劉 威

(河北省衡水市人民醫(yī)院精神心理科,河北 衡水 053000)

抑郁癥是最常見(jiàn)的精神疾病之一,癥狀包括情緒低落、興趣下降,嚴(yán)重者有自殺傾向[1]。抑郁癥的發(fā)病率逐年上升。然而,目前的傳統(tǒng)抗抑郁藥物可能需要數(shù)周至數(shù)月才能產(chǎn)生有效的反應(yīng),約三分之一患者對(duì)現(xiàn)有的治療策略沒(méi)有反應(yīng)[2]。抑郁癥最有可能是由遺傳傾向和環(huán)境因素(如早期生活經(jīng)歷、生活事件和慢性壓力)之間的復(fù)雜相互作用引起的[3]。在抑郁個(gè)體的大腦和抑郁的動(dòng)物模型中已經(jīng)一致地描述了神經(jīng)可塑性變化[4-5]。表觀(guān)遺傳機(jī)制可能提供了環(huán)境壓力因素和基因表達(dá)之間的聯(lián)系[6],微小RNA(miRNAs)是由22～25個(gè)核苷酸序列組成的非編碼RNA,已被確定為生物過(guò)程的調(diào)節(jié)物。miRNAs可以特異性地與其靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(untranslated regions,UTR)結(jié)合,以促進(jìn)mRNA的降解或抑制其翻譯[7]。MiRNAs在腦組織中大量存在,并在調(diào)節(jié)腦功能中發(fā)揮許多關(guān)鍵作用,特別是在神經(jīng)再生、神經(jīng)可塑性和神經(jīng)元功能方面[8]。TLR4信號(hào)通路參與先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié),并與抑郁癥的免疫炎癥過(guò)程密切相關(guān)[9],是慢性不可預(yù)測(cè)輕度應(yīng)激抑郁小鼠海馬炎癥的主要參與者[10]。TLR4通過(guò)胞內(nèi)白細(xì)胞介素 1β(interlenkin 1β,1L-1β)同源結(jié)構(gòu)域激活,利用下游信號(hào)分子MyD88,介導(dǎo)效應(yīng)分子核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的活化,NF-κB轉(zhuǎn)位入核磷酸化,調(diào)節(jié)免疫炎癥因子的表達(dá)[11]。本研究旨在探究抑郁模型中參與腦組織保護(hù)的相關(guān)機(jī)制,建立CUMS大鼠模型,基于下游TLR4/MyD88篩選出上游靶向miR-326,通過(guò)干預(yù)miR-326來(lái)探究miR-326/TLR4/MyD88是否參與了抑郁模型腦組織的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Sprague-Dawley大鼠(200～220 g,8周)由湖北貝恩特生物科技有限公司提供,許可證號(hào)SYXK(鄂)2021-0119。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被飼養(yǎng)在干凈的動(dòng)物房中,并給予免費(fèi)的食物和水,12 h的晝夜交替光照,溫度(23±1)℃,濕度(55±2)%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本研究按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行,并經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)。

1.2慢性不可預(yù)測(cè)溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)誘導(dǎo)抑郁模型 CUMS模型誘導(dǎo)大鼠抑郁[12]。應(yīng)激方法有束縛、冰水游泳、禁食、禁水、晝夜顛倒、噪音刺激、夾尾等。大鼠每天至少接受一次應(yīng)激刺激,避免連續(xù)4周使用相同的刺激。對(duì)照組大鼠(n=6)不接受任何刺激。觀(guān)察并記錄大鼠體重的變化,制備4周CUMS模型后,隨機(jī)選擇18只大鼠,采用蔗糖偏好測(cè)試(sucrose preference test,SPT)、曠場(chǎng)測(cè)試(open field test,OFT)、強(qiáng)迫游泳測(cè)試(forced swim test,FST)、高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)檢測(cè)大鼠的抑郁樣行為。

為了研究miR-326對(duì)抑郁大鼠的作用,將CUMS大鼠隨機(jī)分為CUMS組、CUMS+agomiR NC組和CUMS+agomiR 326組,每組6只。最后1次CUMS暴露后,進(jìn)行側(cè)腦室注射[13]。具體步驟如下,首先使用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,將大鼠置于立體定位儀上。在顱骨上的皮膚上做一個(gè)切口,用微鉆在目標(biāo)位置(雙側(cè)海馬)上方的顱骨上打2個(gè)小洞。使用微量注射器將20 μL miR-326 agomiR溶液(含有10 nmol miR-326 agomiR)或agomiR NC(含有10 nmol agomiR NC)(廣州市銳博生物科技有限公司,廣州,中國(guó))雙向注射到海馬內(nèi)[14]。注射時(shí)間超過(guò)5 min,允許緩慢擴(kuò)散。對(duì)照組大鼠以同樣的方式注射相同數(shù)量的鹽水。在注射后1周進(jìn)行行為測(cè)試,之后將大鼠安樂(lè)死,收集解剖其大腦并分離下丘腦、海馬組織用于生化分析。

1.3SPT SPT是一種廣泛接受的類(lèi)似抑郁行為的測(cè)量方法[15]。在測(cè)試之前,大鼠保持禁食水,并且用2瓶1%蔗糖溶液使大鼠適應(yīng)環(huán)境。在接下來(lái)的24 h內(nèi),用自來(lái)水替換其中一瓶1%蔗糖溶液。測(cè)試當(dāng)天,給大鼠200 mL自來(lái)水和200 mL 1%蔗糖溶液。12 h后,將瓶子交換1次。24 h后,收集瓶子。蔗糖消耗/總水消耗表示為蔗糖偏好。

1.4OFT OFT被用來(lái)評(píng)估動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)。該裝置是一個(gè)120 cm×90 cm×35 cm的不透明開(kāi)口盒,周?chē)呛谏摹：凶拥牡撞勘话拙€(xiàn)分成25個(gè)正方形。外圍的16個(gè)方塊被認(rèn)為是外圍站點(diǎn),中間的9個(gè)方塊被認(rèn)為是中心區(qū)域。在安靜的環(huán)境中,將大鼠單獨(dú)放置在裝置的角落中,并允許其自由探索5 min。測(cè)試前30 min,動(dòng)物被放入實(shí)驗(yàn)室以適應(yīng)環(huán)境。每次測(cè)試后,用70%的乙醇徹底清洗該裝置。通過(guò)VideoTrack動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(VideoTrack 3.0,Viewpoint,French)收集和分析大鼠活動(dòng)數(shù)據(jù)。

1.5EPM 使用EPM檢測(cè)大鼠的焦慮樣行為[16]。大鼠被放置在EPM裝置的中間,用攝像機(jī)記錄其行為5 min。大鼠在張開(kāi)的雙臂中度過(guò)的時(shí)間百分比用作評(píng)價(jià)焦慮樣行為的指標(biāo)。每次測(cè)試后,將迷宮清理干凈。

1.6FST FST是評(píng)估動(dòng)物絕望行為的經(jīng)典方法,可以顯示嚙齒類(lèi)動(dòng)物的抑郁程度[15]。將大鼠置于水溫為(25±1)℃、深度為30 cm的垂直有機(jī)玻璃圓筒(45 cm×20 cm)中。在5 min內(nèi)記錄大鼠的靜止時(shí)間。

1.7酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 定量ELISA試劑盒(ZK-R3347,ZK-R3052和ZK-r 3397;深圳子科生物科技有限公司,深圳,中國(guó))用于測(cè)定下丘腦中去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、多巴胺(dopamine,DA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的含量。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR) 將大鼠海馬組織磨碎并加入細(xì)胞裂解物中。使用RrimeScript從細(xì)胞中提取總RNARTreagen試劑盒(TaKaRa,大連,中國(guó))。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度,以A260/A280≥1.80為合格標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)DBI-2220 Bestar的說(shuō)明,將來(lái)自每個(gè)樣品的1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA銩qPCR RT試劑盒(TaKaRa)。使用SYBR進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa)和iQ5實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories,California,USA)。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,73 ℃ 30 s,連續(xù)循環(huán)38次。引物序列見(jiàn)表1,U6用作內(nèi)參。采用2-δδCt方法。

表1 qRT-PCR引物序列

1.9雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 為了闡明miR-326的靶向作用,進(jìn)行了體外熒光素酶實(shí)驗(yàn),測(cè)試miR-326與TLR4 3'UTR之間的相互作用。Targetscan生物信息學(xué)網(wǎng)站(https://www.targetscan.org/vert_72/)顯示,TLR4是miR-326的潛在目標(biāo)。銳博生物科技有限公司構(gòu)建并合成了4種不同的重組載體:pmirGLO-TLR4-WT、pmirGLO-TLR4-MUT。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)將報(bào)告載體與miR-326 mimic(或miR-NC)共同轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),上海,中國(guó))。

1.10Western Blot 總蛋白提取試劑盒(Beyotime,北京,中國(guó))用于從海馬組織中提取總蛋白。使用增強(qiáng)型BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(Beyotime)測(cè)量蛋白濃度。裝載總共50 μg蛋白質(zhì),并通過(guò)SDS-PAGE分離。然后,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon,Millipore,MA)上。室溫下用含5%脫脂牛奶的TBST封閉膜2 h。然后,將膜與第一抗體在4 ℃孵育過(guò)夜。一抗具體信息如下:TLR4(1∶1 000,ab217274,135 000)、MyD88(1∶1 000,ab219413,33 000)、β-actin(1∶1 000,ab8227,42 000)。用TBST洗滌后,將膜與HRP綴合的山羊抗兔第二抗體在室溫孵育2 h。然后,使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑顯影該膜。所有抗體購(gòu)自abcam(Cambridge,MA,USA)用NIH Image J 7.0分析每個(gè)條帶的灰度值。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CUMS導(dǎo)致大鼠抑郁樣行為 慢性低強(qiáng)度應(yīng)激是抑郁癥的主要原因之一,CUMS通過(guò)每天給予模型動(dòng)物不同的刺激來(lái)誘導(dǎo)抑郁。CUMS組大鼠體重、蔗糖消耗量、OFT中心區(qū)域停留時(shí)間及張開(kāi)手臂時(shí)間低于對(duì)照組,FST靜止時(shí)間明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。表明,CUMS導(dǎo)致大鼠抑郁樣行為。

表2 慢性不可預(yù)測(cè)的輕度應(yīng)激導(dǎo)致大鼠抑郁樣行為

2.2過(guò)表達(dá)miR-326抑制大鼠抑郁樣行為 qRT-PCR顯示,暴露于CUMS后,CUMS組大鼠海馬組織中miR-326表達(dá)顯著低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),為了研究miR-326對(duì)CUMS大鼠的作用,將miR-326 agomir注射到大鼠海馬中,CUMS+agomiR 326組大鼠海馬組織中miR-326表達(dá)高于CUMS+agomiR NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。體重及行為測(cè)試顯示,CUMS+agomiR 326組大鼠體重、蔗糖消耗量、OFT中心區(qū)域停留時(shí)間及開(kāi)放臂停留時(shí)間顯著高于CUMS+agomiR NC組,FST靜止時(shí)間明顯低于CUMS+agomiR NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 qRT-PCR檢測(cè)大鼠海馬組織miR-326表達(dá)水平

表4 過(guò)表達(dá)miR-326抑制大鼠抑郁樣行為

2.3過(guò)表達(dá)miR-326保護(hù)抑郁大鼠腦組織 根據(jù)神經(jīng)激素假說(shuō),抑郁癥與DA和/或5-HT代謝調(diào)節(jié)活動(dòng)有關(guān)。檢測(cè)下丘腦中的神經(jīng)遞質(zhì)含量,結(jié)果顯示,CUMS組NE、DA和5-HT水平顯著低于對(duì)照組,而上調(diào)miR-326的表達(dá)后,CUMS+agomiR 326組NE、DA和5-HT水平顯著高于CUMS+agomiR NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表5。表明,海馬組織中過(guò)表達(dá)miR-326保護(hù)抑郁大鼠腦組織。

表5 過(guò)表達(dá)miR-326保護(hù)抑郁大鼠腦組織

2.4miR-326靶向調(diào)控TLR4/MyD88信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)抑郁大鼠的保護(hù)作用 為了進(jìn)一步研究miR-326對(duì)抑郁大鼠的潛在作用機(jī)制,通過(guò)TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)了miR-326的下游靶基因,并在其中關(guān)注到了TLR4。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是先天免疫的識(shí)別蛋白,發(fā)現(xiàn)于腦室周?chē)鞴俸兔}絡(luò)叢。因此推測(cè)miR-326通過(guò)TLR4對(duì)抑郁大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-326與TLR4的結(jié)合位點(diǎn)(圖1),然后在HEK293T中進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其靶向結(jié)合關(guān)系,見(jiàn)表6。Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬組織TLR4結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)CUMS誘導(dǎo)后,CUMS組大鼠TLR4蛋白和MyD88蛋白水平顯著高于對(duì)照組,而在過(guò)表達(dá)miR-326后,CUMS+agomiR 326組大鼠TLR4蛋白和MyD88蛋白水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表7。表明,miR-326靶向miR-326靶向調(diào)控TLR4/MyD88信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)抑郁大鼠的保護(hù)作用。

圖1 TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-326與TLR4靶向結(jié)合位點(diǎn)

表6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-326與TLR4靶向結(jié)合

表7 Western blot檢測(cè)各組海馬組織TLR4/MyD88蛋白的表達(dá)

3 討 論

抑郁癥是一種常見(jiàn)的精神疾病,其具有一系列對(duì)身體、認(rèn)知、情感和社會(huì)活動(dòng)過(guò)程產(chǎn)生影響的癥狀。它的特點(diǎn)主要是情緒低落,易悲傷,易失眠,且對(duì)學(xué)習(xí)、工作、生活缺乏興趣等等。作為造成全球社會(huì)負(fù)擔(dān)的主要原因之一,抑郁癥的主要治療方法依賴(lài)于藥物和心理干預(yù)[17-18]。雖然這些療法具有一定的良性效果,但仍有三分之一接受這些抗抑郁藥物干預(yù)的患者并未產(chǎn)生正反饋,而其他即使產(chǎn)生藥物良性反饋的患者由于藥物本身的許多不良反應(yīng)而癥狀沒(méi)有得到完全緩解或時(shí)常復(fù)發(fā)[19-20]。因此,探究抑郁癥的相關(guān)具體調(diào)控分子機(jī)制,顯得尤為重要。臨床證據(jù)已經(jīng)表明了神經(jīng)炎癥在抑郁癥等腦部疾病中起到的重要作用[21],臨床研究和基于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的研究表明,反復(fù)暴露于社會(huì)和環(huán)境的刺激中會(huì)引起體內(nèi)免疫相關(guān)的劇烈變化,例如:血液和大腦中促炎細(xì)胞因子的大量積累和抗炎細(xì)胞因子的減少[22-24],而作為大腦中先天免疫系統(tǒng)中第一道防線(xiàn)的主要細(xì)胞成分,小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[25]?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞可以釋放促炎細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子α 和一氧化氮,以及抗炎細(xì)胞因子,如IL-4和IL-10。已經(jīng)有研究明確表明,人類(lèi)在急性心理應(yīng)激的刺激下會(huì)持續(xù)增加循環(huán)的炎癥因子[26]。CUMS是一種為了模擬社會(huì)和環(huán)境應(yīng)激源下心理變化的實(shí)驗(yàn)方法[27],已被證實(shí)可以引起海馬小膠質(zhì)細(xì)胞激活[28-29]。本研究通過(guò)CUMS誘導(dǎo)建立抑郁樣大鼠模型,并通過(guò)各種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)模型的成功建立。

MicroRNA作為一種非編碼RNA已經(jīng)被證明富含于腦組織中,并與多種腦部疾病相關(guān)聯(lián)。miR-139-5p是大腦中富含的神經(jīng)元miRNA,對(duì)抑郁大鼠的神經(jīng)元起保護(hù)作用[30];Li等[31]的研究表明,miR-26a-3p在抑郁大鼠的海馬組織中顯著下調(diào),其可增強(qiáng)自噬/溶酶體活性,促進(jìn)突觸的可塑性最終抑制神經(jīng)元凋亡。還有一項(xiàng)研究表明,miR-326低表達(dá)可能與抑郁有潛在的聯(lián)系[32],本研究通過(guò)檢測(cè)CUMS誘導(dǎo)的抑郁大鼠模型海馬組織中miR-326發(fā)現(xiàn)其呈低表達(dá),進(jìn)一步,通過(guò)miR-326 agomiR上調(diào)其在海馬中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)其可能對(duì)抑郁樣行為起抑制作用。

TLR4/MyD88參與了抑郁癥的發(fā)展[33],本研究通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出TLR4上游靶向調(diào)控miR-324,并進(jìn)一步檢測(cè)到當(dāng)調(diào)控miR-324時(shí),下游TLR4/MyD88通路隨之發(fā)生變化,這預(yù)示著TLR4/MyD88通路可能參與miR-326調(diào)控的大鼠抑郁樣行為。

總之,在CUMS誘導(dǎo)的抑郁大鼠中,調(diào)控miR-326可能通過(guò)TLR4/MyD 88對(duì)抑郁樣行為及大鼠海馬區(qū)產(chǎn)生影響。雖然僅探究了單一一條分子機(jī)制,但未來(lái)隨著分子機(jī)制的一一解析,現(xiàn)在的成果終將成為攻克該病的基石。