李興元， 楊艷芳， 陳琰， 胡文慧， 趙小英， 唐俊明， 孔德營

1 遵義醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室， 貴州 遵義 563000； 2 貴州省人民醫(yī)院中心實驗室， 貴陽 550002； 3 湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院生理學教研室， 湖北 十堰 442000

部分肝切除（partial hepatectomy，PH）術是治療肝腫瘤、肝內膽管結石等疾病的重要手段，但術后肝衰竭的發(fā)生嚴重影響患者預后，甚至導致患者短期內死亡，無法達到治療疾病的目的［1］。PH術后的順利恢復主要取決于剩余肝臟的迅速再生以及肝功能的迅速恢復［2］，因此研究肝臟再生的過程及其調控機制十分重要。有研究［3］表明補體系統(tǒng)在調控兩棲類動物肢體再生過程中發(fā)揮了重要作用，在一些有尾動物中，其肢體胚芽細胞的再生起始于C3組分的表達。補體應答基因32（response gene to complement 32，RGC32）是一種重要的補體激活基因，補體系統(tǒng)被激活后會促進其表達［4］。RGC32在肝臟再生過程中是否也發(fā)揮重要作用，目前尚不清楚。本研究旨在觀察小鼠PH術后肝再生過程中肝臟的結構和功能變化，不同時期細胞增殖情況，以及不同時期RGC32的表達變化，分析PH術后肝再生過程中RGC32對細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 10周齡雄性C57BL/6小鼠42只，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2019-0008，實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2019-0031。L02細胞來自于湖北省胚胎干細胞重點實驗室。增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（ab29）購自Abcam公司。RGC32（bs-9079R）購自北京博奧森生物技術有限公司。ALT、AST檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑購自Toyobo公司。油紅O染色液（GP1067）、Ki67（GB121141）、脂肪固定液（G1119）、抗熒光淬滅封片劑（G1401）、檸檬酸修復緩沖液（G1201）、PBS緩沖液（G0002）購自武漢塞維爾生物有限公司。DAB免疫染色試劑（ZLI-9018）、蘇木素染色液（ZLI-9610）購自北京中杉金橋。EdU（Cy3）染色試劑盒（K1075）購自Apexbio。

1.2 方法

1.2.1 小鼠PH模型的制備 42只10周齡雄性C57BL/6小鼠，隨機分為對照組［切除小鼠完整的肝臟稱重、拍照作為正常對照（sham組），進一步切除肝左葉和肝中葉后稱重、拍照作為手術對照（0 d組），sham組和0 d組共用一組小鼠］、術后1天組（1 d）、術后2天組（2 d）、術后4天組（4 d）、術后6天組（6 d）、術后8天組（8 d）和術后10天組（10 d），每組6只。手術操作均在SPF級環(huán)境中完成。小鼠提前一天用脫毛膏脫去胸腹部的毛。實驗當天稱量小鼠體質量并記錄。異氟烷吸入式氣體麻醉，麻醉后仰臥于鋪有37 ℃加熱墊的操作案板上，用手術膠帶固定其四肢。碘伏消毒，于上腹劍突處水平切開，打開腹腔，暴露小鼠肝臟，用6-0絲線結扎肝左葉并切除，再用6-0絲線結扎肝中葉并切除，用4-0外科縫線縫合關腹，碘伏消毒。分別于術后1、2、4、6、8、10天處死小鼠，收集血清和肝臟組織。

1.2.2 HE染色 5 μm厚的石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后，用蘇木精和伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.3 油紅O染色 肝臟用脂肪固定液固定24 h，蔗糖梯度脫水，OCT包埋，冰凍切片。室溫晾干，飽和油紅O液染色，60%異丙醇分化；蘇木素對染細胞核，甘油明膠封片劑封片。

1.2.4 qRT-PCR Trizol法提取總RNA，反轉錄為cDNA，使用SYBR Green real-time PCR Master Mix（SYBR）（Toyobo公司）進行qRT-PCR反應。表達水平用GAPDH進行標準化，使用2-ΔΔCT方法分析基因表達。引物序列GAPDH-Forward：TTGCCATCAATGACCCCTTCA，GAPDH-Reverse：CGCCCCACTTGATTTTGGA；RGC32-Forward：AGCCTTCATTGCTGATCTTGA，RGC32-Reverse：GCAGGTCCTCGGAACTTCT。

1.2.5 免疫組化染色 5 μm厚的石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精復水、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶后用正常羊血清室溫下封閉1 h，加入一抗Ki67（1∶600）、PCNA（1∶2 000）、RGC32（1∶200），4 ℃濕盒內孵育過夜；PBS漂洗后加入相應的二抗，室溫下孵育1 h；PBS漂洗后DAB顯色，蘇木素對染細胞核，中性樹膠封片。

1.2.6 免疫熒光雙染 操作步驟與免疫組化染色步驟大致相同，將二抗更換為對應的熒光二抗，DAPI染核，抗熒光淬滅劑封片。

1.2.7 EdU實驗 L02細胞接板，次日無血清饑餓處理24 h，換成正常培養(yǎng)基，同時加入對應腺病毒，轉染48 h后按EdU試劑盒操作說明進行EdU染色。

1.2.8 肝功能檢測 不同時間點處死小鼠，收集血清，3 000 r/min離心5 min，用AST、ALT檢測試劑盒，按操作說明檢測血清AST、ALT水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用image J 1.53 t軟件測量圖片平均光密度并進行量化比較；采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用成組t檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad Prism 9.0軟件繪制統(tǒng)計圖。

2 結果

2.1 小鼠PH術后肝再生過程中肝臟大小變化 為觀察小鼠PH術后肝再生過程中肝臟大小的變化，對術后不同時間點的肝臟拍照、稱重，計算肝體比（肝臟質量/體質量）。如圖1a所示，PH術后，剩余肝臟逐漸增大，第0天到第6天肝臟大小變化最為明顯，第6天到第10天肝臟大小變化不明顯。PH術后肝體比明顯減小，第0天到第6天為肝體比上升的高峰期，術后第6天到第10天，肝體比無明顯變化（圖1b）。

圖1 小鼠PH術后肝再生過程中肝臟大小變化Figure 1 Changes in liver size during PH postoperative liver regeneration in mice

2.2 小鼠PH術后肝再生過程中組織結構和功能變化 為了觀察肝再生過程中肝臟組織形態(tài)學變化，對小鼠PH術后不同時間點的肝臟標本進行HE染色。如圖2a所示，sham組小鼠肝細胞著色均勻，排列規(guī)整；PH術后第2天肝細胞中出現(xiàn)許多小泡，胞質著色均勻，肝細胞緊密排列，細胞間縫隙最窄；PH術后第4天肝細胞中小泡消失，肝細胞胞質著色深，胞質著色存在區(qū)域性差異，門靜脈（portal vein，PV）區(qū)相對中央靜脈（central vein，CV）區(qū)胞質著色要深，肝細胞之間的縫隙變寬；PH術后第6天肝細胞胞質區(qū)域性著色差異愈加明顯，CV區(qū)附近肝細胞出現(xiàn)少量小泡，與此同時細胞間的縫隙最寬；PH術后第8、10天CV區(qū)肝細胞小泡逐漸增多，而PV區(qū)肝細胞未見小泡。

為了驗證PH術后肝組織中出現(xiàn)的小泡是脂滴，對PH術后不同時間點的小鼠肝臟標本進行冰凍切片油紅O染色。結果顯示，sham組小鼠PV區(qū)和CV區(qū)肝細胞中脂滴均勻分布；PH術后第2天，PV區(qū)和CV區(qū)肝細胞中脂滴變大，數(shù)量明顯增多；PH術后第4天，PV區(qū)和CV區(qū)肝細胞中脂滴明顯減少；PH術后第6、8、10天CV區(qū)肝細胞脂滴數(shù)量逐漸增多，而PV區(qū)肝細胞脂滴未見增加（圖2b～d）。由此可見，脂滴的分布與HE染色中的小泡分布相一致，表明小鼠PH術后肝臟HE染色中出現(xiàn)的小泡為脂滴。以上結果表明，PH術后脂滴增多；隨著肝再生的進行，脂滴減少，但PV區(qū)和CV區(qū)脂滴分布產(chǎn)生差異。

為了評估PH術后肝功能的變化，收集PH術后不同時間點的小鼠血清，用肝功能生化檢測試劑盒檢測血清ALT和AST水平。結果顯示，與sham組相比，小鼠PH術后第1天血清ALT和AST水平明顯升高，但呈現(xiàn)出較大的個體差異，隨后逐漸降低，分別于術后第6天和術后第2天恢復至sham組水平（圖2e、f）。以上結果表明，PH術后肝臟功能嚴重受損，隨著肝臟再生的進行，肝功能逐漸恢復。

2.3 小鼠PH術后肝臟再生過程中細胞增殖變化為了研究肝臟再生過程中細胞增殖情況，通過免疫組化染色檢測細胞增殖標志物PCNA。結果顯示，sham組小鼠肝臟組織中僅有極少數(shù)散在分布的PCNA+肝實質細胞；PH術后第2天，PCNA+肝實質細胞數(shù)達到最大值（86±5），隨后逐漸減少；術后第8天時PCNA+肝實質細胞數(shù)再次增多（24±3）；術后第10天PCNA+肝實質細胞數(shù)趨于sham組（圖3a、b）。而小鼠PH術后PCNA+非實質細胞數(shù)呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢；術后第6天，PCNA+非實質細胞數(shù)達到最大值（34±5），隨后逐漸減少，最終小鼠肝臟組織中PCNA+非實質細胞數(shù)趨于sham組（圖3a、c）。

圖3 小鼠PH術后肝再生過程中細胞增殖變化Figure 3 Cell proliferation changes during PH postoperative liver regeneration in mice

為了進一步驗證以上結果的準確性，通過免疫組化染色檢測了另一個細胞增殖標志物Ki67。結果顯示，sham組小鼠肝臟Ki67+細胞數(shù)極少，散在分布；PH術后第2天，Ki67+肝實質細胞數(shù)達到最大值（89±5），隨后逐漸減少，直至PH術后第10天，Ki67+肝實質細胞數(shù)趨于sham組（圖3d、e）。而Ki67+非實質細胞數(shù)在PH術后逐漸增多；術后第6天，Ki67+非實質細胞數(shù)達到最大值（25±3），隨后Ki67+非實質細胞數(shù)逐漸減少，直至趨于sham組（圖3d、f）。Ki67+細胞數(shù)變化趨勢與PCNA+細胞數(shù)的變化趨勢大致相同。

2.4 小鼠PH術后肝再生過程中RGC32的表達及分布變化 為了研究小鼠PH術后肝再生過程中RGC32的表達是否發(fā)生變化，提取不同時間點的肝組織總RNA，進行qRT-PCR。如圖4a所示，與sham組相比，PH術后第2天RGC32 mRNA相對表達增加，隨后逐漸恢復正常表達水平。

圖4 小鼠PH術后肝再生過程中RGC32的表達及分布變化Figure 4 The expression and distribution of RGC32 during PH postoperative liver regeneration in mice

進一步從蛋白水平研究小鼠PH術后肝再生過程中RGC32的表達及分布變化，采用免疫組化對PH術后不同時間點的小鼠肝臟標本進行RGC32染色。結果顯示，PH術后第2天，肝組織總的RGC32的表達量最高，隨后逐漸降低（圖4b、e），該結果與基因水平RGC32 mRNA的變化趨勢相一致。

此外，研究發(fā)現(xiàn)正常肝細胞核中RGC32高表達，PH術后第2天降到最低（圖4c、e）；而正常肝細胞質中RGC32低表達，PH術后第2天，肝細胞質RGC32的表達升到最高（圖4d、e）。表明PH術后第2天不僅RGC32的表達發(fā)生變化，RGC32的核質分布也發(fā)生了改變。

2.5 RGC32表達變化與肝實質細胞增殖變化相關性分析 本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠PH術后不僅RGC32表達變化趨勢與肝實質細胞增殖變化趨勢相似，而且時間點也相同，都是在術后第2天變化最顯著。分析肝實質細胞的增殖變化與RGC32的表達變化之間的相關性，結果顯示，細胞核RGC32的表達與肝實質細胞的增殖呈負相關（R2＝0.308 3，P＜0.05）（圖5a），細胞質RGC32的表達與肝實質細胞的增殖呈正相關（R2＝0.808 6，P＜0.001）（圖5b）。

圖5 RGC32的表達變化與肝實質細胞增殖變化的相關性分析Figure 5 Correlation analysis between expression of RGC32 and proliferation of hepatocellular parenchymal cells

2.6 RGC32的表達及分布對細胞增殖的影響 為進一步研究RGC32的表達及分布對肝細胞增殖的影響，首先研究小鼠肝臟中正常增殖的肝細胞RGC32的表達及分布。結果顯示，正常小鼠肝組織中Ki67+肝細胞RGC32陰性，Ki67-肝細胞RGC32陽性，且定位于肝細胞核（圖6a），進一步證實核RGC32的表達與細胞增殖呈負相關。

圖6 RGC32核質分布對L02細胞增殖的影響Figure 6 Effect of RGC32 cytoplasmic distribution on proliferation of L02 cells

進一步從體外研究RGC32對細胞增殖的影響。用RGC32過表達（Ad-RGC32）和敲低（Ad-shRGC32）的腺病毒及對照腺病毒（Ad-GFP）分別轉染肝細胞系L02，轉染2天后通過EdU細胞增殖實驗分析RGC32對肝細胞增殖的影響。EdU陽性率統(tǒng)計分析顯示，RGC32過表達后EdU陽性率為20.1%，與對照組EdU陽性率35.7%相比，陽性率減少15.6%；而RGC32敲低后EdU陽性率為54.9%，與對照組相比EdU陽性率增加了19.2%（圖6b、c）。

3 討論

正常肝臟具備一定的代償能力，少量肝切除，肝臟能夠維持正常生理需求，不會引起肝臟再生。70%肝切除模型，能最大程度誘發(fā)肝再生潛能，受病理因素影響小，是研究肝再生常用的動物模型［5-6］。本研究顯示，小鼠PH術后肝臟迅速啟動再生，肝臟大小和功能逐漸恢復。研究發(fā)現(xiàn)，PH術后肝臟脂肪在第2天升到最高，術后第4天又降到最低，隨后逐漸恢復，但CV區(qū)和PV區(qū)脂肪堆積產(chǎn)生差異化。這可能是肝切除早期，由于肝臟大部分丟失，肝功能嚴重受損，遠超代償范圍，嚴重威脅生命安全，在這種情況下肝臟首選執(zhí)行再生功能，其他功能如代謝功能受損，從而導致脂質在剩余肝臟中大量積累。隨著肝再生的進行，肝功能得到部分恢復，肝臟再生的同時也開始執(zhí)行代謝功能，將前期積累的脂質代謝，脂質堆積減少。

肝臟的基本結構和功能單位是肝小葉，肝再生不會改變剩余肝臟中肝小葉的數(shù)量，也不會改變PV、CV的數(shù)量，而是肝小葉的結構變大［1］，因此肝再生完成后PV與CV之間的距離變長。筆者認為，再生后的肝臟中PV區(qū)和CV區(qū)脂肪分布產(chǎn)生差異，可能是由于PV與CV之間的距離變長，血液從PV流向CV，血液中的營養(yǎng)成分逐漸減少，流經(jīng)CV區(qū)時血液中的營養(yǎng)成分缺乏，為了適應這種環(huán)境變化，不同區(qū)域的肝細胞功能發(fā)生了改變，還有待后續(xù)進一步研究。

肝再生是通過多種細胞因子和生長因子調節(jié)的復雜的細胞增殖過程，與一般組織由原始細胞或干細胞分化完成的再生過程不同，肝再生主要依賴于剩余肝組織分化成熟的肝細胞重新活化，獲得增殖活性，啟動后續(xù)的DNA復制、細胞分裂和細胞增殖［7-9］。本研究發(fā)現(xiàn)，在PH術后第2天肝實質細胞增殖最活躍，隨后肝實質細胞增殖活性逐漸降低；而非實質細胞增殖活性在PH術后開始逐漸增強，在PH術后第6天才達到最高，隨后逐漸恢復正常。肝實質細胞與非實質細胞的增殖存在先后關系，表明不同時間點不同的細胞發(fā)揮不同的作用［10-11］。

RGC32是由補體激活、生長因子和細胞因子誘導的基因，在多種正常組織及腫瘤中廣泛表達，具有調控細胞周期、促進細胞分化、調節(jié)免疫等多種生物學功能［4，12-13］。例如RGC32的表達水平隨著動脈粥樣硬化的進展而增加，沉默RGC32表達可抑制C5b-9誘導的動脈內皮細胞增殖［14］。妊娠期胎盤中RGC32的表達降低，可抑制血管內皮生長因子誘導的內皮細胞增殖、遷移和血管形成，阻斷胎盤血管生成而導致胎兒生長受限［15］。大鼠頸動脈球囊損傷誘導內膜新生的研究中，RGC32可促進平滑肌細胞的增殖和遷移，從而促進血管病變的形成［16］。這些研究提示RGC32對細胞增殖具有促進作用，但是這些研究僅聚焦于總的RGC32對細胞增殖的影響，并未對RGC32的分布進行研究。本研究顯示，PH術后第2天，肝實質細胞大量增殖，總的RGC32的表達最高，這與其他學者［14-16］的研究結果相符，然而筆者發(fā)現(xiàn)此時細胞核RGC32的表達反而降到最低。由此可見，RGC32核質分布差異，可能發(fā)揮不同的作用，不能只從表達量研究其對細胞的影響。

由于PH術是人為損傷肝臟誘發(fā)肝細胞增殖，不可避免地會引起機體的免疫反應，這可能與正常小鼠肝臟中肝細胞增殖的情況不同［17-18］。本研究顯示，正常小鼠處于靜息態(tài)的肝細胞核表達RGC32，而增殖的肝細胞不表達RGC32；細胞實驗研究顯示，RGC32過表達抑制L02細胞增殖，敲低RGC32表達促進細胞增殖，兩種實驗結果相吻合。以上結果與Saigusa等［19］的研究相一致，過表達RGC32可能是由于誘導了G2/M停滯，抑制了膠質瘤細胞的生長。而與本研究動物實驗PH術后第2天，細胞增殖最活躍，總RGC32表達升高的結果相矛盾。進一步分析發(fā)現(xiàn)，升高的是細胞質RGC32的表達，而細胞核RGC32的表達顯著降低；結合細胞研究結果，筆者認為主要是細胞核RGC32調控細胞增殖。RGC32作為一種重要的補體應答基因，補體激活后能夠促進其表達。因此筆者猜測，細胞核RGC32表達的升高是由于補體系統(tǒng)激活所導致，起到調節(jié)免疫作用，但需要后續(xù)進一步研究證實。

綜上所述，本研究證實肝實質細胞和非實質細胞增殖不同步，共同參與了肝臟再生。肝切除再生過程中，RGC32表達存在核質分布差異，細胞核RGC32對肝細胞增殖具有抑制作用。

倫理學聲明：本研究方案于2021年12月5日經(jīng)由湖北醫(yī)藥學院實驗動物倫理委員會審批，批號：2021-實071號，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：孔德營、唐俊明負責課題設計；李興元、楊艷芳、陳琰、胡文慧參與動物模型的構建；李興元、楊艷芳負責做實驗、整理數(shù)據(jù)及撰寫論文；趙小英負責對論文進行修改；李興元和楊艷芳對本文貢獻等同，同為第一作者。