翟文靜,仇永樂(lè),劉珊珊,劉鐵軍,呂飛飛

(1.河北省石家莊市人民醫(yī)院口腔科,河北 石家莊050000;2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科,河北 石家莊 050017;3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科,河北 保定 071000)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常見(jiàn)的頭頸部腫瘤之一,占口腔惡性腫瘤總數(shù)的90%[1]。OSCC患者的5年生存率為60%～80%,未確診患者的生存率低于50%[2]。輔助治療在治療晚期癌癥方面發(fā)揮重要作用[3],而這種預(yù)治療僅對(duì)部分患者有效[4]。目前為止,還沒(méi)有可靠的生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估患者對(duì)該療法或腫瘤生物學(xué)特征的反應(yīng)。微核糖核酸(microRNA,miRNA)是小片段非編碼單鏈內(nèi)源RNA分子,能夠識(shí)別并參與調(diào)控化療耐藥性。引起化療耐藥的原因涉及多個(gè)方面,如藥物的跨膜運(yùn)輸[5],細(xì)胞內(nèi)藥物代謝[6]或細(xì)胞增殖和凋亡[7]。miRNA可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后全基因組表達(dá)[8],并參與操控諸多細(xì)胞活動(dòng),包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡和新陳代謝[9]。此外,miRNA與癌癥[10]對(duì)化療的敏感性[11]已被廣泛研究,而未見(jiàn)關(guān)于耐藥口腔鱗癌的系統(tǒng)性分析。本研究旨在系統(tǒng)的檢測(cè)耐藥細(xì)胞系中特征性miRNA與耐藥化療表型的相關(guān)性。此外,課題組還進(jìn)一步驗(yàn)證這些特征性miRNA是否影響口腔鱗癌細(xì)胞系的生物學(xué)行為。最后,研究這些特征性miRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)通路的調(diào)節(jié)作用,探討這種調(diào)控作用與化療耐藥性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) OSCC細(xì)胞系SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R(DSMZ,德國(guó))采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和操作流程進(jìn)行培養(yǎng)[12]。在3個(gè)細(xì)胞系中研究miRNA對(duì)OSCC細(xì)胞系化療耐藥性的影響。在2個(gè)細(xì)胞系(SCC084/R,SCC9/R)中研究miRNA對(duì)OSCC細(xì)胞系凋亡和細(xì)胞周期的影響。在SCC084/R、SCC9/R細(xì)胞中進(jìn)行靶點(diǎn)分析。

1.2miRNA的篩選與表達(dá)調(diào)控 從耐藥OSCC細(xì)胞特征性miRNA中篩選出研究較為深入的miR-125a-5p、miR-130a-3p和miR-27b-5p進(jìn)行研究。在順鉑耐藥的OSCC細(xì)胞中,miR-27b-5p能顯著提高其藥物敏感性[13]。此外,miR-130a-3p能影響口腔鱗癌耐藥細(xì)胞系對(duì)順鉑和5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)的敏感性[14]。miRNA通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Life Technologies,Carlsbad,美國(guó))瞬時(shí)轉(zhuǎn)染[15]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-125a-5p模擬物(miR-125a-5p M),miR-27b-5p模擬物(miR-27b-5p M),miR-130a-3p抑制劑(miR-130a-3p I),上調(diào)靶細(xì)胞中miR-125a-5p和miR-27b-5p的表達(dá),降低miR-130a-3p的表達(dá),以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(Sham)為作為對(duì)照。miRNA的模擬物/抑制劑購(gòu)自Qiagen(德國(guó))。聯(lián)合轉(zhuǎn)染用于研究miRNA共轉(zhuǎn)染對(duì)耐藥細(xì)胞系的生物學(xué)影響。通過(guò)qRT-PCR(Beckman Coulter,美國(guó))評(píng)估轉(zhuǎn)染水平[15],SNORD25、SNORD68和RNU6B(Qiagen,德國(guó))作為管家基因。

1.3化療處理和活力測(cè)定 轉(zhuǎn)染后24 h用順鉑和5-FU進(jìn)行化療。72 h使用MTT檢測(cè)(Sigma Aldrich,美國(guó))[15]進(jìn)行活力測(cè)定,細(xì)胞生存率越低,說(shuō)明藥物越敏感,所有實(shí)驗(yàn)組一式四份。

1.4凋亡和細(xì)胞周期分析 miRNA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響和細(xì)胞周期在轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行檢測(cè)[凋亡:FITC Annexin V/7-AAD 凋亡試劑盒(BioLegend,英國(guó))];根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用Beckman Coulter FC500(Beckman Coulter,美國(guó))流式細(xì)胞儀測(cè)試,細(xì)胞數(shù)=20 000,使用CXP-軟件(Beckman Coulter,美國(guó))進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,早期凋亡(Annexin V陽(yáng)性和7AAD陰性)和晚凋亡細(xì)胞(Annexin V和7AAD陽(yáng)性):所有實(shí)驗(yàn)組一式四份。

1.5靶點(diǎn)分析 選擇來(lái)自miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan的不同miRNA的潛在目標(biāo)基因,Total Context score≤0.5:Bcl-2,BIM,X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)、絲裂原和應(yīng)激激活蛋白激酶1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1,MSK-1)、多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1,MDR1)、DNA(胞嘧啶-5)甲基轉(zhuǎn)移酶[DNA (Cytosine-5)-methyltransferase 1,DNMT1]、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARy)、人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,ErbB2/Her2)、p53和組蛋白脫乙酰酶4(histone deacetylase 4,HDAC4)。進(jìn)一步分析凋亡通路的下游靶點(diǎn)caspase 3(Casp3),caspase 9(Casp9),Tubulin-β-3為對(duì)照組。

一抗購(gòu)自Invitrogen(美國(guó)),二抗使用抗兔 HRP 和抗鼠HRP(A6154,A9044:Sigma-Aldrich)。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48 h后收集,將15～30 μg蛋白加入到6%～10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)變性聚丙烯酰胺凝膠上。隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移置PVDF膜上,封閉。一抗4 ℃下孵育過(guò)夜,清洗,二抗孵育。用ECL-plus-Western blotting檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)條帶生成(Immobilon,Millipore,美國(guó))。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1耐藥OSCC特征性miRNA對(duì)化療耐藥性的影響 順鉑化療組中,miR-27b-5p上調(diào)組SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R細(xì)胞生存率低于Sham組,miR-130a-3p下調(diào)組SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R細(xì)胞生存率低于Sham組,miR-125a-5p上調(diào)組SCC9/R細(xì)胞生存率低于Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明,miR-27b-5p上調(diào)提高了SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。miR-130a-3p下調(diào)提高了SCC084/R、SCC131/R和SCC9/R細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,miR-125a-5p上調(diào)提高了SCC9/R細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。FU化療組中,miR-27b-5p上調(diào)組SCC9/R細(xì)胞生存率低于Sham組,miR-130a-3p下調(diào)組SCC084/R細(xì)胞生存率低于Sham組,miR-125a-5p上調(diào)組SCC131/R和SCC09/R細(xì)胞生存率高于Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明,miR-27b-5p上調(diào)組提高了SCC9/R細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性;miR-130a-3p下調(diào)提高了SCC084/R細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性,miR-125a-5p上調(diào)降低了SCC131/R和SCC09/R細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。見(jiàn)表1。

表1 單獨(dú)轉(zhuǎn)染miRNA對(duì)化療后細(xì)胞毒性的調(diào)控作用

2.2共轉(zhuǎn)染對(duì)順鉑耐藥性的增效/拮抗效應(yīng) 評(píng)估m(xù)iR-27b-5p、miR-130a-3p和miR-125a-5p對(duì)化療藥物增敏作用的潛在增效/拮抗作用。通過(guò)上調(diào)miR-27b-5p表達(dá),同時(shí)上調(diào)miR-125a-5p或下調(diào)miR-130a-3p表達(dá),檢測(cè)miRNA共轉(zhuǎn)染對(duì)順鉑和5-FU化療敏感性的影響。

在順鉑用藥組中,miR-130a-3p 下調(diào)/miR-27b-5p上調(diào)組中SCC084/R和SCC131/R細(xì)胞的生存率低于miR-130a-3p下調(diào)和miR-27b-5p上調(diào)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明在SCC084/R和SCC131/R細(xì)胞中,共轉(zhuǎn)染的增效作用高于單個(gè)miRNA轉(zhuǎn)染組。miR-125a-5p上調(diào)/miR-27b-5p上調(diào)組的SCC084/R和SCC131/R細(xì)胞生存率低于單個(gè)miRNA轉(zhuǎn)染組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明miR-125a-5p上調(diào)/miR-27b-5p上調(diào)共轉(zhuǎn)染組在SCC084/R和SCC131/R細(xì)胞中增效作用高于單個(gè)miRNA轉(zhuǎn)染組,見(jiàn)表2。

表2 共轉(zhuǎn)染miRNA對(duì)化療后細(xì)胞毒性的調(diào)控作用

在5-FU用藥組中,與單個(gè)轉(zhuǎn)染組相比,miR-130a-3p下調(diào)/miR-27b-5p上調(diào)組未顯示出明顯的增效作用(P>0.05)。與單個(gè)轉(zhuǎn)染組相比,miR-125a-5p上調(diào)/miR-27b-5p上調(diào)組在SCC084/R和SCC9/R細(xì)胞中顯示出顯著增效作用(P<0.05),見(jiàn)表2。

2.3miRNA對(duì)耐藥OSCC凋亡和細(xì)胞周期影響 所選miRNA的表達(dá)水平改變顯著提高細(xì)胞凋亡水平,特別是晚期凋亡率。在SCC084/R細(xì)胞中,miR-27b-5p上調(diào)組、miR-125a-5p上調(diào)組早期凋亡率高于Sham組,miR-130a-3p下調(diào)組、miR-27b-5p上調(diào)組、miR-125a-5p上調(diào)組晚期凋亡率高于Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在SCC131/R細(xì)胞中,miR-130a-3p下調(diào)組、miR-27b-5p上調(diào)組、miR-125a-5p上調(diào)組早期凋亡率和晚期凋亡率高于Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 miRNA轉(zhuǎn)染對(duì)耐藥OSCC細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用

在SCC084/R細(xì)胞中,miR-125a-5p上調(diào)組、miR-130a-3p下調(diào)組G1期比例低于Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在SCC131/R細(xì)胞中,miR-125a-5p上調(diào)組G1期比例低于Sham組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 miRNA轉(zhuǎn)染對(duì)耐藥OSCC細(xì)胞周期的影響

2.4miRNA表型對(duì)OSCC耐藥通路的作用 為檢測(cè)所選miRNA對(duì)下游信號(hào)通路的影響,分析了一些潛在靶點(diǎn)。Western blotting分析表明,在SCC131/R中,相對(duì)于Sham組,miR-125a-5p上調(diào)組會(huì)降低DNMT1,MSK-1,Bcl-2和Bim的蛋白水平表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相對(duì)于Sham組,miR-130a-3p下調(diào)組MDR-1和Bcl-2蛋白水平下調(diào),XIAP蛋白水平上調(diào)(P<0.05)。相對(duì)于Sham組,增加miR-27b-5p的表達(dá)水平導(dǎo)致ErbB2和HDAC4的蛋白水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1,表5。由于上述通路大部分能靶向調(diào)控終端凋亡信號(hào),隨后進(jìn)一步分析下游凋亡通路,Caspase 3和Caspase9的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn),相對(duì)于Sham組,miR-130a-3p下調(diào)組,miR-27b-5p上調(diào)組,miR-125a-5p上調(diào)組,均能上調(diào)SCC131/R和SCC084/R細(xì)胞中Caspase 3和Caspase9蛋白的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2,表6。

圖1 miRNA轉(zhuǎn)染對(duì)耐藥OSCC細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響

圖2 miRNA轉(zhuǎn)染對(duì)耐藥OSCC細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白表達(dá)的影響

表5 miRNA轉(zhuǎn)染對(duì)耐藥OSCC細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用

表6 miRNA轉(zhuǎn)染對(duì)耐藥OSCC細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白表達(dá)的調(diào)控作用

在SCC084/R細(xì)胞中相對(duì)于Sham組,miR-125a-5p上調(diào)組會(huì)降低DNMT1,Bcl-2及Bim的蛋白水平表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相對(duì)于Sham組,miR-130a-3p下調(diào)組MDR-1和Bcl-2蛋白水平下調(diào),XIAP蛋白水平上調(diào)(P<0.05)。相對(duì)于Sham組,增加miR-27b-5p的表達(dá)水平導(dǎo)致ErbB2和HDAC4的蛋白表達(dá)下調(diào),同時(shí)p53的蛋白水平上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1,表5。由于上述通路大部分能靶向調(diào)控終端凋亡信號(hào),隨后進(jìn)一步分析下游凋亡通路,Caspase 3和Caspase9的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn),相對(duì)于Sham組,miR-130a-3p下調(diào)組,miR-27b-5p上調(diào)組,miR-125a-5p上調(diào)組,均能上調(diào)SCC131/R和SCC084/R細(xì)胞中Caspase 3和Caspase9蛋白的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2,表6。

3 討 論

化療耐藥嚴(yán)重影響OSCC患者的預(yù)后。識(shí)別或預(yù)后不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)對(duì)于患者能否得到個(gè)性化治療及其重要。Rajan等[16]對(duì)耐藥OSCC中特征性miRNA表達(dá)識(shí)別的研究表明,miRNA在OSCC的化療耐藥性和腫瘤生物學(xué)的表觀遺傳調(diào)節(jié)中可能起關(guān)鍵作用。

本研究的數(shù)據(jù)證明耐藥OSCC中特征性miRNA是導(dǎo)致該腫瘤的抗化療表型的原因之一。通過(guò)分析3個(gè)耐藥OSCC細(xì)胞系中的3個(gè)miRNA證實(shí),在三個(gè)細(xì)胞系中miR-125a-5p、miR-27b-5p和miR-130a-3p能顯著影響癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。而僅在SCC084/R的測(cè)試細(xì)胞系中,對(duì)5-FU的敏感性顯著提高。此外,三個(gè)miRNA的轉(zhuǎn)染都能影響細(xì)胞凋亡,可導(dǎo)致部分細(xì)胞G1期阻滯。Western blotting結(jié)果表明,這些miRNA在不同的耐藥性相關(guān)通路中調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn),包括凋亡的p53通路、DNA甲基化或組蛋白修飾。由于Bcl-2和p53都是凋亡依賴(lài)性通路的一部分,數(shù)據(jù)表明,miRNA不僅針對(duì)幾個(gè)不同的耐藥性相關(guān)通路,還針對(duì)單個(gè)通路中的不同關(guān)鍵蛋白質(zhì)。關(guān)于在凋亡信號(hào)中下游靶點(diǎn)Caspase 3和Caspase9的表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)。

本研究的miRNA與許多其他癌癥的化療耐藥性有關(guān),但部分結(jié)果相互矛盾:miR-125可提高宮頸癌對(duì)紫杉醇與順鉑的敏感性[17]但會(huì)增加胰腺癌對(duì)Gemcitabine 的耐藥性[18]。miR-130a的高表達(dá)與肝癌[19]對(duì)Gemcitabine的敏感性增加有關(guān),而其他報(bào)道顯示miR-130a增加了卵巢癌中鉑基化療的耐藥性[20]。miR-27b的下調(diào)能增加胃癌的多藥耐藥性[21],同時(shí)miR-27b的上調(diào)能提高順鉑耐藥口腔鱗癌的化療敏感性[22]。

本研究中,miRNA對(duì)順鉑或5-FU治療的不同影響可能是由這兩種藥物的具體作用機(jī)制引起的,5-FU是一種經(jīng)典的抗代謝藥物。這些藥物可抑制必要的生物合成過(guò)程,與DNA和(或)RNA結(jié)合,并損害其正常功能。順鉑通過(guò)與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)信號(hào)通路中的復(fù)雜相互作用發(fā)揮其抗癌功能。本研究中選擇的miR-125a-5p、miR-27b-5p、miR-130a-3p能作用于Bcl-2 和 p53通路,它們的主要作用與對(duì)順鉑相關(guān),與5-FU的相關(guān)性不明顯。

最后,同時(shí)操縱兩個(gè)miRNA的表達(dá)水平,在50%(miR-125a-5p/miR-130a-3p)和83%(miR-130a-3p/miR-27b-5p)的測(cè)試細(xì)胞系中表現(xiàn)出對(duì)治療的增敏效果。與miRNA共同轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為有限[23]。Zheng等[24]研究表明,與miR-125b和miR-141模擬物,增加了乳腺癌細(xì)胞系對(duì)Taxane-Anthracycline的耐藥性。Wang等[25]研究表明,聯(lián)合抑制以下兩個(gè)miRNA(miR-125a,miR-125b,miR-205)降低了Entinostat對(duì)乳腺癌細(xì)胞的凋亡作用。這些數(shù)據(jù)初步揭示了miRNA對(duì)化療耐藥的協(xié)同調(diào)控作用。

由于體外細(xì)胞不能完全反映遺傳背景下人腫瘤的異質(zhì)性,該模型的臨床參考價(jià)值有限。本研究通過(guò)使用三種不同的耐藥OSCC細(xì)胞系來(lái)“模仿”臨床樣本中的人腫瘤細(xì)胞的變異性來(lái)解決上述問(wèn)題。此前諸多項(xiàng)研究表明miRNA能影響大多數(shù)細(xì)胞系的化療耐藥性,這表明本研究觀察到的結(jié)果不局限于單個(gè)OSCC耐藥細(xì)胞系。