胡洋洋， 張興， 羅越， 王亞東， 趙彩彥

河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院湘江院區(qū)感染肝病科， 石家莊 050051

肝衰竭是由多種因素引起的肝臟嚴(yán)重?fù)p害，具有病情進(jìn)展迅速、病死率高等特點(diǎn)。以免疫炎癥損傷為核心的“二次打擊學(xué)說”是肝衰竭發(fā)病關(guān)鍵機(jī)制。細(xì)胞自噬在肝臟免疫炎癥損傷過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。近年研究表明自噬通過調(diào)節(jié)炎癥小體活化、對抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡等機(jī)制對肝衰竭發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。本文就自噬在肝衰竭中的變化、調(diào)控機(jī)制及其作為肝衰竭治療靶點(diǎn)的潛在前景作一綜述。

1 自噬在肝衰竭中的變化特點(diǎn)

自噬是一種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制，由30余種自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，Atg）及其編碼的Atg蛋白分子家族所介導(dǎo)，參與細(xì)胞質(zhì)質(zhì)量控制、新陳代謝、免疫調(diào)控等過程。尤其選擇性自噬通過降解受損細(xì)胞器，發(fā)揮細(xì)胞“清道夫”作用［1］。在肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中存在自噬受損現(xiàn)象，而代償性激活自噬可通過抑制肝細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集、脂質(zhì)堆積、氧化應(yīng)激、細(xì)胞炎癥與死亡，維持肝細(xì)胞生存穩(wěn)態(tài)。

Ren等［2］研究證實(shí)，HBV相關(guān)急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）患者肝組織自噬相關(guān)分子Atg7、Atg5、Beclin-1表達(dá)顯著降低。同樣，慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）患者肝組織Atg5、Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)也顯著降低，且伴隨自噬底物連接蛋白p62聚集性升高［3］。Wu等［4］研究則發(fā)現(xiàn)終末期肝病模型（model for end-stage liver disease，MELD）評分＞25的ACLF患者脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）水平顯著高于MELD評分≤25患者，進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)顯示LPS通過p38MAPK信號通路抑制肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）自噬，并伴隨HSC來源的IL-1β及其前體表達(dá)增加。上述研究證實(shí)肝衰竭患者存在自噬受損并可因此誘發(fā)或加重肝臟炎癥反應(yīng)。由D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）/LPS或CCl4誘導(dǎo)的肝衰竭動物模型顯示，在急性肝損傷（acute liver injury，ALI）早中期，肝臟自噬水平升高，當(dāng)進(jìn)展至肝衰竭階段自噬水平卻降低，激活自噬顯著減輕肝臟炎癥損傷，提高ALF小鼠存活率［2，5］。因此，自噬在肝衰竭發(fā)生發(fā)展不同階段存在動態(tài)變化，且對肝衰竭發(fā)揮保護(hù)作用。在對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）誘導(dǎo)的動物和肝細(xì)胞損傷模型中也均可觀察到自噬激活現(xiàn)象，后者通過去除受損線粒體發(fā)揮肝臟保護(hù)作用［6-7］。但過量APAP通過損害自噬通量，導(dǎo)致受損線粒體不能被有效清除，增加線粒體氧化應(yīng)激，造成肝細(xì)胞壞死［8］。值得注意的是，刀豆素A誘導(dǎo)的ALI小鼠模型中，自噬呈過度激活并誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞活化，加劇肝臟免疫炎癥反應(yīng)，甚至觸發(fā)肝細(xì)胞自噬性死亡，小鼠存活率顯著降低［9］。由此可見，雖然不同病因、不同階段的肝衰竭存在自噬強(qiáng)度和方向的差異，也影響著肝衰竭疾病轉(zhuǎn)歸和結(jié)局，但更多證據(jù)支持適度自噬有利于限制肝衰竭發(fā)生發(fā)展。

2 自噬參與肝衰竭保護(hù)作用的機(jī)制

2.1 調(diào)節(jié)Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）炎癥小體信號 NLRP3炎癥小體由Nod樣受體、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteiny aspartate-specific protease-1，caspase-1）組成，通過介導(dǎo)IL-1β和IL-18成熟信號，調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)。Jia等［10］發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)ACLF患者肝組織中NLRP3及caspase-1、IL-18和IL-1β表達(dá)水平升高，是造成肝臟持續(xù)性炎癥損傷的重要原因。ALF小鼠模型肝組織中NLRP3、ASC、caspase-1等也顯著升高，并伴隨肝細(xì)胞空泡變性和壞死增加［11］，因此NLRP3炎性小體激活是肝衰竭炎癥損傷核心機(jī)制之一。

在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的ALF小鼠模型中，應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿〤AY10683修飾自噬相關(guān)蛋白ULK1 K68賴氨酸位點(diǎn)，上調(diào)ULK1表達(dá)，繼而抑制NLRP3活化改善肝功能［12］。應(yīng)用LPS處理人HSC細(xì)胞株LX2后，Atg13、LC3-Ⅱ表達(dá)呈劑量依賴性下降，并伴隨NLRP3、IL-1β及其前體的表達(dá)增加，當(dāng)LX2細(xì)胞暴露于自噬抑制劑巴佛洛霉素A1可進(jìn)一步促進(jìn)p62積累、NLRP3活化和IL-1β產(chǎn)生［4］。上述研究均提示自噬參與對NLRP3炎性小體的調(diào)控，并因此影響肝臟免疫炎癥損傷。此外，NF-κB參與上調(diào)NLRP3和IL-1β前體等轉(zhuǎn)錄表達(dá)，是NLRP3炎癥小體激活的重要信號。Shan等［13］發(fā)現(xiàn)APAP誘導(dǎo)的ALI小鼠肝組織NLRP3、caspase-1、IL-1β表達(dá)均明顯增加，自噬激活劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）可顯著抑制APAP誘導(dǎo)的NF-κB核移位以及NLRP3通路活化。反之，抑制自噬則使IκBα受抑和p-NF-κBp65蛋白表達(dá)增加，激活NF-κB，上調(diào)NLRP3信號通路相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

體外細(xì)胞研究［14］也證實(shí)，生長停滯特異蛋白6信號通路介導(dǎo)的自噬通過抑制肝臟Kupffer細(xì)胞中caspase-1的激活，抑制促炎因子生成，阻止肝臟炎癥反應(yīng)進(jìn)展。此外，應(yīng)用LPS刺激體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞顯示ASC呈p62依賴性降解，抑制炎癥小體活性［15］。綜上，自噬通過抑制NF-κB核移位減少炎癥小體轉(zhuǎn)錄、抑制caspase-1活性以及吞噬和降解NLRP3炎性小體成分等機(jī)制負(fù)性調(diào)控NLRP3炎癥小體活性，從而減輕肝衰竭炎癥損傷。

2.2 抑制氧化應(yīng)激 氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肝損傷也是肝衰竭發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，由于機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度生成和積聚，從而造成肝細(xì)胞廣泛而不可逆性死亡。在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的ALF小鼠肝組織以及LPS處理的巨噬細(xì)胞RAW264.7和HSC中均可檢測到大量ROS產(chǎn)生，從而消耗內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等細(xì)胞成分受損，加劇肝細(xì)胞死亡［16-17］。

研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬通過選擇性清除受損線粒體，減少APAP誘導(dǎo)的受損肝細(xì)胞ROS產(chǎn)生，減輕肝臟氧化應(yīng)激性損傷。在自噬相關(guān)分子Atg5缺陷的敗血癥小鼠模型中，肝細(xì)胞內(nèi)受損線粒體大量積累，通過增加線粒體ROS的產(chǎn)生并啟動線粒體凋亡途徑，加速器官功能衰竭［18］。自噬選擇性清除功能障礙線粒體的機(jī)制復(fù)雜，可能與PTEN誘導(dǎo)性激酶蛋白1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）-Parkin信號通路相關(guān)。Wang等［19］通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)PINK1和Parkin雙敲除小鼠在APAP處理后自噬小體和溶酶體數(shù)量減少，并且線粒體蛋白泛素化和p62蛋白移位明顯減少，延遲肝臟谷胱甘肽還原，進(jìn)而加速肝細(xì)胞壞死及小鼠死亡。自噬調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的另一機(jī)制由核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）介導(dǎo)。生理?xiàng)l件下，Nrf2與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1結(jié)合而處于失活狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時可被磷酸化的p62激活，繼而結(jié)合細(xì)胞核抗氧化反應(yīng)元件，上調(diào)抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞對氧化應(yīng)激性損傷的防御。在過量APAP誘導(dǎo)的ALI早期，p62、磷酸化p62水平顯著上調(diào)，并促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核內(nèi)移位，上調(diào)抗氧化基因血紅素加氧酶-1、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）等細(xì)胞保護(hù)酶表達(dá)，代償性對抗氧化應(yīng)激，下調(diào)肝細(xì)胞ROS水平，降低肝細(xì)胞損傷風(fēng)險［20］。Ruart等［21］檢測CCl4處理的大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞顯示早期階段（4周）可觀察到自噬增強(qiáng)，而晚期（6周）自噬強(qiáng)度不再變化。進(jìn)一步通過敲除肝竇內(nèi)皮細(xì)胞Atg7的動物模型證實(shí)，僅在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中Nrf2依賴性抗氧化基因GCLC、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Mu等表達(dá)上調(diào)，提示自噬缺陷是Nrf2激活的重要觸發(fā)因素。綜上，在肝衰竭發(fā)病機(jī)制中自噬與Nrf2信號通路均參與調(diào)控氧化應(yīng)激與抗氧化機(jī)制的平衡，并且在其調(diào)控過程中呈現(xiàn)時間和空間差異。

自噬對抗氧化應(yīng)激的過程同時也參與NLRP3炎癥小體活性調(diào)控，說明兩種機(jī)制存在交叉。高濃度ROS可使硫氧還蛋白相互作用蛋白與硫氧還蛋白解離，直接與NLRP3相互作用，激活NLRP3炎癥小體。Yang等［22］檢測RAPA處理的肝損傷小鼠模型肝組織顯示，增強(qiáng)的自噬能夠清除過量釋放的ROS，下調(diào)硫氧還蛋白相互作用蛋白/NLRP3軸，從而抑制小鼠肝臟中NLRP3炎癥小體活化。由PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬也可通過清除線粒體ROS抑制肝組織NLRP3炎癥小體活化、線粒體氧化應(yīng)激，從而減輕黃曲霉素B1誘導(dǎo)的小鼠肝組織炎癥損傷［23］。上述研究揭示了自噬和氧化應(yīng)激、NLRP3炎癥小體之間的新聯(lián)系，自噬在肝衰竭發(fā)病機(jī)制的調(diào)控中具有樞紐作用。

2.3 調(diào)控細(xì)胞凋亡 TNF/TNF受體系統(tǒng)激活介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡同樣是ALF發(fā)病重要分子機(jī)制之一。自噬調(diào)控細(xì)胞凋亡對維持細(xì)胞生存具有重要意義。Ahmedy等［24］在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的ALF小鼠肝組織中觀察到細(xì)胞凋亡增加，p53和caspase-3、Bax表達(dá)顯著上調(diào)，而在誘導(dǎo)ALF發(fā)生前應(yīng)用柚皮素可使升高的caspase-3、p53和Bax水平分別降低49%、34%和54%，并且這種抑制細(xì)胞凋亡的作用可被自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤消除。不僅如此，自噬還可在轉(zhuǎn)錄水平抑制TNF-α等炎癥因子表達(dá)，或抑制TNF-α介導(dǎo)的半胱氨酸蛋白酶激活途徑保護(hù)肝細(xì)胞免于凋亡。另一方面，線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡的早期事件，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤通過降低ALF體外模型細(xì)胞L-02線粒體膜電位，增加細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、細(xì)胞色素C水平，對抗自噬介導(dǎo)的抗肝細(xì)胞凋亡作用［25］。Oami等［18］通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，條件性Atg5基因敲除小鼠的肝細(xì)胞線粒體損傷和細(xì)胞凋亡加速，可能由于自噬缺陷誘導(dǎo)了線粒體死亡途徑，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡。自噬不僅參與調(diào)控肝細(xì)胞凋亡，Tian等［26］發(fā)現(xiàn)抑制自噬也可以促進(jìn)HSC凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)生成減少，加速ALF肝臟實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)的塌陷；利用RAPA激活自噬可抑制一氧化氮介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，保護(hù)HSC，為再生肝細(xì)胞提供支架。以上研究表明，自噬參與肝細(xì)胞和HSC凋亡的調(diào)控過程以減輕肝組織損傷，并且TNF-α、線粒體膜電位、一氧化氮等分子信號在其中發(fā)揮重要作用（圖1）。

圖1 自噬在肝衰竭中的保護(hù)作用機(jī)制Figure 1 The protective mechanism of autophagy in liver failure

3 調(diào)控自噬對肝衰竭治療的價值

3.1 外泌體與自噬 外泌體是膜衍生的納米級囊泡（直徑為30～150 nm），可攜帶蛋白質(zhì)、脂類和核酸等多種組分，參與清除致病或受損的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)、介導(dǎo)細(xì)胞間通訊［27-28］。越來越多研究［29］證實(shí)，自噬與外泌體存在交互作用，自噬可以降解功能失調(diào)的外泌體，而外泌體又可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。Shen等［30］建立Atg5-/-AML12細(xì)胞模型顯示，經(jīng)IL-1β/TNF處理后的AML12細(xì)胞可分離出含損傷相關(guān)分子模式的外泌體，后者進(jìn)一步上調(diào)Kupffer細(xì)胞IL-1、IL-6等基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)失衡、溶酶體通透改變，加重炎癥反應(yīng)。國內(nèi)學(xué)者最新臨床研究［31-33］證實(shí)肝衰竭患者肝臟來源的外泌體數(shù)量、組分及功能方面均存在差異性變化，且影響著肝衰竭患者疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后轉(zhuǎn)歸。

Yang等［34］體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞后分離提取外泌體，并將其應(yīng)用于肝臟缺血再灌注小鼠模型顯示，處理后小鼠肝組織LC3-Ⅱ、Beclin-1水平升高，p62/SQSTM1水平降低，抑制肝細(xì)胞變性和壞死，證實(shí)外泌體可以通過增強(qiáng)自噬減輕肝臟損傷。此外，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體通過輸送微小核糖核酸let-7a-5p靶向MAP4K3-轉(zhuǎn)錄因子EB信號通路恢復(fù)ACLF小鼠肝組織自噬通量，有效減輕肝細(xì)胞損傷和凋亡［35］。綜上，自噬缺陷可能促進(jìn)肝細(xì)胞分泌損傷相關(guān)分子模式外泌體，激活巨噬細(xì)胞引起炎癥，而干細(xì)胞來源的外泌體則通過增強(qiáng)自噬發(fā)揮肝臟保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用外泌體治療肝衰竭提供策略。

3.2 過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）與自噬 PPARα激動劑亦可通過促進(jìn)ALF小鼠Atg5、Atg7、溶酶體膜相關(guān)蛋白-1和LC3-Ⅱ表達(dá)，延緩ALF進(jìn)展；抑制自噬則逆轉(zhuǎn)PPARα的肝臟保護(hù)作用，促進(jìn)炎癥因子和趨化因子表達(dá)上調(diào)，加劇肝臟炎癥損傷。Ren等［2］證實(shí)抑制糖原合成酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）活性可通過增加PPARα表達(dá)激活自噬減輕肝臟損傷，應(yīng)用siRNA沉默PPARα表達(dá)則逆轉(zhuǎn)上述作用。磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）也通過影響PPARα活性參與肝衰竭自噬激活。Liu等［36］報道在miR-19a調(diào)控的肝細(xì)胞AMPK/PPARα自噬信號通路中，miR-19a通過激活A(yù)MPK增強(qiáng)PPARα的轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)。此外，PPARα激動劑非諾貝特通過激活自噬、降低肝臟ROS和脂質(zhì)過氧化有效減輕APAP誘導(dǎo)的ALI。因此，調(diào)控PPARα活性為靶點(diǎn)的信號分子可為激活自噬發(fā)揮肝衰竭保護(hù)作用提供新思路。

3.3 其他 自噬作為拮抗肝細(xì)胞炎癥和壞死的核心機(jī)制，還受其他多種分子信號調(diào)控。例如，RAPA靶蛋白抑制劑西羅莫司可增強(qiáng)自噬，減輕肝細(xì)胞損傷與死亡，目前已在動物或體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袘?yīng)用［22，37］。煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶抑制劑FK866通過抑制c-Jun氨基末端激酶信號通路誘導(dǎo)自噬，對D-GalN/LPS和刀豆素A誘導(dǎo)的ALF小鼠發(fā)揮保護(hù)作用［38］。可溶性T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3也可以增加ALF小鼠肝臟CD11b+巨噬細(xì)胞中LC3-Ⅱ的水平，促進(jìn)自噬小體形成，減少肝臟炎癥介質(zhì)產(chǎn)生［39］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也可以通過PI3K/Akt途徑調(diào)節(jié)自噬以減輕ALF肝細(xì)胞凋亡與肝組織炎癥反應(yīng)，而其旁分泌的血紅素加氧酶-1也參與自噬的調(diào)節(jié)［40］。雖然上述研究尚有待進(jìn)一步深入，但相關(guān)機(jī)制探索為臨床發(fā)掘基于自噬調(diào)控的分子靶向治療提供了一系列的研究思路和開發(fā)靶位。

4 結(jié)語與展望

綜上，自噬是保護(hù)肝細(xì)胞免受炎癥損傷的重要機(jī)制。靶向激活自噬將可能成為肝衰竭治療領(lǐng)域的重要課題。雖然目前將調(diào)控自噬作為肝衰竭治療的靶點(diǎn)尚存在諸多問題和體內(nèi)實(shí)踐應(yīng)用的風(fēng)險，包括：（1）目前研究大多局限于細(xì)胞和動物模型，在肝衰竭特定的炎癥背景下激活自噬的具體分子調(diào)控機(jī)制和信號通路仍待深入；（2）自噬信號通路涉及多種分子調(diào)節(jié)機(jī)制，但目前尚未評價出最佳分子調(diào)控靶位；（3）尚無特異性靶向肝臟的自噬激活劑，在激活肝臟自噬的同時可能使患者面臨其他臟器細(xì)胞自噬性死亡和腫瘤發(fā)生的風(fēng)險；（4）自噬具有抑制HSC凋亡為再生細(xì)胞提供支架作用，但HSC凋亡過度抑制可能導(dǎo)致肝纖維化加重，降低自噬激活劑在臨床應(yīng)用的安全性。但自噬通過參與調(diào)控NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、對抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡等方式發(fā)揮對肝衰竭的保護(hù)作用毋庸置疑，以調(diào)控外泌體、PPARα等為靶點(diǎn)的自噬活化策略也將有望成為肝衰竭分子靶向治療的重要策略。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：胡洋洋負(fù)責(zé)查閱文獻(xiàn)，撰寫文章；張興、羅越負(fù)責(zé)校對文章；王亞東負(fù)責(zé)指導(dǎo)立題及修改；趙彩彥負(fù)責(zé)審閱文章等。