辛華， 單洪超， 欒海艷， 阮洋， 楊鑫妍

1 佳木斯大學附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154007； 2 佳木斯大學基礎醫(yī)學院， 黑龍江 佳木斯 154007； 3 佳木斯中心醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154002

肝癌是全球第六大最常見的惡性腫瘤，每年新發(fā)病人數超過85萬，其發(fā)生率逐年升高，呈增長態(tài)勢，且在癌癥相關死因中排名第二位［1-3］。肝癌的發(fā)病是一個多因素多階段的過程，雖然目前關于肝癌發(fā)生發(fā)展的研究較多，但對于理解其機制仍是冰山一角。炎癥是癌癥的危險因素之一。越來越多的流行病學和實驗證據表明，炎癥在促進肝癌惡性進展和轉移方面起著重要作用［4］。腫瘤微環(huán)境中產生的促炎細胞因子在癌癥相關炎癥中也起著關鍵作用，并促進癌癥的侵襲和遷移［5］。

cSN50.1是一種人工合成的多肽，能夠通過抑制核轉錄因子的入核轉運來調節(jié)下游靶基因的表達，與癌癥、病毒性疾病和神經退行性疾病的發(fā)病機制有關［6-7］。研究發(fā)現，cSN50.1能夠減少肝臟中應激反應轉錄因子（SRTF）、激活蛋白-1（AP-1）、核轉錄因子-κB（NF-κB）和轉錄激活因子-1（STAT-1）的入核轉運，抑制敗血癥相關代謝對肝臟的損傷，cSN50.1還能改善血液、脾臟和肺的細菌清除率，抑制血漿中促炎細胞因子和趨化因子的產生［8］。本文旨在研究cSN50.1通過AP-1和NF-κB信號通路來影響趨化因子5（CXCL5）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達，進而影響肝癌細胞HepG2的惡性行為。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料 肝癌細胞HepG2來源于中國啟達生物有限公司；細胞培養(yǎng)所用相關試劑均來源于美國HyClone有限公司、大連美侖生物技術有限公司和中國碧云天生物技術有限公司；電化學發(fā)光顯影液、兔抗人β-actin多克隆抗體、兔抗人Histone3多克隆抗體、兔抗人CXCL5多克隆抗體、兔抗人c-Jun多克隆抗體和兔抗人NF-κB多克隆抗體均來源于美國Affinity Biosciences有限公司；鼠抗人TNF-α單克隆抗體來源于美國Proteintech Group，Inc有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔二抗和HRP標記山羊抗鼠二抗均來源于中國博士德生物工程有限公司；蛋白免疫印跡及蛋白提取所用相關試劑均來源于中國碧云天生物技術有限公司和中國博士德生物工程有限公司；反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）所用相關試劑以及CXCL5和TNF-α引物均來源于中國生工生物工程有限公司；SP600125（AP-1信號通路抑制劑）來源于大連美侖生物技術有限公司；PDTC（NF-κB信號通路抑制劑）來源于中國碧云天生物技術有限公司；cSN50.1多肽由中國吉爾生化有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 肝癌細胞HepG2采用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗（100×）的RPMI1640培養(yǎng)液并置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，當細胞生長至密度70%～80%時，用胰蛋白酶消化，按1∶3進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8實驗 將處于對數生長期的肝癌細胞HepG2用胰蛋白酶消化，培養(yǎng)液重懸，按照每孔100 μL接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，細胞數控制在104個/孔。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，使細胞完全貼壁，將細胞隨機分為6組，分別為0、10、30、50、70、90 μmol/L cSN50.1組，每組各6個復孔。丟棄舊液，在每個孔內加入不同濃度cSN50.1的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至24 h后。在每個孔中加入10 μL CCK-8溶液，輕輕混勻，然后將孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用全自動酶標儀測定每個孔在450 nm波長處的光密度值（OD值）。根據OD值計算各組細胞存活率和抑制率。增殖抑制率達50%的濃度為IC50濃度，并選取低于IC50的濃度為工作濃度。計算公式：細胞存活率=［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%，抑制率=［（Ac-As）/（Ac-Ab）］×100%。As：實驗孔吸光度（含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和藥物溶液），Ab：空白孔吸光度（含細胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含藥物），Ac：對照孔吸光度（含培養(yǎng)基、CCK-8溶液，不含細胞、藥物）。

1.2.3 劃痕實驗 將對數生長期肝癌細胞HepG2接種在6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞數控制在5×105個/孔。培養(yǎng)至細胞緊密貼壁，將細胞隨機分為4組：0、10、30、50 μmol/L組，每組各3個復孔。10 μL液移槍頭經高壓滅菌處理后，在6孔細胞培養(yǎng)板內制作劃痕，PBS將脫落細胞沖洗干凈，在倒置顯微鏡下拍照記錄。細胞劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/24 h劃痕寬度×100%。

1.2.4 Transwell實驗 將Matrigel按1∶8的比例用不含FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋，取50 μL鋪滿Transwell小室上室的底部膜，并在培養(yǎng)箱中孵育5 h，形成基質屏障膜。選取生長狀態(tài)良好的HepG2細胞，經消化離心后，接種于Transwell小室上室，上室為200 μL含不同濃度cSN50.1（0、10、30、50 μmol/L）無FBS的培養(yǎng)液，細胞數控制在2×104個/孔，每組3個復孔，下室為600 μL含20% FBS的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛固定30 min，再用1%結晶紫染色20 min，用棉簽仔細擦除上室未過膜的細胞，在倒置顯微鏡下拍照，計數過膜細胞的數量。

1.2.5 細胞克隆實驗 選取生長狀態(tài)良好的HepG2細胞，消化離心后，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞數控制在800個/孔，分別采用含0、10、30、50 μmol/L cSN50.1的完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，在含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，定期觀察細胞狀態(tài)，及時更換新鮮培養(yǎng)液保證細胞營養(yǎng)。觀察到細胞成團后，PBS清洗兩次，每次于搖床勻速清洗5 min，然后用4%多聚甲醛固定30 min后，再用1%的結晶紫染色20 min，清洗后扣干，取圖計數。

1.2.6 RT-PCR實驗 （1）AP-1信號通路在cSN50.1對肝癌細胞HepG2作用中的影響：將肝癌細胞HepG2分為Control組、SP600125組和cSN50.1組。Control組采用正常的完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，SP600125組采用含20 μmol/L的SP600125的完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，cSN50.1組采用含50 μmol/L的cSN50.1的完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)（劑量由前述實驗結果確定），培養(yǎng)24 h后，采用RTPCR實驗檢測各組HepG2細胞中CXCL5和TNF-α mRNA的表達情況。（2）NF-κB信號通路在cSN50.1對肝癌細胞HepG2作用中的影響：將肝癌細胞HepG2分為Control組、PDTC組和cSN50.1組。Control組和cSN50.1組培養(yǎng)條件同上，PDTC組采用含100 μmol/L的PDTC的完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，采用RTPCR實驗檢測各組HepG2細胞中CXCL5和TNF-α mRNA的表達情況。用Trizol試劑提取各組細胞中總RNA。將細胞中RNA均逆轉錄為cDNA，進行擴增。引物序列：CXCL5上游5'-TCCTTCGAGCTCCTTGTGCG-3'，下游5'-TCCTTGTTTCCACCGTCCAAAATTT-3'；TNF上游5'-TGCTCCTCACCCACACCATCAG-3'，下游5'-TCCCAAAGTAGACCTGCCCAGAC-3'；βactin上游5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'，下游5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'。取5 μL PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳；電泳結束后將凝膠置于0.5 μg/mL溴化乙錠水溶液中，室溫環(huán)境下染色20 min；用自來水沖洗后，于凝膠成像分析系統下拍攝并分析，采用image J軟件進行灰度值分析。結果以目的基因與β-actin灰度值的比值來表示其相對含量。

1.2.7 Western Blot實驗 （1）AP-1信號通路在cSN50.1對肝癌細胞HepG2作用中的影響：分組以及培養(yǎng)條件同RT-PCR，采用Western Blot實驗檢測各組HepG2細胞中CXCL5和TNF-α蛋白表達情況以及細胞質和細胞核中c-Jun蛋白的表達情況。（2）NF-κB信號通路在cSN50.1對肝癌細胞HepG2作用中的影響：分組以及培養(yǎng)條件同RT-PCR，采用Western Blot印跡實驗檢測各組HepG2細胞中CXCL5和TNF-α蛋白表達情況以及細胞質和細胞核中NF-κB蛋白的表達情況。采用含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液分別提取各組HepG2細胞總蛋白后用于檢測CXCL5和TNF-α蛋白表達情況；采用亞細胞結構細胞核與細胞質蛋白抽提試劑盒，分別提取各組HepG2細胞的細胞質和細胞核蛋白用于檢測c-Jun和NF-κB蛋白的表達情況。用BCA法測定提取的蛋白質濃度，95 ℃加熱5 min使蛋白質變性。采用12%分離膠進行十二烷基硫酸鈉和聚丙烯酰胺凝膠電泳，按照每孔蛋白質20 μg上樣，200 mA恒流濕旋轉，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗液洗膜3次，用相應的二抗在室溫下孵育1 h，然后再用TBST洗膜3次，電化學發(fā)光顯影，采用凝膠成像分析系統曝光、拍攝和分析，采用Tanon Gel Image System軟件進行灰度值分析。細胞中CXCL5、TNF-α蛋白和細胞質c-Jun、NF-κB蛋白的表達結果以目的蛋白與β-actin灰度值的比值來表示其相對含量，細胞核c-Jun、NF-κB蛋白的表達結果以目的蛋白與Histone灰度值比值來表示其相對含量。

1.2.8 統計學方法 采用 Graphpad Prism 8.0對所有數據進行整理和繪制分析，采用統計軟件SPSS 26.0進行數據分析，計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 cSN50.1對肝癌細胞HepG2增殖的影響 與0 μmol/L組相比，10和30 μmol/L組對HepG2細胞無明顯抑制作用（P＞0.05），50、70和90 μmol/L組對HepG2細胞有顯著的抑制作用（P＜0.01），但70和90 μmol/L組的細胞存活率低于50%（圖1）。

圖1 cSN50.1對肝癌細胞HepG2增殖的影響Figure 1 Effect of cSN50.1 on hepatoma cell HepG2 proliferation

2.2 cSN50.1對肝癌細胞HepG2遷移能力的影響與0 μmol/L組相比，10 μmol/L組的劃痕愈合率無明顯變化（P＞0.05），30、50 μmol/L組的劃痕愈合率明顯降低（P值均＜0.05）（圖2）。

圖2 cSN50.1對肝癌細胞HepG2遷移能力的影響Figure 2 Effects of cSN50.1 on the migration ability of hepatocellular carcinoma cells HepG2

2.3 cSN50.1對肝癌細胞HepG2侵襲能力的影響與0 μmol/L組相比，10 μmol/L組的下室侵襲細胞數量無明顯變化（P＞0.05），而30、50 μmol/L組的下室侵襲細胞數量均顯著減少（P值均＜0.01）（圖3）。

圖3 cSN50.1對肝癌細胞HepG2侵襲能力的影響Figure 3 Effect of cSN50.1 on invasion ability of hepatoma cells HepG2

2.4 cSN50.1對肝癌細胞HepG2集落形成能力的影響 與0 μmol/L組相比，10 μmol/L組的細胞集落形成能力無明顯變化（P＞0.05），而30、50 μmol/L組的細胞集落形成能力均顯著減弱（P值均＜0.01）（圖4）。

圖4 cSN50.1對肝癌細胞HepG2集落形成能力的影響Figure 4 Effect of cSN50.1 on colony formation ability of hepatocellular carcinoma cells HepG2

2.5 AP-1信號通路在cSN50.1對肝癌細胞HepG2作用中的影響

2.5.1 cSN50.1對肝癌細胞HepG2中炎癥因子CXCL5和TNF-α表達的影響 與Control組相比，SP600125組和cSN50.1組中CXCL5和TNF-α mRNA的表達均明顯降低（P值均＜0.05）（圖5a、b）。與Control組相比，SP600125組和cSN50.1組中CXCL5和TNF-α蛋白的表達均明顯降低（P值均＜0.05）（圖5c、d）。

圖5 cSN50.1對各組細胞中CXCL5和TNF-α表達的影響Figure 5 Effects of cSN50.1 on the expression of CXCL5 and TNF-α in each group

2.5.2 cSN50.1對肝癌細胞HepG2中通路蛋白c-Jun表達的影響 與Control組相比，SP600125組細胞質中c-Jun蛋白的表達明顯降低（P＜0.05），cSN50.1組細胞質中c-Jun蛋白的表達則明顯增高（P＜0.05）（圖6a、b）；與Control組相比，SP600125組和cSN50.1組細胞核中c-Jun蛋白的表達均明顯降低（P值均＜0.01）（圖6c、d）。

圖6 cSN50.1對各組細胞質和細胞核中c-Jun蛋白表達的影響Figure 6 Effects of cSN50.1 on the expression of c-Jun protein in cytoplasm and nucleus of each group of cells

2.6 NF-κB信號通路在cSN50.1對肝癌細胞HepG2作用中的影響

2.6.1 cSN50.1對肝癌細胞HepG2中炎癥因子CXCL5和TNF-α表達的影響 與Control組相比，PDTC組和cSN50.1組的CXCL5和TNF-α mRNA的表達均明顯降低（P值均＜0.05）（圖7a、b）。與Control組相比，PDTC組和cSN50.1組中CXCL5和TNF-α蛋白的表達均明顯降低（P值均＜0.05）（圖7c、d）。

圖7 cSN50.1對各組細胞中CXCL5和TNF-α表達的影響Figure 7 Effects of cSN50.1 on the expression of CXCL5 and TNF-α in each group

2.6.2 cSN50.1對肝癌細胞HepG2中通路NF-κB蛋白表達的影響 與Control組相比，PDTC組細胞質中NF-κB蛋白的表達明顯降低（P＜0.05），而cSN50.1組細胞質中NF-κB蛋白的表達明顯增高（P＜0.05）（圖8a、b）；與Control組相比，PDTC組和cSN50.1組細胞核中NF-κB蛋白的表達均明顯降低（P值均＜0.05）（圖8c、d）。

圖8 cSN50.1對各組細胞質和細胞核中NF-κB蛋白表達的影響Figure 8 Effect of cSN50.1 on the expression of NF-κB protein in cytoplasm and nucleus of cells of each group

3 討論

慢性炎癥是腫瘤微環(huán)境特征的核心因素。炎癥因子是腫瘤組織局部微環(huán)境的重要組成，它們在炎癥與腫瘤相互關系中起著重要作用［9］。炎性因子的長期產生和積累可在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮局部和全身免疫抑制作用［10-11］。隨著腫瘤相關性炎癥方面的深入研究，以藥物治療腫瘤相關炎癥已經成為癌癥的可行性治療策略。因此，需要進行進一步的研究，以提高對腫瘤相關性炎癥的理解，制訂個性化治療策略，使肝癌不同階段患者的療效達到最佳，副作用降至最低［11-15］。

研究表明，cSN50.1可以抑制多種促炎mRNA的表達，維持正常的血小板計數，減少微血管損傷的血漿標志物以及肝臟的中性粒細胞浸潤。并且cSN50.1能夠減少肝臟中SRTF、AP-1、NF-κB和STAT-1的入核轉運，抑制敗血癥相關代謝對肝臟的損傷，并改善動脈粥樣硬化和脂肪性肝炎［16-17］。鑒于cSN50.1具有較好的抗炎作用，且其對肝癌的影響尚未見報道。因此，本文分別采用了CCK-8、細胞劃痕、Transwell實驗和細胞克隆實驗檢測了不同濃度cSN50.1對肝癌細胞HepG2的增殖、遷移、侵襲和集落形成能力的影響。結果表明，一定水平的cSN50.1可以抑制HepG2細胞的增殖、遷移、侵襲和集落形成能力，認為cSN50.1具有抑制肝癌細胞HepG2惡性行為的作用。

CXCL5是一種主要在上皮細胞上表達的CXC趨化因子［18-20］。它對CXCR2受體具有特異性，并參與中性粒細胞的募集和活化。CXCL5被認為是肝癌的治療靶點，CXCL5可促進肝癌的腫瘤增殖、生長、遷移、侵襲、轉移和腫瘤內中性粒細胞浸潤［21-23］。研究［24-25］表明，使用抑制劑SCH772984和SP600125分別抑制ERK和AP-1信號通路后，肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力也受到了抑制。有學者［26-27］發(fā)現，烏司他丁聯合索拉非尼可以通過抑制NF-κB信號通路，降低TNF-α在肝癌細胞中的表達。因此，通過抑制AP-1和NF-κB活性來降低CXCL5和TNF-α已被考慮用于尋找有效治療癌癥的藥物。

鑒于炎癥因子CXCL5和TNF-α在慢性炎癥誘導的腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用，本文又采用RT-PCR和Western Blot技術研究了cSN50.1對肝癌細胞HepG2中CXCL5和TNF-α的影響作用，以及這種影響是否是通過調控NF-κB和AP-1信號轉導途徑實現的。研究結果表明，cSN50.1能夠下調肝癌細胞HepG2中CXCL5和TNF-α mRNA和蛋白的表達，并能夠增加細胞質中c-Jun和NF-κB的表達，減少細胞核中c-Jun和NF-κB的表達，因此，認為cSN50.1可以通過抑制肝癌細胞HepG2中c-Jun和NF-κB的入核轉運來降低CXCL5和TNF-α的表達，進而抑制肝癌細胞HepG2的惡性行為。cSN50.1多肽的靶向治療作為一種新型的抗癌藥物具有開發(fā)潛力，值得進一步研究，為臨床治療肝癌的指導用藥提供了理論和實驗依據。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：辛華、欒海艷負責課題設計，資料分析，撰寫論文；單洪超參與收集數據，修改論文；阮洋、楊鑫妍負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。