guān)系

單因素Cox分析結(jié)果顯示,組織學(xué)分化(P=0.002)、TNM分期(P<0.001)、Beclin-1(P=0.020)及NDRG2低表達(dá) (P=0.004)與ESCC患者的低OS率顯著相關(guān)。在多因素Cox回歸模型中對這些參數(shù)做進(jìn)一步調(diào)整,結(jié)果證實Beclin-1低表達(dá)(HR=1.727,95%CI:1.017～2.934,P=0.043)、NDRG2低表達(dá)(HR=1.671,95%CI:1.023～2.730,P=0.040)及TNM Ⅱ～Ⅲ期(HR=3.823,95%CI:2.133～6.852,P<0.001)是ESCC患者預(yù)后不良的的獨立預(yù)測因素。

3 討 論

自噬在保護(hù)和殺傷腫瘤細(xì)胞方面扮演著雙重作用,已成為目前腫瘤學(xué)研究的一個重要方向[21-22]。Beclin-1是細(xì)胞自噬過程中的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,其表達(dá)變化也被報道與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在本研究中,本文通過免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)Beclin-1在ESCC組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織,其低表達(dá)與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),是ESCC患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測因素。Beclin-1異常表達(dá)及其在腫瘤癌變、進(jìn)展中的作用已逐漸被認(rèn)識,多數(shù)研究表明,Beclin-1通過細(xì)胞自噬維持基因組的穩(wěn)定性,在癌變的早期階段顯示出抑制作用。據(jù)報道,研究人員在約58.3%的卵巢癌、60.0%的胃癌和70.0%的肺癌中觀察到了Beclin-1的表達(dá)缺失[13,23-24]。ALABIAD等[23]的研究表明,Beclin-1在漿液性卵巢癌組織中的低表達(dá)與低分化癌和晚期腫瘤顯著相關(guān),是肝癌、乳腺癌等患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良的預(yù)測標(biāo)志。這些研究結(jié)果表明,Beclin-1在包括ESCC在內(nèi)的惡性腫瘤中低表達(dá),可能引起細(xì)胞自噬活性受到抑制,腫瘤細(xì)胞失去自噬能力而逐漸獲得逃避細(xì)胞凋亡和增殖、侵襲的能力,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。GUO等[25]報道Beclin-1表達(dá)缺失明顯加快了食管癌細(xì)胞在體外的增殖速度,提高了細(xì)胞的抗凋亡與遷移能力。因此,以Beclin-1作為治療靶點抑制ESCC的發(fā)生和進(jìn)展,或許可以為改善治療結(jié)果和延長患者生存提供方向。

NDRG2參與了細(xì)胞增殖、分化等多種病理生理過程,作為另一個新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子同樣備受關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn),NDRG2在多種人類癌癥中表達(dá)下調(diào),與腫瘤的侵襲性特征與不良預(yù)后密切相關(guān)[26-28]。本研究的結(jié)果顯示,NDRG2在ESCC樣本中的表達(dá)明顯低于癌旁組織,其低表達(dá)與更晚的T分期、TNM分期有關(guān),提示NDRG2表達(dá)缺失可能在ESCC的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)NDRG2低表達(dá)患者的OS率明顯低于高表達(dá)者,NDRG2是ESCC患者的獨立預(yù)后因子。YANG等[20]的研究證實了本文的推測,發(fā)現(xiàn)食管癌細(xì)胞中的NDRG2表達(dá)明顯低于正常食管上皮細(xì)胞,而上調(diào)NDRG2表達(dá)可顯著減少細(xì)胞在體外形成集落的數(shù)量,抑制細(xì)胞的侵襲、遷移能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)動物實驗也表明NDRG2對腫瘤生長具有顯著抑制作用。此外,有研究報道了NDRG2表達(dá)缺失對EMT的誘導(dǎo)作用,NDRG2可通過影響E-鈣黏蛋白、波形蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力[29-30]。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持NDRG2表達(dá)缺失參與了ESCC的發(fā)生發(fā)展,揭示了其作為ESCC患者預(yù)后分子標(biāo)志與治療靶點的潛在價值。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1和NDRG2在ESCC樣本中存在明顯低表達(dá),兩者的表達(dá)水平與T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān),可作為ESCC患者預(yù)后不良的預(yù)測分子。這些信息有助于進(jìn)一步探索Beclin-1和NDRG2蛋白在ESCC發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制,并為分子靶向治療提供潛在靶點。