尹 苗，扶星星，董鵬宇，王 聰，陳俊巧，陳希文

（ 1. 四川百諾吉科技有限公司，四川 綿陽 621000 ；2. 四川生豬重大疫病監(jiān)測與防控工程研究中心，四川 綿陽 621000 ）

豬細(xì)小病毒（PPV）是引起豬繁殖障礙的常見病毒之一，目前包括豬細(xì)小病毒1 型～7 型（PPV1～PPV7）。1965年，德國科學(xué)家在細(xì)胞污染物中首先分離到PPV1，該病毒主要引起豬不育、胚胎和胎兒死亡、木乃伊化胎兒和死產(chǎn)等[1]，造成豬的繁殖障礙，影響豬群健康以及豬的生產(chǎn)性能。之后PPV2～PPV7 也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)并報道[2-4]，給豬群健康及養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅[5-8]。PPV4屬細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒亞科、博卡病毒屬[9]，是美國科學(xué)家于2009年在2005年暴發(fā)圓環(huán)病毒2型（PCV2）的病死豬病料中檢測到的新病毒[10]。2012 年，黃律等[11]首次在我國發(fā)現(xiàn)了PPV4。PPV4 具有快速感染性，對豬肺臟以及腸道器官組織的嗜性最強(qiáng)，主要引起豬呼吸道疾病和繁殖障礙等，嚴(yán)重影響豬群的生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益[9]。我國目前在PPV4方面的研究報道不多，本研究通過采集發(fā)病豬場的豬肺臟、淋巴結(jié)、血液等病料，經(jīng)PCR擴(kuò)增和全基因組測序成功鑒定到1株新型PPV4，綜合運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對分離株進(jìn)行遺傳變異和全基因組分析，為豐富我國PPV4 基因數(shù)據(jù)并為其遺傳變異、疫苗研究、疫病防控等提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料為四川地區(qū)某發(fā)病豬場有呼吸道癥狀和繁殖障礙癥狀的豬肺臟、淋巴結(jié)、血液等，由四川生豬重大疫病監(jiān)測與防控工程研究中心保存。

1.2 試劑與儀器

FineMag 快速磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒（濟(jì)凡生物科技（北京）有限公司）；瓊脂糖（上海必德生物技術(shù)有限公司）；2×Taq PCR 預(yù)混試劑Ⅱ、ddH2O、DL 2000 DNA Marker（天根生化科技（北京）有限公司）；GoldView I型核酸染色劑（北京索萊寶科技有限公司）。T100 PCR儀、凝膠成像儀（美國Bio-logic公司）；EL204-IC電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.3 生物信息學(xué)軟件

運(yùn)用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計，對比選擇條件適合的引物，將設(shè)計好的引物使用Primer-BLAST 工具進(jìn)行引物特異性檢查（網(wǎng)址為https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）；應(yīng)用DNAMAN 軟件進(jìn)行測序結(jié)果拼接。應(yīng)用ORFfinder工具對全基因進(jìn)行開放閱讀框的預(yù)測（網(wǎng)址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）；應(yīng)用DNAMAN 軟件進(jìn)行DNA 多序列比對以及氨基酸對比分析；使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)相關(guān)報道[12]合成特異性檢測引物（PPV4-F：5'-TGATGAACATTGGCAGGGCA-3'、PPV4-R：5'-ATGGACCTGTGTAGCGATGA-3'，目的片段大小180 bp。根據(jù)GenBank公布的PPV4全基因序列合成全基因分段擴(kuò)增引物，送至寶生物工程（大連）有限公司合成。PPV4 全基因分段擴(kuò)增引物信息見表1。

表1 PPV4全基因分段擴(kuò)增引物信息Tab.1 Primers imformation for PPV4 whole gene segmentation amplification

1.5 核酸提取

使用FineMag快速磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒提取樣品核酸，-80 ℃冰箱保存。

1.6 PCR擴(kuò)增與測序

PPV4 PCR 擴(kuò)增體系（25μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L 的上下游引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA 模板2 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。

取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，將符合預(yù)期目的條帶的PCR產(chǎn)物送華大基因進(jìn)行測序。

1.7 序列拼接與全基因組分析

將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對，應(yīng)用DNAMAN軟件中Sequence-Sequence Assembly 工具進(jìn)行PPV4 全基因分段擴(kuò)增測序結(jié)果拼接。運(yùn)用ORFfinder、DNAMAN、MEGAX等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行全基因分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPV4的分子鑒定結(jié)果（圖1）

圖1 PPV4鑒定結(jié)果Fig.1 PPV4 identification results

由圖1可知，提取的DNA用檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳，在約180 bp處出現(xiàn)了目的條帶，與預(yù)期大小一致。

2.2 PPV4的全基因組擴(kuò)增結(jié)果（見圖2）

圖2 PPV4全基因分段擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of whole gene segment amplification of PPV4

由圖2 可知，將提取的DNA 用全基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳，分別在1 128、1 015、830、1 095、983、764和788 bp位置出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期條帶大小相符。

2.3 PPV4-MY全基因組分析結(jié)果

選取其中1株P(guān)PV4陽性樣品（命名為PPV4-MY），使用DNAMAN將PPV4-MY株與本地參考序列進(jìn)行多序列比對，全基因核苷酸一致性為98.8%～99.2%，與2017 年山東的SDWF20170530-68 毒株（MZ577035.1）一致性最高，與2006 年美國PPV4（NC_014665.1）一致性最低，結(jié)果見圖3～圖5。

圖3 PPV4全基因多序列比對前端Fig.3 PPV4 whole gene multiple sequence alignment front-end

圖5 PPV4全基因多序列比對后端Fig.5 Back end of PPV4 whole gene multiple sequence alignment

由圖3～圖5 可知，PPV4 全基因開始與末端各序列間具有較大差異，在全基因中間各序列差異較小，序列一致性高。2006 年美國PPV4（NC_014665.1）與2018 年P(guān)PV4 P1 OK/USA分離株（MW073110.1）比其他本地參考序列前端多出250～490 bp，比PPV4-MY 前端多出380 bp；在PPV4 多序列比對末端，PPV4-MY 與2008 年巴西（KY586146.1）檢出的PPV4比其他本地序列長約200 bp。

對PPV4-MY 與其他本地PPV4 全基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Neighbor-Joining建樹），見圖6。

圖6 PPV4-MY全基因建樹Fig.6 PPV4-MY whole gene establishment

由圖6 可知，PPV4-MY 與2017 年國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的山東SDWF20170530-68 毒株（MZ577035.1）、2017 年韓國171206-10-PPV4 毒株（MH921902.1）處于同一小分支，親緣性較近，共同特征較多。與江蘇（HM031134.1、HM031135.1）、巴西（KY586146.1）、韓國另外3 株毒株（MH921910.1、MH921911.1、MH921915.1）親緣性較遠(yuǎn)。

3 討論

PPV 會引起豬的繁殖障礙，降低仔豬的出生率，特別是新型PPV發(fā)現(xiàn)以來。雖然目前有疫苗可對PPV1進(jìn)行防控，但PPV2～PPV7尚無有效疫苗。因此，為防控豬細(xì)小病毒病應(yīng)從源頭控制，定期檢測PPV抗體，嚴(yán)格防控傳染病，提高豬群質(zhì)量，減少經(jīng)濟(jì)損失。PPV4感染范圍廣，傳播途徑多，具有很強(qiáng)的組織嗜性，尤其是腸道，嚴(yán)重影響豬的生長性能。自2012年P(guān)PV4在我國首次發(fā)現(xiàn)起，各地相繼出現(xiàn)疫情相關(guān)報道。2012 年，黃律等[9]對我國部分地區(qū)2006—2011 年的樣品開展流行病學(xué)調(diào)查，總陽性率為14.07%；2023年，李吉祥[12]研究了我國PPV1～PPV7流行演化，指出其實早在1996 年我國豬群已存在PPV4 的感染。2020 年，張鑫杰等[13]在福建省進(jìn)行PPV4 的分子流行病學(xué)調(diào)查，PPV4 陽性率為9.09%。2021 年，Li 等[14]對2016—2020年部分地區(qū)樣品進(jìn)行調(diào)查，PPV4檢出率為4.37%。

本研究對測序拼接的PPV4 全基因進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)PPV4-MY全基因前端和后端與其他本地序列具有較大差異，中間差異很小。美國毒株普遍比其他地區(qū)毒株前端多250～490 bp 左右，而PPV4-MY 與巴西毒株的后端比其他全基因序列長，提示了PPV4 可能在適應(yīng)宿主或傳播時發(fā)生了一定的變異，使前端或后端部分基因發(fā)生了缺失；也可能是由于當(dāng)初技術(shù)不成熟，導(dǎo)致PPV4 測出的全基因比實際的短。此前有研究發(fā)現(xiàn)，PPV4 基因組結(jié)構(gòu)為首尾相連環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并且此結(jié)構(gòu)對PPV4 持久宿主感染可能具有一定作用[15]。夏娜等[16]報道稱，PPV 感染過程中，其非結(jié)構(gòu)蛋白可與自噬相關(guān)蛋白、RAB2A 互作。這種缺失曾在腺病毒（AAV）中發(fā)現(xiàn)，并且不影響其感染性[17-18]。但目前關(guān)于PPV4 的缺失無相關(guān)研究，提示還需要進(jìn)一步研究PPV4 的全基因長度以及發(fā)現(xiàn)相應(yīng)缺失增添對PPV4 的表達(dá)等有無相應(yīng)影響。對PPV4-MY構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，其與2017 年國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的山東SDWF20170530-68 毒株、2017 年韓國171206-10-PPV4 毒株親緣性近，在同一分支，共同特征較多。

綜上所述，本研究從發(fā)病豬場病料中成功鑒定到1 株新型PPV4（PPV4-MY），運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對PPV4-MY 進(jìn)行遺傳變異和全基因組分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果表明其與2017 年山東株（SDWF20170530-68）、2017 年韓國株（171206-10-PPV4）親緣關(guān)系最近。本研究結(jié)果豐富了我國PPV4的基因數(shù)據(jù)，為PPV4的遺傳變異、疫苗研究、疫病防控等提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，PPV4-MY 全基因組存在一定程度的突變，全基因組前端和末端各序列存在較大差異，中段序列基本一致，差異較??；系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，分離株P(guān)PV4-MY與山東、韓國檢出的毒株親緣性最近。