林瀟 陳靈斌 劉炳輝 陳慧 黃合 游淑清

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是女性第二常見和男性第三常見的癌癥，是癌癥死亡的第四大原因，致死人數(shù)占全球死亡人數(shù)的9.2%[1]，且越來越年輕化，大多集中于40～50 歲[2]。早期診斷和治療可有效提高患者生存率，但仍有高達75.0%的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，5 年總生存率僅為13.0%[3]。2018 年，中國新增CRC 患者521 490 例，病死247 563 例[4]。在CRC 中發(fā)現(xiàn)的分子特征標志物為靶向治療提供理論基礎(chǔ)[5]，使通過檢測基因表達篩選CRC 患者和預(yù)測CRC 患者預(yù)后成為了可能[6-7]。染色質(zhì)重塑蛋白（microrchidia，MORC）家族蛋白參與蛋白質(zhì)相互作用、DNA 代謝、蛋白質(zhì)亞細胞定位等多種生物學(xué)作用[8]。其中染色質(zhì)重塑蛋白家族CW 型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白1（chromatin remodeling protein microrchidia family CW-type zinc finger 1，MORC1）在乳腺小葉癌、肺癌、惡性黑色素瘤組織中表達上調(diào)[9]；MORC2 在膽管癌、三陰性乳腺癌、肝癌組織中表達上調(diào)[10-13]；MORC3 高表達能增加皮肌炎患者的患癌風(fēng)險[14]；MORC4 在B 細胞淋巴瘤細胞系中高表達，是淋巴瘤潛在的生物標志物[15]。本研究檢測MORC4 在CRC組織與正常結(jié)直腸黏膜組織間的表達差異，分析MORC4 高表達對CRC 患者預(yù)后的影響，并通過功能缺失實驗研究其對CRC 細胞生物學(xué)行為的影響，以期為CRC 患者預(yù)后判斷和治療新靶點選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織及細胞 收集2018 年1 月至2019 年2 月在臺州市第一人民醫(yī)院行手術(shù)切除的80 例CRC 組織及配對癌旁組織（距癌組織≥5 cm），所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，且術(shù)前均未接受過放化療及其他治療。新鮮CRC 及癌旁組織標本離體后置于-80 °C 液氮冷凍并低溫冰箱保存?zhèn)溆?。另取同期手術(shù)切除的CRC標本150 例和癌旁組織標本60 例，用石蠟包埋后作免疫組化檢查。150 例CRC 患者中，男84 例，女66 例；年齡＜60 歲22 例，≥60 歲128 例；腫瘤位于左側(cè)116 例，右側(cè)34 例；腫瘤直徑≤5 cm 98 例，＞5 cm 52 例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（union for international cancer control，UICC）和美國癌癥聯(lián)合會（American joint committee on cancer，AJCC）制定的腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-nodemetastasis，TNM）分期系統(tǒng)（2017 年第8 版），Ⅰ+Ⅱ期89 例，Ⅲ+Ⅳ期61 例；高+中分化126 例，低分化24 例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移92 例；有遠處轉(zhuǎn)移19 例，無遠處轉(zhuǎn)移131 例；T 分期黏膜+黏膜下層浸潤16 例，肌層+漿（外）膜層134 例；血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）＜5 μg/L 70 例，≥5 μg/L 80例。CRC 細胞系（HCT-15、SW480、SW620、DLD-1、HCT116）和人結(jié)腸上皮細胞株（NCM460）均購于上海中科院細胞庫。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（批準文號：2022-KY018-01）。

1.1.2 主要試劑 MORC4 一抗（批號：GR256479-6）購自美國Abcam 公司；二抗（批號：wp18031101）、檸檬酸鹽（批號：18070601）、過氧化氫（批號：180105）均購自福州市邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液（批號：wp18111303）、蘇木素染色液（批號：2018052901）、結(jié)晶紫（批號：20181025）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細胞增殖/凋亡檢測（cell counting kit 8，CCK-8）試劑盒（批號：GX735）購自北京索萊寶科技有限公司。MORC4、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、MORC4 敲低（si-MORC4）及MORC4 陰性對照（siRNA）等引物均由上海瑞博生物技術(shù)公司合成；Trizol（批號：50175111）、PrimeScriptTMRT 試劑盒（RR036A）（批號：AM82912A）及TBGreen?Premex Ex TaqTM試劑盒（RR420A）（批號：AIF1690A）均購自日本Takara 公司；Lipofectamine 2000（批號：CN2541135）購自美國Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 組織和細胞中MORC4 mRNA 表達的檢測 采用qRT-PCR 法。取CRC 組織、癌旁組織及6 種細胞，采用Trizol 試劑提取細胞中總RNA，合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA 8 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃5 min，60 ℃15 min，25 ℃30 min。參照TBGreen?Premex Ex TaqTM試劑盒說明完成qRT-PCR，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃90 s，95 ℃15 s、65 ℃30 s、68 ℃30 s，40 個循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s收集熒光信號，根據(jù)熔解曲線分析，以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算各樣本中MORC4 mRNA 相對表達量。各引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 CRC 組織中MORC4 蛋白表達的檢測 采用免疫組化法。150 例CRC 組織和60 例癌旁組織標本石蠟包埋修整，切片，80%甲醇孵育10 min 以阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性；PBS 清洗，0.1 mmol/L 枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù)；PBS 清洗，滴加50 μL 一抗（MORC4 稀釋濃度為1∶100）37 ℃孵育1 h。PBS 清洗，滴加50 μL辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育1 h；PBS 清洗，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，37 ℃孵育1 h。PBS清洗，DAB 顯色復(fù)染后封片，顯微鏡下觀察。MORC4抗體主要定位于腫瘤細胞的胞核，染色后呈棕黃色顆粒狀，根據(jù)染色細胞占視野中細胞數(shù)量的百分比計分，≥5%計0 分，6%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51%～75%計3 分，＞75%計4 分；根據(jù)染色強度計分，無著色計0 分，淺著色計1 分，中等著色計2 分，強著色計3分。兩項分數(shù)相乘得到最終評分：0～1 分為陰性（-），2～4 分為弱陽性（+）；6～8 分為中度陽性（++），9～12 分為強陽性（+++），其中-～+視為低表達，++～+++視為高表達。計算高表達率。

1.2.3 不同MORC4 蛋白表達水平患者預(yù)后比較 術(shù)后采用電話或門診隨訪，隨訪開始時間為手術(shù)開始時間，隨訪結(jié)束時間為術(shù)后死亡時間或隨訪截止時間，即2023 年2 月22 日或至患者死亡?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為手術(shù)開始至首次發(fā)現(xiàn)全因死亡或末次隨訪時間。以1.2.2 判斷標準將CRC 患者分為MORC4 高表達組和低表達組，比較兩組生存率的差異。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染及分組 以1.2.1 中MORC4 mRNA 相對表達量最大的CRC 細胞株作為轉(zhuǎn)染細胞。取對數(shù)生長期細胞種植于6 孔板，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，至細胞融合度達70%時進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染過程按照Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。轉(zhuǎn)染6 h 后，用無抗生素的完全培養(yǎng)基進行換液。待48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。分空白對照組（不加任何試劑）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染siRNA）)、敲低組（轉(zhuǎn)染si-MORC4）。引物序列見表1。

1.2.5 3 組細胞增殖能力的檢測 采用CCK-8 法。將1.2.4 各組細胞經(jīng)消化、洗滌，按5 000 個/孔接種于96孔板，100 μL/孔，培養(yǎng)至細胞貼壁。分別于0、24、48、72 h 時加入10 μL/孔CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，用酶標儀檢測每孔在450 nm 波長下的吸光度，吸光度越高，表示細胞增殖能力越強。

1.2.6 3 組細胞遷移能力的檢測 采用細胞劃痕實驗。取1.2.4 各組細胞經(jīng)消化、洗滌，按5 000 個/孔接種于6 孔板，待細胞鋪滿孔底時，使用10 μL 槍頭比著直尺均勻劃橫線，用無菌PBS 輕輕洗滌處理孔3 次，盡可能地洗掉劃下的細胞，并進行拍照（0 h）。加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并于48 h 重復(fù)洗滌、拍照及培養(yǎng)。使用ImageJ 軟件計算劃痕處的面積變化。計算劃痕愈合率（%）=[（0 h 劃痕面積-48 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積]×100%，愈合率越大，表示細胞遷移能力越強。

1.2.7 3 組細胞侵襲能力的檢測 采用Transwell 細胞侵襲實驗。將Transwell 小室放入24 孔板中，取1.2.4各組細胞，接種于上室。在下室中加入含有10% FBS的新鮮培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell 小室，添加4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%結(jié)晶紫染色后，封片，在顯微鏡下計數(shù)穿膜的細胞數(shù)目，即為侵襲細胞數(shù)目。穿膜細胞數(shù)量越多，表示細胞的侵襲能力越強。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存率的比較采用log-rank 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種組織中MORC4 mRNA 表達的比較 相比癌旁組織，CRC 組織中MORC4 mRNA 相對表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 兩種組織中MORC4 mRNA 表達的比較

2.2 兩種組織中MORC4 蛋白表達的比較 免疫組化染色可見，相比癌旁組織，CRC 組織標本中細胞核棕黃色集中，見圖2（插頁）。CRC 組織標本的MORC4 蛋白高表達率為62.0%，顯著高于癌旁組織（11.7%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

圖2 MORC4 在兩種組織中的免疫組化染色圖

表2 兩種組織中MORC4蛋白表達的比較（例）

2.3 不同病理特征患者CRC 組織中MORC4 高表達率的比較 不同性別、年齡、腫瘤位置（左右側(cè)）、腫瘤直徑、T 分期的患者CRC 組織中MORC4 高表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠處轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期及血清CEA水平患者CRC 組織中MORC4 高表達率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3 不同病理特征患者CRC組織中MORC4高表達率的比較

2.4 MORC4 蛋白表達水平對CRC 患者預(yù)后的影響隨訪3 年，CRC 患者存活117 例，死亡27 例，失訪6 例；術(shù)后生存時間為15～36 個月。生存分析顯示CRC 組織中MORC4 高表達患者3 年總生存率低于MORC4 低表達患者（P＜0.05），見圖3。

圖3 MORC4 表達與CRC 患者預(yù)后的生存分析

2.5 6 種細胞中MORC4 mRNA 相對表達量的比較與NCM460 相比，SW480、SW620、DLD-1、HCT116、HCT15 中MORC4 mRNA 均顯著高表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），表明CRC 細胞中MORC4 mRNA相對表達量呈現(xiàn)上調(diào)表現(xiàn)，其中DLD-1 相對表達量最高，作為后續(xù)實驗細胞。見圖4。

圖4 6 種細胞MORC4 mRNA 相對表達量的比較

2.6 3 組細胞MORC4 mRNA 相對表達量和增殖能力的比較 與空白對照組和陰性對照組相比，敲低組細胞MORC4 mRNA 相對表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5A。培養(yǎng)24、48、72 h 時，敲低組細胞450 nm 下的吸光度均顯著小于空白對照組和陰性對照組，說明敲低組細胞增殖能力顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖5B。

圖5 3 組細胞MORC4 mRNA 相對表達量和吸光度的比較

2.7 3 組細胞侵襲、遷移能力的比較 相比空白對照組及陰性對照組，敲低組劃痕愈合率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖6（插頁）。相比空白對照組及陰性對照組，敲低組細胞侵襲細胞數(shù)量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖7（插頁）。

圖6 3 組細胞遷移能力的比較（A：0、48 h 時劃痕圖；B：3 組細胞劃痕愈合率）

圖7 3 組細胞侵襲能力的比較（A：侵襲細胞染色圖；B：3 組細胞穿膜細胞數(shù)）

3 討論

CRC 的致病因素眾多，通常認為是遺傳與生活環(huán)境等多種因素共同作用的結(jié)果[16-17]。近10年，CRC 的發(fā)病率和死亡率在包括中國在內(nèi)的發(fā)展中國家呈快速增長趨勢[18]，已嚴重威脅人類健康，并給社會帶來巨大的醫(yī)療負擔(dān)。因此，尋找新的、有效的診斷和預(yù)后指標，是改善患者預(yù)后、提高生活質(zhì)量、降低病死率的關(guān)鍵。

MORC 蛋白家族是一個高度保守的核蛋白超級家族，家族成員均有3 個標志性的結(jié)構(gòu)域：N 端保守的MutL 型-ATP 酶結(jié)構(gòu)域，參與了DNA 損傷修復(fù)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的生物學(xué)過程；中間CW 型鋅指結(jié)構(gòu)域，通過識別組蛋白3 賴氨酸4 甲基化的重要組蛋白參與染色質(zhì)調(diào)控；C 末端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，在蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)亞細胞定位中起到重要作用[19-20]。作為MORC 蛋白家族成員之一的MORC4，除了具有共同的結(jié)構(gòu)域外，還包含4 個潛在的小泛素相關(guān)修飾蛋白化位點（small ubiquitin-like modifier，sumo），能夠招募羧基末端結(jié)合蛋白（C-terminal-binding proteins，CtBP）輔抑制因子[21]。

MORC4 作為一種新型的致癌基因，參與腫瘤細胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，包括腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，MORC4 在乳腺癌組織及細胞中高表達，敲低MORC4 可抑制乳腺癌細胞的生物學(xué)行為，促進細胞凋亡[22]。本研究結(jié)果顯示，MORC4 在CRC 組織及細胞中顯著高表達，表明MORC4 在CRC 發(fā)生中發(fā)揮致癌基因的作用。分析MORC4 與臨床病理特征的關(guān)系可知，MORC4 蛋白高表達率在不同性別、年齡、腫瘤位置（左右側(cè)）、腫瘤直徑、T 分期的患者CRC 組織中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但在不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠處轉(zhuǎn)移情況、TNM 分期及血清CEA 水平的患者CRC 組織中存在統(tǒng)計學(xué)差異。生存分析顯示，MORC4 高表達的CRC 患者總生存率顯著低于低表達患者，提示MORC4 對CRC 惡性程度和預(yù)后的判斷可能具有指導(dǎo)意義。敲低CRC 細胞中的MORC4 則抑制了CRC 細胞的增殖、遷移及侵襲，證實MORC4 可能成為CRC 治療的一個潛在靶點。

綜上所述，MORC4 在CRC 組織中表達上調(diào)，MORC4 高表達的CRC 患者生存率顯著降低。MORC4能顯著促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移。MORC4 在CRC 中的表達及作用的闡明為探究CRC 的發(fā)生、發(fā)展分子機制提供了一定理論參考，靶向MORC4 可能是CRC 治療的潛在策略。