覃川福， 趙雅麗， 龍麗娟， 邱華

1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科， 南寧 530021； 2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 南寧 530021

肝纖維化是一種以肝組織中胞外基質(zhì)（ECM）過多為特征的慢性肝損傷，由多種因素引起，包括病毒性肝炎、藥物和自身免疫性疾?。?］。目前在我國其主要病因仍是HBV感染。最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國慢性HBV感染者約存7 000萬例，其中慢性乙型肝炎（CHB）患者為2 000萬～3 000萬例。如未得到有效治療由CHB進(jìn)展至肝纖維化、肝硬化的5年累積發(fā)生率可達(dá)12%～25%，肝硬化進(jìn)展至肝衰竭或肝細(xì)胞癌（HCC）的5年累積發(fā)生率分別達(dá)20%～30%和6%～15%［2-3］。因此，深入探索乙型肝炎肝纖維化的機(jī)制，尋找有效的防治方法，具有重大意義。HBV感染并不能直接導(dǎo)致肝細(xì)胞病變，研究者們普遍認(rèn)為機(jī)體的病理損傷和病程轉(zhuǎn)歸主要與病毒入侵后引發(fā)的機(jī)體免疫應(yīng)答有關(guān)，針對HBV抗原的免疫應(yīng)答強(qiáng)度決定了疾病最終的轉(zhuǎn)歸［4］，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）是清除HBV的決定性力量，并發(fā)揮著對HBV長期免疫監(jiān)視，抑制乙型肝炎肝纖維化激活的功能［5］。而HBx蛋白在慢性乙型肝炎發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要調(diào)控作用［6］。有研究［7］發(fā)現(xiàn)將轉(zhuǎn)染了HBx的肝細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞（HSC）共培養(yǎng)，α-SMA、膠原和TGF-β1的表達(dá)明顯增高。但CTL是否通過調(diào)控HBx蛋白表達(dá)而影響HBV復(fù)制及抑制肝纖維化未見報道。近年來，對外泌體作為細(xì)胞間物質(zhì)和信息的傳遞工具的研究越來越受關(guān)注。有研究表明，感染HBV肝細(xì)胞、HSC及CTL細(xì)胞均可分泌外泌體，并在不同層面參與了肝纖維化的調(diào)控。本研究前期已經(jīng)成功構(gòu)建含HBV全基因組1.3倍體的HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型，并命名為HepGA14［8］。據(jù)此，本研究將CTL-exo加入HepGA14培養(yǎng)體系，同時將CTL-exo和HBV-exo按照不同比例進(jìn)行混合后，與LX-2細(xì)胞共孵育，擬明確CTL能否通過外泌體途徑跨細(xì)胞靶向HBx抑制HSC活化，以期為乙型肝炎肝纖維化的防治提供新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 HepG2、HepGA14、HSC-LX2和CTL細(xì)胞（上海諾百生物科技有限公司）。

1.1.2 主要試劑及藥物 DMEM培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液、FBS（美國Thermo Fisher Scientific公司）；抗體：Anti-CD63 antibody、Anti-TSG101 antibody、Anti-Hepatitis B Virus X antigen antibody（英國Abcam公司）；Anti-GAPDH（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG、HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（上海生工生物工程有限公司）；氟硼二吡咯染料（美國Sigma公司）；磷鎢酸（德國Merck公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；透射電鏡（美國Thermo Fisher Scientific公司）；共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

本研究嚴(yán)格遵循《中華人民共和國生物安全法》中“病原微生物實驗室生物安全”的相關(guān)法律規(guī)定進(jìn)行管理與操作。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) （1）HepG2、HepGA14和LX-2細(xì)胞分別在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）CTL系TALL-04培養(yǎng)：培養(yǎng)基為1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加10%FBS和1%雙抗。傳代時采用1 000 r/min離心5 min，用新鮮培養(yǎng)基重懸，再按照比例（1∶2～1∶4）傳到新皿中，培養(yǎng)至1×108個細(xì)胞量。

1.2.2 HepG2、HepGA14及CTL細(xì)胞外泌體提取與鑒定 （1）外泌體提?。号囵B(yǎng)HepG2及HepGA14細(xì)胞，準(zhǔn)備80%左右密度的細(xì)胞各50皿，換成無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別收集細(xì)胞上清。超速離心法提取外泌體，具體步驟如下：取50 mL細(xì)胞上清，以1 000 r/min離心10 min，取上清。以3 000 r/min離心10 min，取上清。10 000×g離心30 min，取上清。在4 ℃下以100 000×g持續(xù)離心90 min，去掉上清，留下的沉淀PBS重懸后，再次以100 000×g離心90 min，取上清，同法提取CTL細(xì)胞外泌體，將獲取的外泌體分別保存?zhèn)溆?。?）外泌體鑒定：①透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。分別取NC-exo、HBV-exo及CTL-exo 10 μL滴于透射電鏡專用的載樣銅網(wǎng)上，常溫靜置2 min，濾紙吸去浮液，用1%（W/V）磷鎢酸溶液染色5 min后，濾紙吸去多余染色液，晾干，透射電鏡觀察外泌體結(jié)構(gòu)。②Western Blot檢測外泌體的標(biāo)志物CD63和TSG101表達(dá)（以細(xì)胞裂解物為對照）。取HepGA14細(xì)胞上清，以100 000×g離心90 min后，棄上清，加入100 μL RIPA裂解液，吹打使裂解液和HBV-exo充分混合，冰上裂解30 min。4 ℃、12 000 ×g離心30 min，吸取上清液置于1.5 mL EP管中，-80 ℃凍存。BCA法檢測蛋白濃度，加入5×Loading Buffer，99 ℃變性10 min。取20 μg/孔上樣至10% SDS-PAGE膠，80 V電泳30 min，120 V電泳1 h，采用濕法轉(zhuǎn)膜，220 mA轉(zhuǎn)膜1 h，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，5%牛血清白蛋白稀釋一抗CD63，4 ℃孵育一抗過夜。TBST漂洗10 min，洗滌3次，加入二抗室溫孵育1 h，加入顯影液，上機(jī)曝光。同法檢測HepG2、CTL細(xì)胞外泌體的標(biāo)志物CD63和TSG101表達(dá)，以細(xì)胞裂解液為對照。

1.2.3 觀察HBV-exo能否進(jìn)入且影響HSC （1）外泌體熒光標(biāo)記：用工作濃度為1 μg/mL氟硼二吡咯染料（BODIPY）避光染色30 min標(biāo)記肝細(xì)胞HepG2及HepGA14細(xì)胞；換成無血清細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用超速離心法提取純化外泌體（方法同1.2.2），保存?zhèn)溆?。?）共聚焦熒光顯微鏡觀察：取LX-2細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后加入上述熒光標(biāo)記的HBV-exo，孵育48 h后采用PBS洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定、DAPI染色。共聚焦熒光顯微鏡下觀察HBV-exo是否進(jìn)入細(xì)胞。同法檢測NC-exo能否進(jìn)入HSC，不加外泌體為對照（簡寫為Con）。（3）檢測HBV-exo能否影響LX-2細(xì)胞活性：①倒置顯微鏡觀察LX-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；②將NC-exo、HBV-exo分別加入到LX-2細(xì)胞培養(yǎng)體系中，同時設(shè)置兩種外泌體1∶1混合組（簡寫為NC-exo+HBV-exo），以不加外泌體為對照（簡寫為Con），37 ℃孵育48 h后，收集HSC，提取總RNA。采用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測LX-2細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA、Collagen1等活化生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，以actin為內(nèi)參，qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，40個循環(huán)，引物見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.2.4 分析CTL細(xì)胞外泌體對HepGA14細(xì)胞的影響 （1）將CTL-exo加入到HepGA14的培養(yǎng)體系中，以不加外泌體為對照。孵育48 h分別收集HepGA14細(xì)胞（細(xì)胞依次簡寫為CTL-exo和Con）和培養(yǎng)上清（上清外泌體依次簡寫為CTL+HBV-exo和HBV-exo）；用qPCR檢測HepGA14細(xì)胞內(nèi)HBV DNA和cccDNA水平，上清液提取外泌體中HBx mRNA的水平，qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，40個循環(huán)；Western Blot檢測外泌體HBx蛋白水平，方法同1.2.2。（2）將CTL-exo和HBV-exo按照不同比例（2∶1、5∶1、10∶1）進(jìn)行混合后，加入到LX-2細(xì)胞培養(yǎng)體系中，以單加HBV-exo為陽性對照，以不加外泌體為陰性對照（簡寫為Con），37 ℃孵育48 h后收集LX-2細(xì)胞；qPCR檢測LX-2細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA、Collagen1等活化生物標(biāo)志物的表達(dá)，方法同1.2.3。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用軟件SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有實驗均重復(fù)3次，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間比較采用成組t檢驗。多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定 透射電鏡觀察可見具有雙層膜結(jié)構(gòu)的微囊，呈圓形或橢圓形，囊泡的直徑為50～100 nm，符合外泌體粒徑范圍；Western Blot檢測顯示，與相應(yīng)對照組比較，NC-exo組、HBV-exo組及CTL-exo組高表達(dá)標(biāo)志蛋白CD63和TSG101（圖1）。

圖1 外泌體鑒定Figure 1 Exosome identification

2.2 觀察外泌體能否進(jìn)入HSC及活化HSC

2.2.1 外泌體與LX-2細(xì)胞共培養(yǎng)觀察 共聚焦熒光顯微鏡下可見NC-exo、HBV-exo被HSC攝取（圖2）。

圖2 熒光顯微鏡下觀察外泌體進(jìn)入LX-2細(xì)胞情況（×200）Figure 2 Observation of exosomes entering LX-2 cells under fluorescence microscopy（×200）

2.2.2 HBV-exo能否活化HSC-LX2 （1）倒置顯微鏡下可見HBV-exo進(jìn)入LX-2細(xì)胞后HSC胞體增大、胞突伸展（圖3）。（2）qPCR結(jié)果示NC-exo組、NC-exo+HBV-exo組、HBV-exo組及Con組LX-2細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA和Collagen1基因相對表達(dá)量不同，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。與NC-exo組相比，NC-exo+HBV-exo組和HBV-exo組LX-2細(xì)胞中TGFβ-1、α-SMA及Collagen1基因相對表達(dá)量均顯著升高（P值均＜0.05），與HBV-exo組相比，NC-exo+HBV-exo組LX-2細(xì)胞中TGFβ-1、α-SMA及Collagen1基因相對表達(dá)量均顯著降低（P值均＜0.05）（表2）。

圖3 相差顯微鏡下觀察LX-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變（×100）Figure 3 Observe the morphological changes of LX-2 cells by phase-contrast microscope（×100）

2.3 分析CTL細(xì)胞外泌體對HepGA14細(xì)胞的影響

2.3.1 CTL細(xì)胞外泌體對HepGA14細(xì)胞的影響qPCR檢測顯示：與對照組相比較，CTL-exo組HepGA14細(xì)胞中HBV DNA（0.30±0.01 vs 1.00±0.01，t=-85.732，P＜0.05）及cccDNA（0.25±0.01 vs 1.00±0.01，t=-113.000，P＜0.05）表達(dá)量均明顯下降；與HBV-exo組相比，CTL+HBV-exo組外泌體中HBx mRNA相對表達(dá)量明顯下降（0.20±0.01 vs 1.00±0.03，t=-38.105，P＜0.05）。Western Blot檢測顯示：與HBV-exo組比較，CTL+HBV-exo組外泌體中HBx蛋白相對表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-13.093，P＜0.05）（圖4）。

圖4 CTL-exo對HBV感染肝細(xì)胞的影響Figure 4 Effect of CTL-exo on HBV-infected hepatocytes

2.3.2 CTL細(xì)胞外泌體對HepGA14細(xì)胞外泌體活化HSC的影響 qPCR檢測顯示：HBV-exo組、CTL-exo∶HBV-exo=2∶1組、CTL-exo∶HBV-exo=5∶1組、CTL-exo∶HBV-exo=10∶1組、Con組LX-2細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA、Collagen1基因相對表達(dá)量不同，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）；與Con組相比，HBV-exo組、CTL-exo∶HBV-exo=2∶1組、CTL-exo∶HBV-exo=5∶1組中α-SMA、Collagen1基因表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）；并且LX-2細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA、Collagen1基因相對表達(dá)量隨著CTL-exo比例的增加而逐漸減弱（表3）。

表3 不同HBV-exo、CTL-exo濃度比例干預(yù)后HSC-LX2細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA、Collagen1的相對表達(dá)量Table 3 Relative expressions of TGF-β1， α-SMA and Collagen1 in HSC-LX2 cells after different HBV-exo and CTL-exo concentration ratios

3 討論

HBV感染呈世界性流行，是影響全球的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題?，F(xiàn)我國由于乙型肝炎疫苗和乙型肝炎預(yù)防知識的普及，乙型肝炎新發(fā)人數(shù)有逐步下降的趨勢，但在2009—2018年的10年期間，年新發(fā)人數(shù)仍維持在100萬左右［9］。目前抗病毒病因治療是乙型肝炎的主要治療手段，主要包括核苷（酸）類似物及干擾素兩大類，通過有效抑制HBV復(fù)制使肝纖維化能獲得不同程度的改善，但不能徹底清除HBV，有部分患者仍出現(xiàn)肝纖維化及進(jìn)展［10-11］。有研究［12］發(fā)現(xiàn)對于僅取得病毒學(xué)和生化學(xué)應(yīng)答的部分患者，其肝纖維化依然存在，甚至持續(xù)進(jìn)展，可最終發(fā)展為肝硬化或肝癌；而對于獲得HBeAg、HBsAg血清學(xué)應(yīng)答者，肝臟炎癥及纖維化進(jìn)程能獲得明顯改善，發(fā)生肝硬化和HCC的風(fēng)險顯著減少。陳博武等［13］在一項隨訪長達(dá)5年包含542例患者的接受抗病毒治療的代償期乙型肝炎肝硬化患者隊列研究中，比較持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答隊列患者和非持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答隊列患者的肝癌發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)非持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答隊列患者5年肝癌發(fā)生率為34.8%，持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答隊列患者5年肝癌發(fā)生率為20.6%，發(fā)生率明顯下降。由HBV的生命周期可知HBeAg、HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的本質(zhì)就是獲得對cccDNA的抑制、沉默及清除［14］。這表明了免疫對HBV控制力的強(qiáng)弱，才是決定乙型肝炎肝纖維化是否激活與進(jìn)展的關(guān)鍵因素。目前關(guān)于CTL對HBV的清除機(jī)制研究較為深入，已有研究發(fā)現(xiàn)3種抑制或清除HBV的主要途徑。其一，F(xiàn)as配體（FasL）途徑［15］：CTL可表達(dá)與Fas相結(jié)合的細(xì)胞表面蛋白FasL。當(dāng)FasL與靶細(xì)胞上的Fas相互作用，通過死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而活化凋亡途徑，然而這種機(jī)制在清除胞漿內(nèi)HBV核衣殼和復(fù)制的HBV DNA中間體方面作用較小。其二，穿孔素和顆粒酶途徑［16］：CTL通過穿孔素和顆粒酶系統(tǒng)誘導(dǎo)感染HBV的肝細(xì)胞直接裂解，減少感染HBV的肝細(xì)胞數(shù)量。其三，細(xì)胞因子途徑［17］：CTL可通過釋放細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ等清除HBV核衣殼顆粒、復(fù)制中間體，甚至是降解轉(zhuǎn)錄模板cccDNA。這種“非殺細(xì)胞”模式不會引起細(xì)胞壞死及炎癥，是CTL清除cccDNA，實現(xiàn)乙型肝炎“治愈”，抑制肝纖維化的最主要途徑。但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

外泌體是一種能被機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層膜，直徑為30～150 nm，幾乎所有細(xì)胞均可分泌，并廣泛存在于各種體液中［18-20］，外泌體可將參與生理或病理過程的生物分子從母體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，是細(xì)胞間通訊的有效方式［21］。有研究［22］發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞分泌的外泌體含有免疫調(diào)節(jié)成分，如IFN-α、IFN-β、ILs等，使外泌體具有抗病毒的活性。并且有研究者［23］發(fā)現(xiàn)從HBV感染者外周血血清分離出的外泌體中含有大量的病毒成分，包括HBV DNA、HBV RNA、HBsAg、HBeAg、HBx蛋白等。本研究將BODIPY標(biāo)記的HBV-exo，加入HSC-LX2培養(yǎng)體系中，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)HBV-exo能進(jìn)入LX2細(xì)胞，并活化LX-2細(xì)胞，也證實了外泌體的載體作用。由此推測CTL可能通過外泌體途徑干預(yù)HBx表達(dá)、抑制HBV表達(dá)及HSC活化。

為此本研究將CTL-exo加入到HepGA14培養(yǎng)體系中，發(fā)現(xiàn)HepGA14細(xì)胞內(nèi)HBV DNA、cccDNA表達(dá)水平下降，并下調(diào)外泌體中HBx mRNA及蛋白的水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明CTL-exo可能靶向HBx抑制HBV復(fù)制。再將CTL-exo和HBV-exo按照不同比例進(jìn)行混合后干預(yù)LX-2細(xì)胞，TGF-β1、α-SMA、Collagen1的表達(dá)水平也隨著CTL-exo比例的增加而逐漸減弱，由此可見，CTL-exo可能通過抑制HBx的表達(dá)，從而抑制HSC活化。由此，本課題組在原肝纖維化“炎癥致病”學(xué)說的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步追溯到炎癥產(chǎn)生的源頭，提出了外泌體介導(dǎo)的跨細(xì)胞競爭機(jī)制假說：即感染HBV的肝細(xì)胞通過外泌體途徑跨細(xì)胞傳輸HBx等致病因子引起HSC活化，而CTL等免疫細(xì)胞亦可通過外泌體途徑傳輸抗cccDNA的免疫防御因子，抑制HSC活化。乙型肝炎肝纖維化是否啟動或進(jìn)展決定于上述兩股力量“綜合競爭”的結(jié)果。本研究表明CTL可通過外泌體途徑下調(diào)HBx表達(dá)從而抑制HSC活化，為乙型肝炎肝纖維治療新途徑提供參考。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：覃川福負(fù)責(zé)實驗研究、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫；趙雅麗負(fù)責(zé)實驗研究和數(shù)據(jù)分析；龍麗娟負(fù)責(zé)實驗研究及論文撰寫；邱華負(fù)責(zé)課題設(shè)計，數(shù)據(jù)分析，指導(dǎo)實驗和寫作。