李興元， 楊艷芳， 陳琰， 胡文慧， 趙小英， 唐俊明， 孔德營(yíng)

1 遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 貴州 遵義 563000； 2 貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng) 550002； 3 湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 湖北 十堰 442000

部分肝切除（partial hepatectomy，PH）術(shù)是治療肝腫瘤、肝內(nèi)膽管結(jié)石等疾病的重要手段，但術(shù)后肝衰竭的發(fā)生嚴(yán)重影響患者預(yù)后，甚至導(dǎo)致患者短期內(nèi)死亡，無法達(dá)到治療疾病的目的［1］。PH術(shù)后的順利恢復(fù)主要取決于剩余肝臟的迅速再生以及肝功能的迅速恢復(fù)［2］，因此研究肝臟再生的過程及其調(diào)控機(jī)制十分重要。有研究［3］表明補(bǔ)體系統(tǒng)在調(diào)控兩棲類動(dòng)物肢體再生過程中發(fā)揮了重要作用，在一些有尾動(dòng)物中，其肢體胚芽細(xì)胞的再生起始于C3組分的表達(dá)。補(bǔ)體應(yīng)答基因32（response gene to complement 32，RGC32）是一種重要的補(bǔ)體激活基因，補(bǔ)體系統(tǒng)被激活后會(huì)促進(jìn)其表達(dá)［4］。RGC32在肝臟再生過程中是否也發(fā)揮重要作用，目前尚不清楚。本研究旨在觀察小鼠PH術(shù)后肝再生過程中肝臟的結(jié)構(gòu)和功能變化，不同時(shí)期細(xì)胞增殖情況，以及不同時(shí)期RGC32的表達(dá)變化，分析PH術(shù)后肝再生過程中RGC32對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 10周齡雄性C57BL/6小鼠42只，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2019-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2019-0031。L02細(xì)胞來自于湖北省胚胎干細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（ab29）購(gòu)自Abcam公司。RGC32（bs-9079R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。ALT、AST檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑購(gòu)自Toyobo公司。油紅O染色液（GP1067）、Ki67（GB121141）、脂肪固定液（G1119）、抗熒光淬滅封片劑（G1401）、檸檬酸修復(fù)緩沖液（G1201）、PBS緩沖液（G0002）購(gòu)自武漢塞維爾生物有限公司。DAB免疫染色試劑（ZLI-9018）、蘇木素染色液（ZLI-9610）購(gòu)自北京中杉金橋。EdU（Cy3）染色試劑盒（K1075）購(gòu)自Apexbio。

1.2 方法

1.2.1 小鼠PH模型的制備 42只10周齡雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組［切除小鼠完整的肝臟稱重、拍照作為正常對(duì)照（sham組），進(jìn)一步切除肝左葉和肝中葉后稱重、拍照作為手術(shù)對(duì)照（0 d組），sham組和0 d組共用一組小鼠］、術(shù)后1天組（1 d）、術(shù)后2天組（2 d）、術(shù)后4天組（4 d）、術(shù)后6天組（6 d）、術(shù)后8天組（8 d）和術(shù)后10天組（10 d），每組6只。手術(shù)操作均在SPF級(jí)環(huán)境中完成。小鼠提前一天用脫毛膏脫去胸腹部的毛。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天稱量小鼠體質(zhì)量并記錄。異氟烷吸入式氣體麻醉，麻醉后仰臥于鋪有37 ℃加熱墊的操作案板上，用手術(shù)膠帶固定其四肢。碘伏消毒，于上腹劍突處水平切開，打開腹腔，暴露小鼠肝臟，用6-0絲線結(jié)扎肝左葉并切除，再用6-0絲線結(jié)扎肝中葉并切除，用4-0外科縫線縫合關(guān)腹，碘伏消毒。分別于術(shù)后1、2、4、6、8、10天處死小鼠，收集血清和肝臟組織。

1.2.2 HE染色 5 μm厚的石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后，用蘇木精和伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.3 油紅O染色 肝臟用脂肪固定液固定24 h，蔗糖梯度脫水，OCT包埋，冰凍切片。室溫晾干，飽和油紅O液染色，60%異丙醇分化；蘇木素對(duì)染細(xì)胞核，甘油明膠封片劑封片。

1.2.4 qRT-PCR Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green real-time PCR Master Mix（SYBR）（Toyobo公司）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。表達(dá)水平用GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用2-ΔΔCT方法分析基因表達(dá)。引物序列GAPDH-Forward：TTGCCATCAATGACCCCTTCA，GAPDH-Reverse：CGCCCCACTTGATTTTGGA；RGC32-Forward：AGCCTTCATTGCTGATCTTGA，RGC32-Reverse：GCAGGTCCTCGGAACTTCT。

1.2.5 免疫組化染色 5 μm厚的石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后用正常羊血清室溫下封閉1 h，加入一抗Ki67（1∶600）、PCNA（1∶2 000）、RGC32（1∶200），4 ℃濕盒內(nèi)孵育過夜；PBS漂洗后加入相應(yīng)的二抗，室溫下孵育1 h；PBS漂洗后DAB顯色，蘇木素對(duì)染細(xì)胞核，中性樹膠封片。

1.2.6 免疫熒光雙染 操作步驟與免疫組化染色步驟大致相同，將二抗更換為對(duì)應(yīng)的熒光二抗，DAPI染核，抗熒光淬滅劑封片。

1.2.7 EdU實(shí)驗(yàn) L02細(xì)胞接板，次日無血清饑餓處理24 h，換成正常培養(yǎng)基，同時(shí)加入對(duì)應(yīng)腺病毒，轉(zhuǎn)染48 h后按EdU試劑盒操作說明進(jìn)行EdU染色。

1.2.8 肝功能檢測(cè) 不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，收集血清，3 000 r/min離心5 min，用AST、ALT檢測(cè)試劑盒，按操作說明檢測(cè)血清AST、ALT水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用image J 1.53 t軟件測(cè)量圖片平均光密度并進(jìn)行量化比較；采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 9.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果

2.1 小鼠PH術(shù)后肝再生過程中肝臟大小變化 為觀察小鼠PH術(shù)后肝再生過程中肝臟大小的變化，對(duì)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟拍照、稱重，計(jì)算肝體比（肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）。如圖1a所示，PH術(shù)后，剩余肝臟逐漸增大，第0天到第6天肝臟大小變化最為明顯，第6天到第10天肝臟大小變化不明顯。PH術(shù)后肝體比明顯減小，第0天到第6天為肝體比上升的高峰期，術(shù)后第6天到第10天，肝體比無明顯變化（圖1b）。

圖1 小鼠PH術(shù)后肝再生過程中肝臟大小變化Figure 1 Changes in liver size during PH postoperative liver regeneration in mice

2.2 小鼠PH術(shù)后肝再生過程中組織結(jié)構(gòu)和功能變化 為了觀察肝再生過程中肝臟組織形態(tài)學(xué)變化，對(duì)小鼠PH術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟標(biāo)本進(jìn)行HE染色。如圖2a所示，sham組小鼠肝細(xì)胞著色均勻，排列規(guī)整；PH術(shù)后第2天肝細(xì)胞中出現(xiàn)許多小泡，胞質(zhì)著色均勻，肝細(xì)胞緊密排列，細(xì)胞間縫隙最窄；PH術(shù)后第4天肝細(xì)胞中小泡消失，肝細(xì)胞胞質(zhì)著色深，胞質(zhì)著色存在區(qū)域性差異，門靜脈（portal vein，PV）區(qū)相對(duì)中央靜脈（central vein，CV）區(qū)胞質(zhì)著色要深，肝細(xì)胞之間的縫隙變寬；PH術(shù)后第6天肝細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)域性著色差異愈加明顯，CV區(qū)附近肝細(xì)胞出現(xiàn)少量小泡，與此同時(shí)細(xì)胞間的縫隙最寬；PH術(shù)后第8、10天CV區(qū)肝細(xì)胞小泡逐漸增多，而PV區(qū)肝細(xì)胞未見小泡。

為了驗(yàn)證PH術(shù)后肝組織中出現(xiàn)的小泡是脂滴，對(duì)PH術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠肝臟標(biāo)本進(jìn)行冰凍切片油紅O染色。結(jié)果顯示，sham組小鼠PV區(qū)和CV區(qū)肝細(xì)胞中脂滴均勻分布；PH術(shù)后第2天，PV區(qū)和CV區(qū)肝細(xì)胞中脂滴變大，數(shù)量明顯增多；PH術(shù)后第4天，PV區(qū)和CV區(qū)肝細(xì)胞中脂滴明顯減少；PH術(shù)后第6、8、10天CV區(qū)肝細(xì)胞脂滴數(shù)量逐漸增多，而PV區(qū)肝細(xì)胞脂滴未見增加（圖2b～d）。由此可見，脂滴的分布與HE染色中的小泡分布相一致，表明小鼠PH術(shù)后肝臟HE染色中出現(xiàn)的小泡為脂滴。以上結(jié)果表明，PH術(shù)后脂滴增多；隨著肝再生的進(jìn)行，脂滴減少，但PV區(qū)和CV區(qū)脂滴分布產(chǎn)生差異。

為了評(píng)估PH術(shù)后肝功能的變化，收集PH術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠血清，用肝功能生化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清ALT和AST水平。結(jié)果顯示，與sham組相比，小鼠PH術(shù)后第1天血清ALT和AST水平明顯升高，但呈現(xiàn)出較大的個(gè)體差異，隨后逐漸降低，分別于術(shù)后第6天和術(shù)后第2天恢復(fù)至sham組水平（圖2e、f）。以上結(jié)果表明，PH術(shù)后肝臟功能嚴(yán)重受損，隨著肝臟再生的進(jìn)行，肝功能逐漸恢復(fù)。

2.3 小鼠PH術(shù)后肝臟再生過程中細(xì)胞增殖變化為了研究肝臟再生過程中細(xì)胞增殖情況，通過免疫組化染色檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA。結(jié)果顯示，sham組小鼠肝臟組織中僅有極少數(shù)散在分布的PCNA+肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞；PH術(shù)后第2天，PCNA+肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值（86±5），隨后逐漸減少；術(shù)后第8天時(shí)PCNA+肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)再次增多（24±3）；術(shù)后第10天PCNA+肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)趨于sham組（圖3a、b）。而小鼠PH術(shù)后PCNA+非實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢(shì)；術(shù)后第6天，PCNA+非實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值（34±5），隨后逐漸減少，最終小鼠肝臟組織中PCNA+非實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)趨于sham組（圖3a、c）。

圖3 小鼠PH術(shù)后肝再生過程中細(xì)胞增殖變化Figure 3 Cell proliferation changes during PH postoperative liver regeneration in mice

為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上結(jié)果的準(zhǔn)確性，通過免疫組化染色檢測(cè)了另一個(gè)細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67。結(jié)果顯示，sham組小鼠肝臟Ki67+細(xì)胞數(shù)極少，散在分布；PH術(shù)后第2天，Ki67+肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值（89±5），隨后逐漸減少，直至PH術(shù)后第10天，Ki67+肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)趨于sham組（圖3d、e）。而Ki67+非實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)在PH術(shù)后逐漸增多；術(shù)后第6天，Ki67+非實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值（25±3），隨后Ki67+非實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)逐漸減少，直至趨于sham組（圖3d、f）。Ki67+細(xì)胞數(shù)變化趨勢(shì)與PCNA+細(xì)胞數(shù)的變化趨勢(shì)大致相同。

2.4 小鼠PH術(shù)后肝再生過程中RGC32的表達(dá)及分布變化 為了研究小鼠PH術(shù)后肝再生過程中RGC32的表達(dá)是否發(fā)生變化，提取不同時(shí)間點(diǎn)的肝組織總RNA，進(jìn)行qRT-PCR。如圖4a所示，與sham組相比，PH術(shù)后第2天RGC32 mRNA相對(duì)表達(dá)增加，隨后逐漸恢復(fù)正常表達(dá)水平。

圖4 小鼠PH術(shù)后肝再生過程中RGC32的表達(dá)及分布變化Figure 4 The expression and distribution of RGC32 during PH postoperative liver regeneration in mice

進(jìn)一步從蛋白水平研究小鼠PH術(shù)后肝再生過程中RGC32的表達(dá)及分布變化，采用免疫組化對(duì)PH術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠肝臟標(biāo)本進(jìn)行RGC32染色。結(jié)果顯示，PH術(shù)后第2天，肝組織總的RGC32的表達(dá)量最高，隨后逐漸降低（圖4b、e），該結(jié)果與基因水平RGC32 mRNA的變化趨勢(shì)相一致。

此外，研究發(fā)現(xiàn)正常肝細(xì)胞核中RGC32高表達(dá)，PH術(shù)后第2天降到最低（圖4c、e）；而正常肝細(xì)胞質(zhì)中RGC32低表達(dá)，PH術(shù)后第2天，肝細(xì)胞質(zhì)RGC32的表達(dá)升到最高（圖4d、e）。表明PH術(shù)后第2天不僅RGC32的表達(dá)發(fā)生變化，RGC32的核質(zhì)分布也發(fā)生了改變。

2.5 RGC32表達(dá)變化與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖變化相關(guān)性分析 本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠PH術(shù)后不僅RGC32表達(dá)變化趨勢(shì)與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖變化趨勢(shì)相似，而且時(shí)間點(diǎn)也相同，都是在術(shù)后第2天變化最顯著。分析肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖變化與RGC32的表達(dá)變化之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，細(xì)胞核RGC32的表達(dá)與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖呈負(fù)相關(guān)（R2＝0.308 3，P＜0.05）（圖5a），細(xì)胞質(zhì)RGC32的表達(dá)與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖呈正相關(guān)（R2＝0.808 6，P＜0.001）（圖5b）。

圖5 RGC32的表達(dá)變化與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖變化的相關(guān)性分析Figure 5 Correlation analysis between expression of RGC32 and proliferation of hepatocellular parenchymal cells

2.6 RGC32的表達(dá)及分布對(duì)細(xì)胞增殖的影響 為進(jìn)一步研究RGC32的表達(dá)及分布對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響，首先研究小鼠肝臟中正常增殖的肝細(xì)胞RGC32的表達(dá)及分布。結(jié)果顯示，正常小鼠肝組織中Ki67+肝細(xì)胞RGC32陰性，Ki67-肝細(xì)胞RGC32陽(yáng)性，且定位于肝細(xì)胞核（圖6a），進(jìn)一步證實(shí)核RGC32的表達(dá)與細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)。

圖6 RGC32核質(zhì)分布對(duì)L02細(xì)胞增殖的影響Figure 6 Effect of RGC32 cytoplasmic distribution on proliferation of L02 cells

進(jìn)一步從體外研究RGC32對(duì)細(xì)胞增殖的影響。用RGC32過表達(dá)（Ad-RGC32）和敲低（Ad-shRGC32）的腺病毒及對(duì)照腺病毒（Ad-GFP）分別轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞系L02，轉(zhuǎn)染2天后通過EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析RGC32對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響。EdU陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)分析顯示，RGC32過表達(dá)后EdU陽(yáng)性率為20.1%，與對(duì)照組EdU陽(yáng)性率35.7%相比，陽(yáng)性率減少15.6%；而RGC32敲低后EdU陽(yáng)性率為54.9%，與對(duì)照組相比EdU陽(yáng)性率增加了19.2%（圖6b、c）。

3 討論

正常肝臟具備一定的代償能力，少量肝切除，肝臟能夠維持正常生理需求，不會(huì)引起肝臟再生。70%肝切除模型，能最大程度誘發(fā)肝再生潛能，受病理因素影響小，是研究肝再生常用的動(dòng)物模型［5-6］。本研究顯示，小鼠PH術(shù)后肝臟迅速啟動(dòng)再生，肝臟大小和功能逐漸恢復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，PH術(shù)后肝臟脂肪在第2天升到最高，術(shù)后第4天又降到最低，隨后逐漸恢復(fù)，但CV區(qū)和PV區(qū)脂肪堆積產(chǎn)生差異化。這可能是肝切除早期，由于肝臟大部分丟失，肝功能嚴(yán)重受損，遠(yuǎn)超代償范圍，嚴(yán)重威脅生命安全，在這種情況下肝臟首選執(zhí)行再生功能，其他功能如代謝功能受損，從而導(dǎo)致脂質(zhì)在剩余肝臟中大量積累。隨著肝再生的進(jìn)行，肝功能得到部分恢復(fù)，肝臟再生的同時(shí)也開始執(zhí)行代謝功能，將前期積累的脂質(zhì)代謝，脂質(zhì)堆積減少。

肝臟的基本結(jié)構(gòu)和功能單位是肝小葉，肝再生不會(huì)改變剩余肝臟中肝小葉的數(shù)量，也不會(huì)改變PV、CV的數(shù)量，而是肝小葉的結(jié)構(gòu)變大［1］，因此肝再生完成后PV與CV之間的距離變長(zhǎng)。筆者認(rèn)為，再生后的肝臟中PV區(qū)和CV區(qū)脂肪分布產(chǎn)生差異，可能是由于PV與CV之間的距離變長(zhǎng)，血液從PV流向CV，血液中的營(yíng)養(yǎng)成分逐漸減少，流經(jīng)CV區(qū)時(shí)血液中的營(yíng)養(yǎng)成分缺乏，為了適應(yīng)這種環(huán)境變化，不同區(qū)域的肝細(xì)胞功能發(fā)生了改變，還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

肝再生是通過多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的復(fù)雜的細(xì)胞增殖過程，與一般組織由原始細(xì)胞或干細(xì)胞分化完成的再生過程不同，肝再生主要依賴于剩余肝組織分化成熟的肝細(xì)胞重新活化，獲得增殖活性，啟動(dòng)后續(xù)的DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂和細(xì)胞增殖［7-9］。本研究發(fā)現(xiàn)，在PH術(shù)后第2天肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖最活躍，隨后肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖活性逐漸降低；而非實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖活性在PH術(shù)后開始逐漸增強(qiáng)，在PH術(shù)后第6天才達(dá)到最高，隨后逐漸恢復(fù)正常。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖存在先后關(guān)系，表明不同時(shí)間點(diǎn)不同的細(xì)胞發(fā)揮不同的作用［10-11］。

RGC32是由補(bǔ)體激活、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的基因，在多種正常組織及腫瘤中廣泛表達(dá)，具有調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)功能［4，12-13］。例如RGC32的表達(dá)水平隨著動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展而增加，沉默RGC32表達(dá)可抑制C5b-9誘導(dǎo)的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖［14］。妊娠期胎盤中RGC32的表達(dá)降低，可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管形成，阻斷胎盤血管生成而導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限［15］。大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷誘導(dǎo)內(nèi)膜新生的研究中，RGC32可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，從而促進(jìn)血管病變的形成［16］。這些研究提示RGC32對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，但是這些研究?jī)H聚焦于總的RGC32對(duì)細(xì)胞增殖的影響，并未對(duì)RGC32的分布進(jìn)行研究。本研究顯示，PH術(shù)后第2天，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞大量增殖，總的RGC32的表達(dá)最高，這與其他學(xué)者［14-16］的研究結(jié)果相符，然而筆者發(fā)現(xiàn)此時(shí)細(xì)胞核RGC32的表達(dá)反而降到最低。由此可見，RGC32核質(zhì)分布差異，可能發(fā)揮不同的作用，不能只從表達(dá)量研究其對(duì)細(xì)胞的影響。

由于PH術(shù)是人為損傷肝臟誘發(fā)肝細(xì)胞增殖，不可避免地會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，這可能與正常小鼠肝臟中肝細(xì)胞增殖的情況不同［17-18］。本研究顯示，正常小鼠處于靜息態(tài)的肝細(xì)胞核表達(dá)RGC32，而增殖的肝細(xì)胞不表達(dá)RGC32；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究顯示，RGC32過表達(dá)抑制L02細(xì)胞增殖，敲低RGC32表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。以上結(jié)果與Saigusa等［19］的研究相一致，過表達(dá)RGC32可能是由于誘導(dǎo)了G2/M停滯，抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。而與本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)PH術(shù)后第2天，細(xì)胞增殖最活躍，總RGC32表達(dá)升高的結(jié)果相矛盾。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，升高的是細(xì)胞質(zhì)RGC32的表達(dá)，而細(xì)胞核RGC32的表達(dá)顯著降低；結(jié)合細(xì)胞研究結(jié)果，筆者認(rèn)為主要是細(xì)胞核RGC32調(diào)控細(xì)胞增殖。RGC32作為一種重要的補(bǔ)體應(yīng)答基因，補(bǔ)體激活后能夠促進(jìn)其表達(dá)。因此筆者猜測(cè)，細(xì)胞核RGC32表達(dá)的升高是由于補(bǔ)體系統(tǒng)激活所導(dǎo)致，起到調(diào)節(jié)免疫作用，但需要后續(xù)進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究證實(shí)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖不同步，共同參與了肝臟再生。肝切除再生過程中，RGC32表達(dá)存在核質(zhì)分布差異，細(xì)胞核RGC32對(duì)肝細(xì)胞增殖具有抑制作用。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年12月5日經(jīng)由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2021-實(shí)071號(hào)，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：孔德營(yíng)、唐俊明負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)；李興元、楊艷芳、陳琰、胡文慧參與動(dòng)物模型的構(gòu)建；李興元、楊艷芳負(fù)責(zé)做實(shí)驗(yàn)、整理數(shù)據(jù)及撰寫論文；趙小英負(fù)責(zé)對(duì)論文進(jìn)行修改；李興元和楊艷芳對(duì)本文貢獻(xiàn)等同，同為第一作者。