奚德鑫，付詩(shī)涵，蔡錦順

（ 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000 ）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種接觸性傳染病，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起，俗稱藍(lán)耳病。PRRS是一種可導(dǎo)致母豬生育能力下降以及仔豬的呼吸道發(fā)生病變等一系列惡性結(jié)果的高危傳染病，特征表現(xiàn)是高發(fā)病率和死亡率、高熱、高病毒血癥以及與其他細(xì)菌的合并感染，一旦發(fā)病很難治愈，可對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重影響。PRRSV的遺傳多樣性非常高，且這種多樣性可能對(duì)疫苗的開發(fā)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，開發(fā)更新和普遍有效的PRRSV 疫苗具有挑戰(zhàn)性[1]。目前分離到的PRRSV 分為美洲型和歐洲型兩種，近年來我國(guó)研究者在本土分離到的PRRSV絕大多數(shù)為美洲型，只有極少數(shù)的歐洲型[2]。豬的呼吸道是PRRSV的主要入侵部位，豬群的接觸、繁育等是導(dǎo)致PRRS傳播的主要行為，被污染的豬舍、器械和染病的豬等是PRRS 的主要傳染源，此外，仔豬對(duì)PRRSV 比成豬更易感。大量研究表明，斷奶仔豬感染PRRS 的概率顯著高于成豬和哺乳期仔豬，因而推測(cè)是母乳中的一些成分抑制了PRRSV的繁殖。本課題組經(jīng)過前期大量的資料查詢及總結(jié)，發(fā)現(xiàn)母乳中存在一部分外泌體，外泌體包裹著大量的miRNA，而有些miRNA又會(huì)通過某些通路釋放信號(hào)，給細(xì)胞一定刺激使其作出反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)或抑制病毒復(fù)制，由此推測(cè)可能是母乳中外泌體內(nèi)的miRNA 發(fā)揮了作用抑制了PRRSV 的復(fù)制，但目前仍缺乏相關(guān)研究?；诖?，文章論述了PRRSV的致病機(jī)制及預(yù)防研究進(jìn)展，總結(jié)了外泌體中miRNA 的作用機(jī)制及對(duì)PRRSV 的作用，為后續(xù)豬乳外泌體分離檢測(cè)以及篩選出相關(guān)miRNA、推進(jìn)后續(xù)PRRS疫苗研發(fā)提供參考。

1 PRRSV致病機(jī)制及預(yù)防研究進(jìn)展

1.1 PRRSV

PRRSV 是一種具有包膜的單鏈陽性RNA 病毒，高度局限于單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞，如豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）。由PRRSV 引起的PRRS 是豬中最嚴(yán)重的傳染病之一，該疾病的特征是母豬繁殖失敗和呼吸系統(tǒng)問題。由于病毒侵入免疫細(xì)胞后會(huì)破壞免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制，發(fā)生繼發(fā)性細(xì)菌感染，并干擾其他商業(yè)疫苗對(duì)豬圓環(huán)病毒和經(jīng)典豬瘟病毒的免疫保護(hù)作用。而且，在感染PRRSV的豬中還觀察到長(zhǎng)期病毒血癥（＞30 d）和抗體依賴性增強(qiáng)現(xiàn)象。PRRSV 通過一系列機(jī)制損害豬肺部的局部免疫反應(yīng)，包括黏膜纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)受損，PAMs的功能和數(shù)量減少，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡以及造成促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間的不平衡，可能使病毒在宿主中持續(xù)存在。PRRSV還可降低巨噬細(xì)胞的殺菌活性，導(dǎo)致對(duì)繼發(fā)感染的易感性上升[3]。受感染的豬會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈且快速的體液反應(yīng)，但這些初始抗體不能提供保護(hù)，甚至可能通過介導(dǎo)抗體依賴性增強(qiáng)疾病而對(duì)機(jī)體有害。相反，中和抗體（NA）的發(fā)育被延遲，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)產(chǎn)生最初是不穩(wěn)定的，如PRRSV 特異性干擾素（IFN-γ）分泌細(xì)胞。盡管如此，有效接種疫苗似乎需要誘導(dǎo)強(qiáng)而快速的NA 和IFN-γ反應(yīng)。PRRSV 可調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，抑制關(guān)鍵細(xì)胞因子，如干擾素-α（IFN-α）；并可能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）。NAC 的發(fā)育似乎因糖蛋白5 中存在靠近主要中和表位的誘餌表位而受到損害。這種調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的能力可能因菌株或分離株而異。

1.2 PRRS的預(yù)防相關(guān)研究進(jìn)展

目前，商業(yè)疫苗（改良活疫苗）是效果良好，但其無法誘導(dǎo)高水平的中和抗體，因此不能提供有效的保護(hù)，防止PRRSV 感染。此外，這些疫苗還存在其他缺陷，如長(zhǎng)期病毒血癥、易與田間菌株重組等。因此，為更好地預(yù)防和控制PRRS，還需進(jìn)一步研究PRRSV的致病機(jī)制。以miRNA介導(dǎo)而生產(chǎn)的PRRS 疫苗經(jīng)過大量的研究得到了認(rèn)證，這種新型疫苗將為PRRS的預(yù)防和治療起到關(guān)鍵性作用。

miRNA主要參與調(diào)控基因表達(dá)，使基因沉默。有研究利用miRNA 沉默技術(shù)作為弱化疫苗毒性的一種補(bǔ)充，miRNA 反應(yīng)原件（MREs）摻入病毒核蛋白質(zhì)的開放性讀碼框中，由miRNA介導(dǎo)的基因沉默可弱化病毒活性，產(chǎn)生減毒活疫苗的重配株。經(jīng)過大量試驗(yàn)證明，由miRNA 介導(dǎo)的基因沉默新方法弱化的疫苗比傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的疫苗活性更弱，安全性更高。我國(guó)目前仍采用以傳統(tǒng)疫苗為主的病毒防治措施，但由于滅活疫苗不能長(zhǎng)期抵御PRRSV的侵襲，因而加快開發(fā)和生產(chǎn)非常迫切，而且生物技術(shù)疫苗和佐劑等研究也是工作的重點(diǎn)[4]。其中活疫苗預(yù)防效果比較好，缺點(diǎn)是缺少交叉保護(hù)能力；滅活苗與其他疫苗相比最為安全，但能力不強(qiáng)，不易起效；亞單位疫苗優(yōu)點(diǎn)是妊娠母豬可注射；DNA疫苗可與活疫苗聯(lián)合注射以加強(qiáng)預(yù)防效果；載體疫苗目前尚未投入市場(chǎng)[5]。綜上所述，現(xiàn)階段我國(guó)尚無一種疫苗可以針對(duì)性地預(yù)防PRRS，只能通過科學(xué)技術(shù)手段配合疫苗定向使用。RT-PCR檢測(cè)技術(shù)和ELISA檢測(cè)是目前檢測(cè)PRRSV的主要技術(shù)手段，RT-PCR檢測(cè)技術(shù)可檢測(cè)毒株類型，ELISA檢測(cè)技術(shù)則可測(cè)出注射疫苗的效果以及宿主體內(nèi)病毒的情況。

林德銳等[6]研究發(fā)現(xiàn)，采用肌肉注射與噴鼻接種的方法，不論是單獨(dú)接種豬瘟活疫苗還是同時(shí)接種豬瘟活疫苗和HP-PRRSV活疫苗，接種后免疫效果無明顯差異。丁尊俄等[7]發(fā)現(xiàn)，弱毒疫苗和滅活疫苗聯(lián)合免疫的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)免疫。劉歡歡等[8]發(fā)現(xiàn)，PRRS弱毒活疫苗除了可以抑制PRRSV，還可以減少產(chǎn)生病毒血癥的數(shù)量和持續(xù)時(shí)間，減輕呼吸系統(tǒng)疾病和繁殖障礙。王俊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的VLPs 疫苗比最大劑量弱毒苗的免疫效果好，且兩者中和抗體的產(chǎn)生量只有細(xì)微差別，因此VLPs 疫苗也是一種既安全又高效的預(yù)防PRRSV的疫苗。蘇瑋瑋等[10]發(fā)現(xiàn)，微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)在HP-PRRSV活疫苗工業(yè)化生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量控制方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。劉曉東等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高致病性PRRSV弱毒疫苗非常安全，對(duì)母豬進(jìn)行普免后不會(huì)引發(fā)不良反應(yīng)，并且適用于所有豬群。張洪亮等[12]發(fā)現(xiàn)，高致病性PRRSV 活疫苗對(duì)類NADC30 PRRSV可提供一定的交叉保護(hù)。李少麗等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PRRS 滅活疫苗的加強(qiáng)免疫，尤其與同源性更高的PRRS 二價(jià)滅活疫苗聯(lián)合免疫，可加速試驗(yàn)豬體內(nèi)排毒、提高豬的日增重。但需要注意，在對(duì)患病豬進(jìn)行第一次PRRS 疫苗接種時(shí)應(yīng)做好安全試驗(yàn)工作，避免出現(xiàn)不良反應(yīng)[14]。

控制和根除PRRS是一個(gè)世界性問題。解決病毒的發(fā)病機(jī)制和病毒-宿主相互作用的機(jī)制至關(guān)重要，是預(yù)防和控制病毒的關(guān)鍵前提和基礎(chǔ)。由于PRRSV感染導(dǎo)致豬的免疫抑制，因此很難開發(fā)出理想的疫苗產(chǎn)生高水平的中和抗體。利用CRISPR/Cas9技術(shù)育種抗病豬、開發(fā)抗病毒分子可能是PRRS 防治的重要方向[15]。Xu 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV-ADE 感染顯著增加了線粒體呼吸鏈復(fù)合物的表達(dá)，并干擾了先天免疫信號(hào)、抗病毒蛋白、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和核糖體的功能，這些發(fā)現(xiàn)為闡明PRRSV-ADE感染的機(jī)制、篩選治療ADE 感染的新靶點(diǎn)以及開發(fā)新型PRRSV疫苗提供了新方向。PRRSV減毒疫苗株作為一種單鏈RNA 病毒，可在豬體內(nèi)表達(dá)外源蛋白并誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。Li等[17]研究建立了mAb，可以作為評(píng)估重組病毒中p17表達(dá)水平的有用工具。此外，間接ELISA方法在特異性和有效檢測(cè)重組病毒體內(nèi)抗體水平方面具有巨大潛力，對(duì)未來PRRSV的疫苗研究具有重要意義。

2 外泌體中miRNA的作用機(jī)制及對(duì)PRRSV的作用

2.1 miRNA對(duì)病毒的作用機(jī)制

在經(jīng)過查閱大量相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，miRNA 是高度保守、長(zhǎng)度很短的非編碼單鏈核苷酸，miRNA在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起到重要作用，還可以調(diào)節(jié)病毒與宿主間的相互作用。病毒在侵入細(xì)胞后，miRNA能夠通過兩種方式與病毒發(fā)生相互作用，其一是調(diào)控miRNA 的表達(dá)控制病毒的增殖；另一種相互作用方式是宿主miRNA 與病毒的RNA 結(jié)合，以促進(jìn)或抑制病毒在體內(nèi)的復(fù)制、翻譯等行為，從而改變病毒的致病機(jī)制，即通過阻礙病毒mRNA的翻譯以抑制病毒的復(fù)制或通過提高病毒mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制[18]。通過miRNA 能夠靶向病毒的RNA，達(dá)到抑制病毒復(fù)制的特性，現(xiàn)已成為一種新的抗病毒的防御機(jī)制。miRNAs 是基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，對(duì)抗菌反應(yīng)具有積極作用，同時(shí)，由病原體相關(guān)分子模式參與的宿主病原體識(shí)別受體也在激活針對(duì)微生物感染的先天免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，微生物調(diào)節(jié)的miRNA和重要的PRRS信號(hào)通路之間的相互作用影響宿主對(duì)微生物病原體的免疫反應(yīng)[19]。而miRNA的運(yùn)輸則是依靠外泌體完成。

外泌體是一種具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡，是常見的膜結(jié)合納米囊，由細(xì)胞的胞吐作用形成并釋放到細(xì)胞間隙中，囊內(nèi)包裹各種核酸和蛋白質(zhì)等成分，可被靶細(xì)胞攝取以達(dá)到傳遞信號(hào)的作用等，還能夠作為生物標(biāo)志物、疫苗和藥物載體，并對(duì)其進(jìn)行合理的修飾以進(jìn)行治療干預(yù)[20]。豬乳外泌體中含有非常多的與免疫相關(guān)的miRNAs，而且外泌體具有很強(qiáng)的抵抗力。有研究對(duì)飼喂初乳的幼豬進(jìn)行體內(nèi)血清檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其miRNA 的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于飼喂常乳的幼豬，表明這些miRNA可通過外泌體進(jìn)入幼畜機(jī)體內(nèi)；并且初乳中的miRNA 數(shù)量高于常乳，推測(cè)動(dòng)物的母乳可影響幼崽的免疫系統(tǒng)發(fā)育，將miRNA傳遞給新生動(dòng)物，并發(fā)揮其生物學(xué)作用。這些免疫相關(guān)的miRNA均會(huì)功能性地靶向編碼細(xì)胞活素和其他免疫調(diào)節(jié)蛋白，以及免疫反應(yīng)信號(hào)通路上的其他組分等特異性轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而行使其免疫調(diào)控功能[21]。

2.2 外泌體中miRNA的作用以及對(duì)PRRSV的影響

已有許多研究以miRNA 為基礎(chǔ)對(duì)病毒進(jìn)行干擾、抵抗等，開展了達(dá)到防御病毒等目的的試驗(yàn)。郭雪坤[22]發(fā)現(xiàn)，有25 種可能抑制PRRSV 復(fù)制的候選miRNA，其中miR-181 的功能得到了具體驗(yàn)證。Zheng 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，感染PRRSV 時(shí)，豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）中miR-10a的表達(dá)水平升高，并通過下調(diào)宿主分子信號(hào)識(shí)別顆粒14（SRP14）蛋白的表達(dá)而進(jìn)一步抑制病毒的復(fù)制，發(fā)現(xiàn)了一種新的抗PRRSV 感染的IRF8-miR-10a-SRP14 調(diào)控途徑。Shi 等[24]發(fā)現(xiàn)，PRRSV-2 可能劫持宿主miR-541-3p以抑制宿主先天免疫應(yīng)答，miR-541-3p 能夠通過靶向干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）負(fù)調(diào)控Ⅰ型干擾素的轉(zhuǎn)錄，PRRSV-2 感染上調(diào)了miR-541-3p 的表達(dá)，從而促進(jìn)miR-541-3p 在MARC-145 細(xì)胞中的復(fù)制，進(jìn)而促進(jìn)自身復(fù)制。還有研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV 誘導(dǎo)的miR-218 下調(diào)有助于抑制Ⅰ型干擾素反應(yīng)，并可能為治療PRRSV 和其他病毒感染提供新的治療靶點(diǎn)[25]。張小霞等[26]研究找到了豬感染PRRSV時(shí)潛在的候選lncRNA和靶基因。

有研究者對(duì)感染PRRSV豬的血清外泌體進(jìn)行了鑒定和生物信息學(xué)分析，獲得了多種PRRSV 相關(guān)途徑和差異表達(dá)的miRNA，在PRRSV誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答、侵襲和外泌體攝取中起到潛在作用。此外，由于單個(gè)miRNA 可以靶向多個(gè)基因，并且單個(gè)基因也受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，因此有許多miRNA在上述途徑中執(zhí)行多種功能。一些miRNA已被驗(yàn)證可以通過作用于關(guān)鍵受體或直接靶向病毒基因組調(diào)節(jié)PRRSV 感染[27]。miR-122 的過表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控SOCS3蛋白的表達(dá)水平，導(dǎo)致IFN信號(hào)增強(qiáng)并減少病毒復(fù)制[28]。

研究表明，PRRSV感染通過延遲中和抗體的形成和細(xì)胞因子表達(dá)的失調(diào)影響先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的研究提高了對(duì)異?；虮磉_(dá)調(diào)控潛在機(jī)制的理解。在PRRSV 感染的情況下，TFs 介導(dǎo)PRRSV 的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白，用于調(diào)節(jié)炎癥基因表達(dá)、免疫細(xì)胞、非編碼RNA和其他相關(guān)宿主因子以及逃避宿主免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)病毒復(fù)制。TF還有助于清除未被宿主免疫系統(tǒng)消除的病毒并抑制病毒入侵。靶向特定TFs的小分子藥物的使用廣泛用于各種人類疾病的治療；因此，由于其在許多生物過程中的重要性及其在PRRSV感染期間的異?；钚?，TFs應(yīng)被視為未來的治療靶點(diǎn)[29]。

有研究發(fā)現(xiàn)，仔豬中斷奶仔豬感染PRRS 的概率顯著高于成豬和哺乳期仔豬，因此推測(cè)是母乳中的一些成分抑制了PRRSV 的繁殖，如母乳中外泌體中的miRNA 發(fā)揮了作用。此前，本課題組進(jìn)行了提取豬乳中外泌體的試驗(yàn)，并將提取的外泌體對(duì)感染PRRSV的MARC-145細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，結(jié)果表明，豬乳外泌體中miRNA 可抑制PRRSV復(fù)制[30]。

盡管在過去三十年中對(duì)PRRS的研究取得了巨大的進(jìn)展，但對(duì)PRRSV 發(fā)病機(jī)制的分子和細(xì)胞機(jī)制的理解仍然有限，一些研究數(shù)據(jù)往往相互矛盾，難以解釋。如最近有大量信息可用于miRNA，一些miRNA 促進(jìn)PRRSV 復(fù)制，而另一些則抑制病毒復(fù)制，但其對(duì)PRRSV 的致病作用還需進(jìn)一步研究。PRRS 研究還面臨著一些挑戰(zhàn)和困難，首先，豬缺乏合適的免疫生化試劑和工具，并且豬的許多蛋白質(zhì)的細(xì)胞功能沒有得到適當(dāng)?shù)谋碚?。其次，PRRSV缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。第三，PRRSV的應(yīng)變變化似乎對(duì)宿主反應(yīng)影響很大。即使在相同的亞型中，不同的PRRSV菌株也可以表現(xiàn)出高序列變異，并顯示出不同的表型。

疫苗研發(fā)方面也沒有利用豬乳外泌體中的miRNA，相關(guān)研究人員尚未使用外泌體中miRNA制備PRRS疫苗，只是研發(fā)了一些傳統(tǒng)疫苗但是效果微弱，利用miRNA 沉默技術(shù)作為弱化疫苗毒性的一種補(bǔ)充，是現(xiàn)階段疫苗研發(fā)的方向和重點(diǎn)，由miRNA 介導(dǎo)的基因沉默可以弱化病毒活性，產(chǎn)生減毒活疫苗的重配株。大量試驗(yàn)證明，由miRNA介導(dǎo)的基因沉默新方法弱化的疫苗比傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的疫苗活性更弱，安全性更高。

3 展望

目前，對(duì)于miRNA 在抵御病毒方面的研究仍然是一項(xiàng)難題，miRNA 不好把握且數(shù)量較少，尤其是豬乳外泌體中存在的miRNA更甚，但該研究方向的前景很廣，一旦突破將會(huì)為PRRS的治療及預(yù)防起到幫助，也會(huì)為miRNA防御病毒提供參考。更好地了解PRRSV結(jié)合反向遺傳學(xué)對(duì)宿主反應(yīng)的調(diào)節(jié)可加快研發(fā)新一代以miRNA 為主導(dǎo)的PRRS 疫苗。這種分子方法將填補(bǔ)知識(shí)空白，并引導(dǎo)更加精細(xì)地了解PRRSV 的發(fā)病機(jī)制。隨著科技進(jìn)步，新型的PRRS疫苗必將在臨床中得到廣泛的應(yīng)用。