徐琳琳，屈鵬飛，楊向東，焦 陽

（1. 徐州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院人類遺傳和環(huán)境醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇 徐州 221004；2. 徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221006）

結(jié)構(gòu)多樣性和活性多樣性的多取代吲哚化合物在抗腫瘤[1]、抗菌[2]、抗病毒[3]、抗氧化[4]等方面均具有良好的生物活性，而吡唑也具有豐富的藥理活性[5]。鑒于該類結(jié)構(gòu)具有的優(yōu)異生物活性，近年來關(guān)于該類優(yōu)勢骨架的構(gòu)建[6]和生物活性的研究逐步興起。

隨著微波、超聲波[7]、金屬催化[8]等在有機合成中的應(yīng)用，促進了多取代吲哚化合物的合成和相應(yīng)活性化合物的發(fā)現(xiàn)。但這些方法大多反應(yīng)條件比較嚴苛，如需要微波輻射[9-10]或金屬催化[6]，存在反應(yīng)操作復(fù)雜、環(huán)境不友好、產(chǎn)率低、原子不經(jīng)濟等缺陷。C-C鍵的形成是有機合成中最重要的部分[11-13]，在構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)骨架中起關(guān)鍵作用。尋找原子經(jīng)濟性高且環(huán)境友好的綠色可持續(xù)發(fā)展方法來促使C-H鍵直接生成C-C鍵的研究，在有機化學(xué)界引起廣泛關(guān)注。本課題組近年來一直致力于含優(yōu)勢骨架化合物的有效構(gòu)建和活性研究[14-16]。對多取代吲哚化合物（見圖1中化合物4）進行簡單、多樣、原子經(jīng)濟的合成及抗腫瘤方面的研究引起了本團隊的廣泛興趣。

圖1 目標化合物4合成的反應(yīng)式

考慮到多取代吲哚化合物、吡唑類的生物活性，結(jié)合本團隊的前期研究，課題組設(shè)計了以一類取代氫化吲哚類化合物1、苯肼2、炔酯3為原料，通過酯的胺解、羧合、分子內(nèi)環(huán)化、芳構(gòu)化，從而使C-H鍵直接生成C-C鍵，合成了一系列目標化合物4，此過程在極大程度上符合原子經(jīng)濟性原則和綠色化學(xué)理念。同時，首次對目標化合物進行了抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)該類化合物均具有一定的抗腫瘤活性，為研發(fā)吲哚類新型藥物提供有效的生物學(xué)數(shù)據(jù)支持。

1 實驗

1.1 試劑和儀器

試劑：所用試劑均為分析純或化學(xué)純，實驗用水為去離子水。

細胞培養(yǎng)基（RPMI-1640，含雙抗）購自凱基生物；胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）、磺酰羅丹明B（SRB）購自Sigma公司；分別精確稱取化合物4a～4j溶于DMSO中，用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為10 mg/mL的母液，4℃保存?zhèn)溆?；人胃癌細胞系（SGC7901）和人肺癌細胞系（A549）購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

儀器：TX5顯微熔點儀（北京科儀，溫度未經(jīng)校正），F(xiàn)T/IR-8101型紅外光譜儀（KBr壓片，美國賽默飛），Bruker-400 MHz型核磁共振儀（CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標，德國布魯克），Bruker micrOTOF-Q-II高分辨質(zhì)譜儀（德國布魯克），Nikon倒置顯微鏡（日本尼康），BioTek多功能酶標儀（美國博騰）。

1.2 化合物的合成

目標化合物的合成在前期研究基礎(chǔ)上[9]改進如下：于室溫下依次稱取反應(yīng)物2苯肼（1 mmol）、反應(yīng)物3丁炔二酸二酯（1 mmol）以及2 ml醋酸放入25 ml梨形反應(yīng)器中，攪拌15～20 min。再加入反應(yīng)物1，150℃反應(yīng)2.5～4.5 h，并用TLC監(jiān)測反應(yīng)直到反應(yīng)物1的點消失。反應(yīng)完成后自然冷卻至室溫，抽濾，得到粗品。粗產(chǎn)品經(jīng)過20 ml水洗滌2次，接著用95%乙醇洗滌，抽濾，最終得到目標化合物4，如圖1，收率達77%～83%。

接著對該反應(yīng)的適用范圍進行了研究，不同的反應(yīng)底物被相繼考察，一系列的目標化合物4被有效的合成，反應(yīng)結(jié)果見表1。

表1 化合物4不同底物的合成

表2 化合物4a～4j的細胞毒性

1.3 SRB法測腫瘤細胞活力

在96孔板中用不同濃度的標題化合物處理SGC7901和A549細胞24 h，然后棄去板中的培養(yǎng)基，加入10%的三氯乙酸在4℃固定1 h。用去離子水沖洗并晾干，再用0.4%的SRB溶液室溫染色10 min，棄之，用1%的冰醋酸洗滌5次，晾干，加入10 mmol/L Tris堿，在平板振蕩器上振蕩5 min混勻，用酶標儀（BioTek，美國）在500 nm波長處讀取吸光度值。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，采用t檢驗，所有結(jié)果均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標化合物結(jié)構(gòu)分析

所有產(chǎn)物4的結(jié)構(gòu)都經(jīng)過紅外、核磁和質(zhì)譜證實。以產(chǎn)物4e為例，在其紅外光譜中，1725、1702 cm-1處出現(xiàn)很強的C=O伸縮振動吸收峰。在產(chǎn)物4e的核磁共振氫譜中，δ=4.68處出現(xiàn)了一個S峰，是環(huán)己烯酮上與吡唑環(huán)相連的次甲基上一個氫的吸收峰；δ=1.29和δ=1.00處分別出現(xiàn)了一個單峰，分別是環(huán)己烯酮上兩個甲基上的三個氫的吸收峰，其余的氫原子個數(shù)與結(jié)構(gòu)吻合。

4e：4-(1,2-雙(4-氯苯基)-6,6-二甲基-4-氧-4,5,6,7-四氫-1H-吲哚-7-基)-5-羥基-1-苯基-1H-吡唑-3-羧酸酯，白色固體，m.p. 266～268℃。IR (KBr,v,cm-1): 2959, 1725, 1702, 1620, 1595, 1548, 1472,1398;1H NMR (400 MHz, CDCl3) (δ, ppm): 7.68 (d,J=8.0 Hz, 2H, Ar-H), 7.49～7.35 (m, 4H, Ar-H and OH), 7.19～7.11 (m, 4H, Ar-H), 6.92 (d,J=8.4 Hz, 2H,Ar-H), 6.57 (s, 2H, Ar-H), 4.68 (s, 1H, CH), 3.83 (s,3H, CH3), 2.91 (d,J=17.2 Hz, 1H, CH2), 2.15～2.10 (m,1H, CH2), 1.29 (s, 3H, CH3), 1.00 (s, 3H, CH3);13C NMR (100 MHz, CDCl3) (δ, ppm): 197.9, 163.0,149.5, 148.8, 139.7, 137.7, 136.0, 135.5, 134.9, 133.2,129.6, 129.4, 129.2, 129.0, 128.5, 128.0, 123.9, 119.6,106.4, 105.6, 51.8, 48.8, 38.5, 38.1, 28.9, 27.3; HRMS(ESI) m/z: calcd for C33H27Cl2N3O4: 598.1300 [M-H]-;found: 598.1301。

產(chǎn)物4的可能合成機理如圖2，苯肼2、炔酯3通過胺解、分子內(nèi)成環(huán)生成中間產(chǎn)物A，A再與取代氫化吲哚類化合物1，經(jīng)過親核取代脫羧生成最終產(chǎn)物4。

圖2 化合物4的可能合成機理

2.2 腫瘤細胞活力檢測

為了評價化合物4的抗腫瘤能力，采用SRB法測定其對兩種人腫瘤細胞SGC7901和A549的生長抑制能力?；衔?被稀釋成2.5、10、40 ug/mL三種濃度分別測定其對胃癌細胞系SGC7901的細胞毒性。結(jié)果如表1，三種濃度的受試化合物對SGC7901均表現(xiàn)出一定的細胞毒性，抑制率為2.29%～77.33%，且化合物的細胞毒性呈濃度依賴性。處理24 h后，化合物4a、4e、4f、4g、4h在10 ug/mL時抑制率為4.51%、23.31%、19.16%、25.41%、27.06%，而在40 ug/mL時細胞生長抑制率則高達72.19%、73.47%、74.99%、75.17%、77.33%。其中，4g、4h抑制能力最強。

實驗進一步測試了化合物4對肺癌細胞系A(chǔ)549的IC50值。其中4a和4e對A549具有較強且相似的細胞生長抑制能力，IC50值分別為33.20 ug/mL和32.98 ug/mL，而化合物4i表現(xiàn)出較低的細胞生長抑制能力，IC50值為115.03 ug/mL，推測目標化合物中鹵族元素的引入能夠提高其抗癌活性。

3 結(jié)論

本文通過多組分反應(yīng)，有效合成了一系列多取代吲哚化合物4，該反應(yīng)具有操作簡便，產(chǎn)率及產(chǎn)品純度較高，且后處理方便等優(yōu)點。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)均通過紅外、核磁和質(zhì)譜進行表征。更為重要的是，對其進行了體外抗腫瘤活性測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目標化合物4對胃癌細胞系SGC7901和肺癌細胞系A(chǔ)549的增殖均具有較強抑制作用，且鹵族元素的引入能夠提高其抗癌活性。開展多取代吲哚化合物的有效合成和相關(guān)抗腫瘤活性的研究，對于發(fā)現(xiàn)新型抗腫瘤先導(dǎo)化合物具有重要指導(dǎo)意義，目標化合物的構(gòu)效關(guān)系有待進一步深入研究。