樊青曼,劉士霞,高 娟,穆艷順,張冬婕,劉衛(wèi)華

1.華北石油管理局總醫(yī)院兒科,河北任丘 062552;2.遷西縣人民醫(yī)院兒科,河北唐山 064300;3.肅寧縣人民醫(yī)院兒科,河北滄州 062350

目前用于臨床目的的大多數(shù)哮喘生物標(biāo)志物均從血液、呼氣或尿液中取樣,而誘導(dǎo)痰僅在專業(yè)中心可以使用[1]。呼出氣冷凝物(EBC)收集簡單,安全,無創(chuàng)且高度可重復(fù),并且可以評(píng)估氣道炎癥的生物標(biāo)志物,越來越多地被用作生物標(biāo)志物的檢測指標(biāo)[2]。EBC中的物質(zhì)可以被測量,并且一些研究已經(jīng)集中在非揮發(fā)性有機(jī)化合物,包括近年研究的微小RNA(miRNA)上[3]。因此,尋找EBC中新型生物標(biāo)志物有助于哮喘兒童的診斷和個(gè)性化治療。有研究發(fā)現(xiàn),11種miRNA(let7a-5p、miR-21-5p、miR-126-3p、miR-133a-3p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-155-5p、miR-221-3p、miR-328-3p、miR-1248和miR-423-3p)與哮喘發(fā)生具有高度相關(guān)性[4-10]?；诖?本研究旨在探討EBC中這11個(gè)miRNA在哮喘患兒中的相對表達(dá)水平,并評(píng)估其作為診斷哮喘患兒生物標(biāo)志物的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年3月至2022年12月華北石油管理局總醫(yī)院(下稱本院)收治的7～12歲哮喘患兒80例作為哮喘組,其中男51例,女29例,平均年齡(8.58±2.34)歲,平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(24.66±3.44)kg/m2。并選取同期同年齡段健康志愿者80例作為對照組,其中男49例,女31例,平均年齡(8.39±3.05)歲,平均BMI為(24.49±3.28)kg/m2。兩組受試者性別、年齡和BMI比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。使用呼氣式空氣冷凝系統(tǒng)(便攜式TurboDECCS)從兩組受試者中收集EBC樣本。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)哮喘使用基于實(shí)驗(yàn)陽性支氣管擴(kuò)張的金標(biāo)準(zhǔn)定義,定義為吸入400 μg沙丁胺醇后第1秒用力呼氣容積(FEV1)至少增加12%或超過200 mL;(2)自我報(bào)告有哮喘癥狀的醫(yī)學(xué)診斷(喘息、呼吸困難或干咳)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有智力或認(rèn)知障礙者;(2)合并有甲狀腺疾病及其他內(nèi)分泌疾病者;(3)合并其他心、肝、腎等嚴(yán)重慢性疾病者;(4)合并惡性腫瘤者;(5)對調(diào)查不配合或拒絕者。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2呼氣凝結(jié)水采集及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測EBC中相關(guān)miRNA 根據(jù)ROSIAS公布的EBC收集方法[11],從兩組受試者中收集EBC樣本,使用呼氣式空氣冷凝系統(tǒng)。收集前將設(shè)備冷卻到0 ℃。正常呼吸至少15 min,戴鼻夾獲取EBC樣本。通常樣本量在800～1 500 μL之間。體積的變化與兒童肺部的潮氣量和分鐘體積相關(guān)。收集后,將樣品儲(chǔ)存-35 ℃的加蓋玻璃管中,直至進(jìn)行分析。程序在層流柜下進(jìn)行,以確保環(huán)境受控,避免環(huán)境空氣污染。根據(jù)之前的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4-10]選擇let7a-5p、miR-21-5p、miR-126-3p、miR-133a-3p、miR-145-5p、miR-146a-5p、miR-155-5p、miR-221-3p、miR-328-3p、miR-1248和miR-423-3p的11種特異性miRNA用于分析,其中l(wèi)et7a-5p為內(nèi)參對照。用硫氰酸胍酚氯仿萃取法從0.5 mL EBC樣品中提取總的RNA。在RNA提取之前,EBC樣品摻入來自Exiqon(Qiagen)的合成UniSp6 RNA用于提取控制目的。根據(jù)制造商的說明書操作,使用小RNA試劑盒(Agilent),用Bioanalyzer(Agilent Technologies)對提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量控制。采用鎖定核酸(LNA)試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR 技術(shù)檢測。采用Universal cDNA synthesis kit Ⅱ(Exiqon)將從每個(gè)EBC樣品中提取的RNA一式兩份逆轉(zhuǎn)錄。每個(gè)RT反應(yīng)使用10 μL RNA溶液。將得到的cDNA稀釋10倍,并使用miRNA特異性LNA寡核苷酸和ExiLENT SYBR Green master mix(Exiqon)在10 μL反應(yīng)中通過qPCR進(jìn)行定量。使用StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)在兩步程序下進(jìn)行qPCR檢測:95 ℃ 10 s,60 ℃ 1 min,45個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt法評(píng)估樣本中miRNA的相對表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用R 3.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t檢驗(yàn)分析兩組EBC中相關(guān)miRNA的表達(dá)水平。應(yīng)用主成分分析法(PCA)和因子分析對miRNAs進(jìn)行聚類分析。應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線及曲線下面積(AUC)分析EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p對哮喘患兒的臨床診斷價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1對照組和哮喘組EBC中相關(guān)miRNA的相對表達(dá)水平 哮喘組EBC中miR-21-5p、miR-133-3p的相對表達(dá)水平低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。哮喘組EBC中miR-328-3p、miR-155-5p的相對表達(dá)水平高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 對照組和哮喘組EBC中相關(guān)miRNA的表達(dá)水平

2.2PCA和因子分析對照組和哮喘組受試人員EBC中相關(guān)miRNA 將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p進(jìn)行PCA,發(fā)現(xiàn)根據(jù)對照組和哮喘組EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p的相對表達(dá)水平可以形成兩個(gè)獨(dú)立亞群,即體檢健康者和哮喘患兒,見圖1。因子分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21-5p、miR-155-5p可以聚成一個(gè)亞類(因子載荷分別為0.93和0.90),miR-133-3p、miR-328-3p聚成一個(gè)亞類(因子載荷分別為0.86和0.80),見圖2。

圖1 PCA和因子分析對照組和哮喘組受試人員EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p

圖2 因子分析對照組和哮喘組受試人員EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p

2.3EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p對哮喘的診斷效能 為了評(píng)估EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p在哮喘患兒與健康兒童中的診斷價(jià)值,繪制80例哮喘患兒和80例健康兒童的ROC曲線(圖3)。以miR-133-3p的陽性臨界值,其診斷靈敏度為93.77%,特異度為94.01%。以miR-328-3p的陽性臨界值,其診斷靈敏度為92.41%,特異度為91.07%。以miR-21-5p的陽性臨界值,其診斷靈敏度為95.23%,特異度為91.48%。以miR-155-5p的陽性臨界值,其診斷靈敏度為92.57%,特異度為91.35%,見圖3和表2。

圖3 健康兒童與哮喘患兒EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p的ROC曲線

表2 EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p鑒別診斷健康兒童與哮喘患兒的AUC、靈敏度、特異度和約登指數(shù)

2.4miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p聯(lián)合對哮喘患兒的診斷價(jià)值 患有哮喘為真陽性,未患有哮喘的為真陰性。miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p聯(lián)合對哮喘患兒的診斷靈敏度為97.50%(78/80),特異度為92.50%(74/80),準(zhǔn)確度為95.00%(152/160),見表3。

表3 miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p聯(lián)合診斷對哮喘患兒的診斷價(jià)值(n)

3 討 論

哮喘是兒童常見的慢性疾病之一,給患兒及家庭帶來了健康威脅和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。在臨床實(shí)踐中,基于肺活量測定法對診斷兒童哮喘的敏感性很低,對診斷兒童哮喘的準(zhǔn)確客觀測試的需求仍未得到滿足[12]。本研究結(jié)果顯示哮喘患兒與健康兒童EBC中的miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p的靈敏度分別為93.77%、92.41%、95.23%、92.57%,特異度分別為94.01%、91.07%、91.48%、91.35%。miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p聯(lián)合對哮喘患兒的診斷靈敏度為97.50%,特異度為92.50%,準(zhǔn)確度為95.00%,顯示了較好的診斷效能。

呼氣凝結(jié)物是一種無創(chuàng)收集的生物流體,含有揮發(fā)性和非揮發(fā)性化合物,在肺部疾病中可能會(huì)發(fā)生改變[13]。PINKERTON等[14]報(bào)道,EBC中的miR-21-5p、miR-133-3p、miR-155-5p和miR-328-3p在哮喘成人患者中明顯降低。本研究發(fā)現(xiàn),哮喘組EBC中miR-21-5p和miR-133-3p的相對表達(dá)水平低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與PINKERTON等[14]報(bào)道一致。但是miR-328-3p和miR-155-5p的相對表達(dá)水平高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些研究結(jié)果的差異可能與年齡組及樣本量有關(guān)。根據(jù)對照組和哮喘組EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p的相對表達(dá)水平可以形成兩個(gè)獨(dú)立亞群,即體檢健康者和哮喘患兒。因子分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21-5p、miR-155-5p可以聚成一個(gè)亞類(因子載荷分別為0.93和0.90),miR-133-3p、miR-328-3p聚成一個(gè)亞類(因子載荷分別為0.86和0.80)。因子分析中的因子負(fù)荷可以解釋為miRNAs對聚類有顯著貢獻(xiàn)的相關(guān)系數(shù)。因此,miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p可以很好地區(qū)分哮喘患兒和健康兒童。

一些關(guān)于miRNA表達(dá)譜的研究報(bào)告了miRNA在哮喘調(diào)節(jié)中的重要性[15]。miR-155-5p在哮喘兒童的血漿中明顯增加,是血漿中的生物標(biāo)志物[16]。Th1/Th2平衡對哮喘的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[17]。miR-21-5p可以促進(jìn)Th2并減弱Th1途徑,而輕度哮喘患者中miR-155-5p的上調(diào)似乎可以抑制白細(xì)胞介素(IL)-13誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)[18-19]。在miR-21和無癥狀的積極支氣管擴(kuò)張之間發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)可以解釋為這種miR-21在負(fù)向調(diào)節(jié)IL-12方面的作用,這對調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡很重要,因?yàn)檫@種IL的表達(dá)減少會(huì)誘發(fā)過度的Th2反應(yīng)[20]。miR-133-3p可以調(diào)節(jié)IL-13,這表明這一途徑的失調(diào)可能對Th2細(xì)胞因子的表達(dá)和信號(hào)有重大影響[21]。

綜上所述,EBC中miR-133-3p、miR-328-3p、miR-21-5p、miR-155-5p可作為診斷哮喘的潛在標(biāo)志物。