朱曉艷,熊 麗,郭麗霞,杜寶忠,張勇倉(cāng)△

1.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心,西藏拉薩 850000;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,四川成都 610041;3.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,西藏拉薩 850000

艱難梭菌感染(CDI)已成為醫(yī)療保健相關(guān)腹瀉的常見(jiàn)病因,占成人抗菌藥物相關(guān)性腹瀉的13%～28%[1]。臨床表現(xiàn)包括無(wú)癥狀攜帶、輕度腹瀉、暴發(fā)性感染性結(jié)腸炎,偶可危及生命。引起CDI的病原體艱難梭菌是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭陽(yáng)性芽孢桿菌,該菌的主要毒力因子是腸毒素A(TcdA)和細(xì)胞毒素B(TcdB),以及部分高毒力菌株攜帶的二元毒素(CDT)。

病原微生物的分子流行病學(xué)研究是確定和控制疾病暴發(fā)或流行的關(guān)鍵,多位點(diǎn)序列分型(MLST)可用于全球流行病學(xué)微生物分型和細(xì)菌種群研究。通過(guò)檢索2013年1月之后公開(kāi)發(fā)表在PubMed上的有關(guān)中國(guó)大陸艱難梭菌分子流行病學(xué)的相關(guān)文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)我國(guó)目前對(duì)CDI的分子流行病學(xué)研究主要集中在北京、上海、浙江等地區(qū),西南地區(qū)僅檢索到兩項(xiàng)相關(guān)研究報(bào)道[2-3]。為了更好地了解本地區(qū)CDI情況,本文通過(guò)調(diào)查研究四川某大型綜合醫(yī)院住院腹瀉患者的感染情況,了解本院CDI情況,同時(shí)采用MLST分型技術(shù)對(duì)分離的艱難梭菌進(jìn)行分子流行病學(xué)研究,為我國(guó)西南地區(qū)CDI流行病學(xué)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為CDI防治和院內(nèi)感染控制提供參考。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2020年5月至2021年8月四川某大型綜合醫(yī)院住院腹瀉患者(腹瀉次數(shù)≥3次/天)的糞便標(biāo)本810份,采用酶免疫分析(EIA)法檢測(cè)谷氨酸脫氫酶(GDH)及艱難梭菌毒素A/B(CDAB)。收集CDI組及部分非CDI患者(non-CDI組)臨床資料,包括年齡、性別、住院時(shí)間、合并癥、抗菌藥物使用情況,以及部分實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果。收集GDH陽(yáng)性患者的糞便標(biāo)本,-20 ℃儲(chǔ)存待培養(yǎng)。

1.2儀器與試劑 GDH及CDAB抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Alere公司,環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂(CCFA)培養(yǎng)平板購(gòu)自上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司,布氏瓊脂、脫纖維羊血、氯血紅素、維生素K1、Etest條購(gòu)自青島海博生物公司,厭氧產(chǎn)氣包采用法國(guó)BioMérieux公司,細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技公司,PCR Taq酶、引物合成及測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,質(zhì)譜儀購(gòu)自Bruker公司,PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司,凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3菌株分離培養(yǎng)及鑒定 將GDH陽(yáng)性糞便標(biāo)本接種于CCFA平板,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,挑取淡黃色、扁平、邊緣不整齊的“油煎蛋”樣菌落進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸-電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)鑒定,用哥倫比亞血平板分離、傳代培養(yǎng)鑒定為艱難梭菌的菌落,-80 ℃保存樣本。

1.4毒素基因檢測(cè) 依據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA,樣本保存于-20 ℃冰箱備用。參照LEMEE[4]及GRIFFITHS[5]的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法檢測(cè)艱難梭菌毒素基因tcdA、tcdB,序列如表1所示。

表1 艱難梭菌基因擴(kuò)增引物信息

PCR反應(yīng)體系25 μL:2×Taq PCR預(yù)混液12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL,DNA模板1.5 μL,ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后成像,觀(guān)察結(jié)果并記錄。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,本研究中患者年齡、住院時(shí)間、白細(xì)胞計(jì)數(shù)等計(jì)量資料為非正態(tài)分布,采用秩和檢驗(yàn);性別、抗菌藥物種類(lèi)、是否合并低蛋白血癥等計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6多位點(diǎn)序列分型 參考GRIFFITHS[5]建立的MLST分型方法,擴(kuò)增7個(gè)管家基因(adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi),引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系25 μL:2×Taq PCR預(yù)混液12.5 μL,管家基因上下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL,DNA模板1.5 μL,ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 40 s,72 ℃ 60 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后成像,觀(guān)察結(jié)果,將與預(yù)期條帶大小一致的樣品送生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果上傳數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmlst.org)獲得等位基因號(hào)及ST型。使用MEGA X構(gòu)建所得艱難梭菌的親緣進(jìn)化樹(shù)[6]。

1.7藥敏試驗(yàn) 將萬(wàn)古霉素、甲硝唑、莫西沙星的藥物Etest條貼在強(qiáng)化布氏瓊脂平板(含有1 μg /mL維生素K1,5 μg/mL氯血紅素和5%去纖維羊血)上,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后讀取最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)參照歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(EUCAST 2017歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn))及美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(2021 CLSI-M100)折點(diǎn)。以艱難梭菌ATCC 700057為質(zhì)控菌株。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本來(lái)源及艱難梭菌分離培養(yǎng)情況 810例糞便標(biāo)本中檢出GDH陽(yáng)性標(biāo)本163例,163例標(biāo)本分離培養(yǎng)出136株艱難梭菌,艱難梭菌檢出率為16.79%(136/810)。136例患者主要來(lái)自13個(gè)科室檢出率,排列前5位依次為:感染科23例(16.91%)、血液內(nèi)科20例(14.71%)、消化內(nèi)科19例(13.97%)、老干科17例(12.50%)、ICU 16例(11.76%)。各科室艱難梭菌檢出率見(jiàn)表2,ICU檢出率高達(dá)28.07%,腎臟內(nèi)科次之,為26.19%。

2.2毒素基因檢測(cè)結(jié)果 136株艱難梭菌毒素基因檢測(cè)結(jié)果顯示,產(chǎn)毒菌株79株,其中(tcdA+tcdB+)65株,占47.79%(65/136),(tcdA-tcdB+)14株,占10.29%(14/136),非產(chǎn)毒菌株(tcdA-tcdB-)57株,占41.91%(57/136)。根據(jù)毒素基因檢測(cè)結(jié)果,CDI陽(yáng)性率為9.75%(79/810)。各科室CDI陽(yáng)性率見(jiàn)表2。腎臟內(nèi)科最高,為19.05%,老干科次之,為15.07%。

2.3CDI患者一般情況及危險(xiǎn)因素分析 結(jié)合79例CDI患者臨床資料,男48例(60.76%),平均年齡(56.85±21.34)歲;女31例(39.24%),平均年齡(57.72±20.35)歲。不同年齡段CDI發(fā)生率分別為:<18歲5.41%(2/37),18～35歲5.41%(8/148),>35～55歲3.72%(7/188),>55～65歲4.92%(6/122),>65歲7.94%(25/315)。不同年齡段CDI發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.232,P=0.375)。79例CDI患者主要來(lái)自8個(gè)科室,排列前5位依次為:感染科、老年科、血液內(nèi)科、消化內(nèi)科、腎內(nèi)科,見(jiàn)表2。

表2 各科室艱難梭菌檢出率及毒素基因型分布情況

CDI組79例與non-CDI組136例臨床資料及危險(xiǎn)因素統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,合并腎臟疾病的患者更易感染艱難梭菌(P<0.05),而合并心血管疾病或糖尿病患者并不是CDI的高危因素(P>0.05)。性別、年齡、抗菌藥物等藥物暴露在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果顯示,CDI組糞便隱血率(87.34%)顯著高于對(duì)照組(56.62%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CRP、血清清蛋白、總膽汁酸等其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 艱難梭菌感染組與非感染組統(tǒng)計(jì)學(xué)比較或n(%)]

2.4多位點(diǎn)序列分型 采用PCR方法擴(kuò)增136株艱難梭菌的7個(gè)管家基因,共獲得29個(gè)ST型。排列前5的型別有ST39 30株(22.00%)、ST54 20株(15.00%)、ST3 19株(14.00%)、ST37 11株(8.00%)ST35 10株(7.00%),見(jiàn)圖1。分析該5個(gè)ST型在各科室的分布情況,發(fā)現(xiàn)ICU與感染科各有8株ST39,均占26.70%(8/30),余ST型在各科室分布無(wú)規(guī)律。

圖1 136株艱難梭菌MLST型分布圖

采用MEGA軟件構(gòu)建136株艱難梭菌的進(jìn)化關(guān)系圖,見(jiàn)圖2。Clade1為本研究難難梭菌主要分支。本研究發(fā)現(xiàn)1株ST11,該菌株來(lái)自消化內(nèi)科,追溯消化內(nèi)科該時(shí)段未發(fā)現(xiàn)ST11型別的流行趨勢(shì)。

注:黑色分枝代表Clade1;黃色圓圈代表Clade3;藍(lán)色分枝代表Clade4;紅色分枝代表Clade5;圈外數(shù)字代表菌株編號(hào);圈內(nèi)數(shù)字代表進(jìn)化樹(shù)Boostrap檢驗(yàn)值,>50為結(jié)果可信。

2.5藥敏試驗(yàn) 43株艱難梭菌對(duì)3種抗菌藥物的MIC結(jié)果見(jiàn)表4。所有菌株對(duì)萬(wàn)古霉素和甲硝唑均敏感,對(duì)莫西沙星耐藥率為26.83%。其中非產(chǎn)毒株有4株對(duì)莫西沙星耐藥,產(chǎn)毒株中有7株對(duì)莫西沙星耐藥,非產(chǎn)毒株對(duì)莫西沙星耐藥率33.3%,較產(chǎn)毒株22.6%高,但兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.525,P=0.467)。

表4 43株艱難梭菌藥敏結(jié)果及MIC范圍(mg/L)

3 討 論

過(guò)去十年,CDI被認(rèn)為是北美和歐洲成年人醫(yī)院相關(guān)性腹瀉的主要原因,因而逐漸受到重視。由于我國(guó)對(duì)CDI的研究起步較晚,加之艱難梭菌對(duì)培養(yǎng)條件要求較為嚴(yán)苛,目前對(duì)CDI的流行病學(xué)研究地域分散,未形成完整的全國(guó)感染情況報(bào)告。本研究對(duì)810例住院腹瀉患者進(jìn)行評(píng)估,了解本院CDI的陽(yáng)性率、高危因素、分子特征等情況,補(bǔ)充該地區(qū)對(duì)CDI的研究數(shù)據(jù),為醫(yī)院內(nèi)感染控制及臨床診治提供數(shù)據(jù)支撐。

美國(guó)疾控中心一項(xiàng)多中心研究顯示,CDI陽(yáng)性率為7.00%～20.00%[7]。中國(guó)一項(xiàng)Meta分析顯示,腹瀉患者中產(chǎn)毒艱難梭菌發(fā)病率為14.00%[8]。本研究中CDI陽(yáng)性率為9.75%,低于云南地區(qū)報(bào)道的14.30%[3],分析可能為控制抗菌藥物使用的效果。ICU患者具有大量使用抗菌藥物、高齡、住院時(shí)間長(zhǎng)、并發(fā)癥較多等特點(diǎn),因此CDI發(fā)生率較高。本研究ICU醫(yī)療單元艱難梭菌檢出率雖然較高,但產(chǎn)毒菌株分離僅5株(8.77%),低于既往研究的17.80%[9]。

既往研究報(bào)道的CDI危險(xiǎn)因素包括:高齡、抗菌藥物和(或)質(zhì)子泵抑制劑暴露、住院時(shí)間長(zhǎng)、合并腎臟等慢性疾病。本研究發(fā)現(xiàn),合并腎臟疾病患者更易感染艱難梭菌,考慮慢性腎臟疾病可能導(dǎo)致抗菌排泄不良,血液中藥物濃度過(guò)高,從而導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[10]。高齡及使用質(zhì)子泵抑制劑不是本研究中CDI的危險(xiǎn)因素。有研究指出CDI發(fā)生的部分原因可能是患者使用抗菌藥物導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)變化,而不是高齡[11]。實(shí)驗(yàn)室檢查、糞隱血在CDI患者占比明顯較高,考慮CDI導(dǎo)致腸黏膜變性、壞死引起。

隨著CDI抗菌治療和新治療方法如糞便微生物菌群移植(FMT)的研究日益增多,2021年歐洲臨床微生物學(xué)和傳染病學(xué)會(huì)(ESCMID)在《成人艱難梭菌治療指南》中指出將非達(dá)霉素和萬(wàn)古霉素作為治療CDI的一線(xiàn)藥物,而不再將甲硝唑作為首選藥物[12]。由于非達(dá)霉素未在我國(guó)上市,因此本研究采用萬(wàn)古霉素及甲硝唑進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。有研究已發(fā)現(xiàn)甲硝唑耐藥菌株,一項(xiàng)研究指出耐藥菌株對(duì)甲硝唑和萬(wàn)古霉素的耐藥率分別為1.80%和0.40%[13]。我國(guó)一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),艱難梭菌對(duì)甲硝唑具有異質(zhì)耐藥性,且該類(lèi)型的耐藥性只出現(xiàn)在第一代培養(yǎng)菌株中,幾代后就會(huì)消失[14]。由此可知,艱難梭菌對(duì)這兩種藥物的耐藥性在我國(guó)和其他國(guó)家不盡相同。本研究與國(guó)內(nèi)多數(shù)研究一致,未發(fā)現(xiàn)萬(wàn)古霉素及甲硝唑耐藥菌株。雖然莫西沙星不用于治療CDI,卻是臨床常用抗菌藥物。臨床上在使用該類(lèi)抗菌藥物后出現(xiàn)腹瀉要警惕CDI[15]。本研究產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株對(duì)莫西沙星耐藥率分別為22.58%、33.33%,低于德國(guó)[16]與中國(guó)上海地區(qū)[17]的相關(guān)研究報(bào)道。

本研究136株艱難梭菌的優(yōu)勢(shì)型別為ST39、ST54、ST3和ST37,與其他相關(guān)報(bào)道[17-19]具有一定差異,說(shuō)明艱難梭菌的優(yōu)勢(shì)ST型具有地域差異性。ST37毒素基因型別為tcdA-tcdB+,對(duì)應(yīng)的核糖體分型為RT017,該型別曾在全球多次報(bào)道,以及與之相關(guān)的非暴發(fā)病例,特別是在亞洲[20]。該基因型在亞洲許多國(guó)家被報(bào)道為優(yōu)勢(shì)產(chǎn)毒菌株之一,在我國(guó)也普遍存在[20]。本研究分離出11株ST37型艱難梭菌,其在各科室呈散在分布。有報(bào)道指出,ST37 (RT017)引起的臨床癥狀與高毒力株ST1(RT027)相似[21],且這些菌株對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性大于其他ST型,易導(dǎo)致復(fù)雜、嚴(yán)重的CDI[22],因此對(duì)其防控不容忽視。

綜上所述,艱難梭菌的分子型別具有地域差異性,合并腎臟疾病的患者更易感染艱難梭菌,雖然目前艱難梭菌對(duì)常用抗菌藥物均較敏感,但為預(yù)防CDI的發(fā)生,臨床醫(yī)生需針對(duì)患有慢性腎臟疾病等慢性基礎(chǔ)疾病的患者控制抗菌藥物的使用。由于我國(guó)對(duì)艱難梭菌的研究較為分散,本研究可為我國(guó)西南地區(qū)CDI流行病學(xué)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。