尹玉潔，李 薇，萬 欣，封嗣中，戎春馳

（南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇南京 210023）

廣藿香精油（Patchouli essential oil，PEO）是從唇形科刺蕊草屬植物廣藿香植株中提取的一種植物精油，是一種具有壤香、木香和草藥香的天然植物精油，主要的功能性成分是百里香酚、4-異丙基甲苯、γ-松油烯和香芹酚等物質[1]。此外，還含有多種萜類、酚類、酯類和醇類化合物等成分，具有抗癌、抗炎、抗氧化和抗菌活性[2]。然而，由于PEO 的味道有強烈刺激性、較強的揮發(fā)性和疏水性，還有對氧氣和光的敏感性等各種缺點[3]，這些缺點嚴重限制了PEO在食品領域的廣泛應用。

利用近些年來興起的納米乳液（Nanoemulsion，NE）技術來包埋精油，解決精油水溶性及穩(wěn)定性差等缺點，精油NE 在食品的抗菌保鮮領域已經越來越多的應用[4]，逐漸成為食品保鮮領域的熱點技術。NE是一種由油相、水相、表面活性劑等按照一定的比例制備而成的粒徑范圍為50～500 nm 的膠體分散系統(tǒng)[5]。大小均勻，透明或半透明[6]，具有高速離心穩(wěn)定的性質，是動力學穩(wěn)定體系之一[7]。與純精油相比較而言，精油NE 的質地比較均勻、顆粒比較細膩、刺激性味道明顯減弱，使用起來舒適感很強，在很長時間內都具有穩(wěn)定性[8]。

國內外對NE 的制備主要采用高能乳化法和低能乳化法兩種[9]。低能乳化法是NE 利用體系的內部化學能制備的，是由相變引起的。它包括相變溫度、自發(fā)乳化和相反轉合成過程[10]。這些過程主要依賴于油、表面活性劑和其他組分界面性質的變化，以此得到合適的配方[11]。如將肉桂[12]、迷迭香[13]和百里香酚[14]等天然植物精油制備成NE，再應用于新鮮蔬菜的保鮮。NE 粒徑受油相[15]和表面活性劑的親水親油平衡值[16]（Hydrohile-ipohilie balance，HLB）的影響。陳良紅[17]將木果油，吐溫80 分別加熱至70 ℃，在普通攪拌條件下將水相加入油相制備粗乳液，在500 r/min 轉速下冷卻至40 ℃，均質后冷卻至室溫，該法制備的體系穩(wěn)定性很好。但是低能乳化法要考慮實驗對象本身的理化性質，有一定的局限性。高能乳化法是通過機械裝置利用高動能來制備NE。Kotta 等[18]是用高速攪拌機將油相、表面活性劑和水相混勻，然后在10000 psi 的壓力下用高壓均質機均質處理，使用UP200ST 超聲波細胞破碎儀在100 W 功率下對粗乳液進行5 min 的超聲處理，得到的NE 穩(wěn)定性良好，在室溫下貯藏較長時間都無分層現(xiàn)象。Adhavan 等[19]研究廣藿香精油納米乳液（Patchouli essential oil nanoemulsion，PEO NE）對福氏志賀菌、金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌和白色念珠菌的抗菌和生物膜根除活性，發(fā)現(xiàn)PEO NE 有較強的抗念珠菌活性。Park 等[20]研究廣藿香精油對長角血蜱若蟲的驅避活性，發(fā)現(xiàn)PEO NE 提高了PEO 的驅避害蟲能力，是一種潛在的長角海蛾驅避劑。Une等[21]研究了PEO 在三種不同溫度下的保質期，探究了PEO 應用在香水市場的可能性。Manjeshk 等[22]研究了PEO NE 對二斑葉螨成蟲和斜紋夜蛾幼蟲的殺蟲效果，發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾幼蟲表現(xiàn)出相當大的拒食和覓食威懾作用。

鑒于目前對PEO 及PEO NE 的研究較少，本文采用高能乳化法制備廣藿香精油納米乳液PEO NE，通過熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡這兩種儀器對PEO NE 的微觀結構進行了研究，進一步分析比較了PEO NE 凍干樣品的傅里葉紅外光譜和X 衍射光譜。此外，還研究了PEO NE 的抗氧化活性和抑菌性能。該研究對基于小分子乳化劑的NE 的開發(fā)具有重要的指導意義，NE 作為一種極具前景的抗菌劑，可以提高營養(yǎng)物質的貯藏期和生物利用度，改善生物活性化合物的遞送，可進一步開發(fā)在食品保鮮等方面中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PEO（主要成分為藿香醇、廣藿香烯，丁香酚、杜松烯） 江西華隆植物香料有限公司；殼聚糖（Chitosan，CTS，低分子量，脫乙酰度>90%）、焦磷酸硫胺素（Thiamine pyrophosphate，TPP）、二氯甲烷（Dichloromethane，DCM）、乙酸、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、吐溫80、甲醇、ABTS 和DPPH

上海麥克林生化科技有限公司；醋酸、氯化鈉、乙醇、鹽酸和氫氧化鈉 中國上海國藥集團化學試劑有限公司；實驗中所有的水溶液 均用蒸餾水配制；2 株細菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 6538）和大腸桿菌（Escherichia coliATCC 8739）

均來自南京師范大學食品與制藥工程學院；其他化學品 均為分析級。

CR21N 型高速離心機 Hinac；Secura 分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SM-3000C型超聲波細胞破碎儀 南京舜瑪儀器設備有限公司；752N/721/722N 型紫外可見分光光度計 濟南歐萊博科學儀器有限公司；奧龍Aolong X 射線衍射儀（X-RAY XRD） 丹東奧龍射線儀器集團有限公司；DF-101S 型恒溫水浴鍋 湖南力辰儀器科技有限公司；高速剪切機 上海思峻機械設備有限公司；馬爾文激光納米粒度儀 Malvern Panalytical；CKX53 型奧林巴斯倒置熒光生物顯微鏡 上海巴玖實業(yè)有限公司；FEI Apreo 美國賽默飛掃描電鏡 北京億誠恒達科技有限公司；ALPHA II 型布魯克傅立葉紅外光譜儀 布魯克（北京）科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 廣藿香精油納米乳液的制備過程 為了配制乳狀液，根據(jù)陳瑩瑩等[23]的制備方法并進行改善。分別制備了油相和水相。在PEO 中加入二氯甲烷（1:3，v/v），攪拌至溶液溶解，即油相。將1 g CTS粉末分散到100 mL 1% w/v 醋酸溶液中，在室溫條件下以1000 r/min 轉速攪拌16～24 h 左右。為了清除未溶解掉的CTS 和其他的雜質，將得到的CTS 溶液進行4000 r/min 離心10 min 處理，取上清液用于后續(xù)實驗。在乳化過程中，用蒸餾水將CTS 溶液稀釋至所需濃度，并調節(jié)pH 至6.5，即水相。

采用高能乳化法制備PEO NE（圖1）。將油相、乳化劑吐溫80 和交聯(lián)劑（TPP）緩慢加入CTS 溶液中，用高速剪切機在冰浴中以10000 r/min 的速度操作3 min，再磁力攪拌15 min 制備得到粗乳液。在剪切過程中，使用冰浴以避免加熱效應。最后，通過超聲波細胞破碎儀的作用，100 W，15 min，制備得到PEO NE，室溫貯存。

圖1 PEO NE 的制備Fig.1 Preparation of PEO NE

1.2.2 廣藿香精油納米乳液的表征

1.2.2.1 粒徑、多分散性指數(shù)（Polydispersity index，PDI）、ζ電位 將新鮮制備的PEO NE 送到科學指南針公司進行測定；將廣藿香精油納米乳液在室溫條件下貯藏30 d 后再次送到科學指南針公司進行測定。用馬爾文激光粒度儀測定PEO NE 的粒徑、ζ電位和PDI。樣品在檢測前稀釋10 倍左右，馬爾文激光粒度儀測量范圍0.02～2000 μm，掃描速度：1000次/s[24]。

1.2.2.2 包封率 采用超濾離心法[25]測定PEO NE的包封率，連續(xù)測定35 d。首先用移液槍吸取400 μL樣品放到超濾離心管中，將離心管置于離心機中，10000 r/min 轉速下離心10 min，用移液槍吸取濾液，用無水乙醇定容至10 mL，通過紫外分光光度計來測定NE 的吸光度，根據(jù)標準曲線和稀釋倍數(shù)關系計算出游離活性物的含量（Wf）。然后根據(jù)公式（1）計算PEO NE 的包封率:

式中：EE 為包封率，Wt為總活性物含量（mg），Wf為游離活性物的含量（mg）。

1.2.2.3 熒光顯微鏡 采用熒光顯微鏡測定乳液的微觀結構，分別測定新鮮制備的PEO NE 和室溫貯藏30 d 的PEO NE。在10×目鏡和60×油鏡下進行觀測。用1 mg/mL 尼羅紅溶液對精油染色，樣品染色30 min 后進行觀測。尼羅紅溶液的激發(fā)波長是561 nm，發(fā)射波長是605 nm[26]。

1.2.2.4 掃描電子顯微鏡 為了用掃描電鏡分析評價PEO NE 的形貌，把新鮮制備的樣品在-40 ℃、真空0.007 大氣壓下冷凍干燥48 h。在5.0 kV 的加速電壓下，用掃描電子顯微鏡（SEM）對其形貌和大小進行成像。粉狀樣品在檢查前涂上一層金[27]。

1.2.2.5 傅里葉變換紅外光譜 用傅立葉變換紅外光譜儀檢測新鮮制備的PEO NE 的結構變化。樣品用溴化鉀（1:100～1:200）在研缽中研磨成粉末。傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）的掃描范圍為4000～500 cm-1[28]。

1.2.2.6 X 射線衍射 用X 射線衍射儀（Cu-Ka 輻射，波長0.154 nm）獲得CTS 和新鮮制備的PEO NE的X 射線衍射圖。所有掃描均在2θ=5°～40°范圍內進行，掃描速度為2°/min[29]。

1.2.2.7 抗氧化活性 采用DPPH（2，2-二苯基-1-苦基肼）法和ABTS 法測定PEO NE 的抗氧化活性。根據(jù)鄒小波等[30]的方法測定DPPH 自由基清除率。首先吸取0.2 mL PEO NE 與3 mL 的DPPH 混合均勻，并于避光條件下放置30 min。將3 mL 的DPPH甲醇溶液（150 μmol/L）與0.2 mL 甲醇溶液混合用作參照，測定517 nm 處的吸光度值，并按照以下公式計算DPPH 自由基清除率。

式中：Af為所測樣品的吸光度；Ac為所測參照的吸光度。

根據(jù)史亞濛[31]的實驗方法來測定ABTS+自由基清除率。將7 mmol/L 的ABTS+溶液和2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合，常溫避光12 h 后得到ABTS+母液，并用超純水稀釋至其在734 nm 處吸光度值為0.700±0.020，獲得ABTS+工作液。0.5 mL PEO NE（實驗組）或超純水（空白對照組）與6.0 mL ABTS+稀釋液混合，30 ℃反應15 min 后在734 nm 處測定吸光度值。ABTS+自由基清除率的計算公式如下：

式中：A0表示空白對照組吸光度值，Ax表示實驗組樣品吸光度值。

1.2.2.8 抗菌活性 用抑菌圈直徑（Mm）測定PEO NE 的抗菌活性，連續(xù)測定7 d。用剪刀將濾紙裁剪成直徑為6 mm 的圓形濾紙片，然后將濾紙片分別浸染于PEO NE 中。待濾紙片完全浸染后將濾紙片置于已經涂布好菌株的培養(yǎng)皿中，設置三個平行。操作完成后，將培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)時間。然后在不同時間測量其抑菌圈大小，根據(jù)直徑大小判定其抑菌性能[32]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)是三次實驗的平均值±標準偏差，數(shù)據(jù)處理軟件是Excel，圖形繪制軟件是Origin。使用IBM SPSS Statistics 27 進行顯著性差異分析。統(tǒng)計學差異采用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 PEO NE 的特性——粒徑、PDI 和ζ 電位

PEO NE 制備完成后，首先測定了新鮮制備的PEO NE 的粒徑、ζ電位以及PDI。其次測定了置于室溫下貯藏30 d 的PEO NE 的粒徑、ζ電位以及PDI。如表1 所示，剛制備完成的PEO NE 的粒徑是89.5 nm；室溫下貯藏30 d 的PEO NE 的平均粒徑達到了 160.8 nm。剛制備完成的 PEO NE 的ζ電位是20.8 mV；室溫下貯藏 30 d 的 PEO NE 的ζ電位達到了 9.67 mV。樣品的 PDI 值在 0.253 到 0.363 之間，這表明了PEO NE 是均勻分布的、單分散的、穩(wěn)定的顆粒群。

表1 PEO NE 的粒徑、PDI 和ζ 電位Table 1 Particle size, PDI and ζ potential of PEO NE

2.2 包封率

一般來說，包封率越高，載體的物理化學穩(wěn)定性越高。Ruengdech 等[32]研究的兒茶素NE 的包封率為62%。李藝等[33]研究的茶黃素NE 的包封率為56.89%。本文經過超濾離心法測定了PEO NE 的包封率為95.85%，PEO 被包裹于載體中。如圖2 所示，PEO NE 在30 d 內包封率依然保持在85%以上，表明PEO NE 的包封率穩(wěn)定性非常好，原因可能是由于通過配方的改進，體系中含有大量的CTS，CTS 的粘度較大，阻礙了分子間的熱運動，從而減小了被包裹的PEO 分子之間的聚集從而結晶析出的過程[34]；另一方面，CTS 與聚甘油類的乳化劑具有非常好的親和性，巨大的親水基團向外與CTS 結合，形成了緊密的乳化劑外殼，使PEO 難以從中泄露出來，從而提高了PEO NE 的包封穩(wěn)定性[35]。

圖2 PEO NE 的包封率變化Fig.2 Change of encapsulation efficiency of PEO NE

2.3 熒光顯微鏡

新鮮制備的 PEO NE 和室溫貯藏 30 d 的 PEO NE 的熒光顯微鏡圖如圖3 所示。由圖3 可見 PEO NE 在顯微鏡下呈現(xiàn)出非常微小、且分布均勻的小油滴，但是仍能觀察到新鮮制備的 PEO NE 分布更加密集，并且 NE 的液滴尺寸較小，這與表1 中的數(shù)據(jù)是相對應的。通過對比新鮮制備的 PEO NE 和室溫貯藏 30 d 的 PEO NE 的熒光顯微鏡圖，可以發(fā)現(xiàn)，新鮮制備的 PEO NE 和室溫貯藏 30 d 的 PEO NE 的油滴尺寸相差不大，乳液中油滴仍然是分布相對均勻的，表明 CTS 和吐溫 80 共同乳化的 PEO NE 具有良好的穩(wěn)定性。

圖3 新鮮制備的PEO NE 和室溫下貯藏30 d 的PEO NE 熒光顯微鏡圖Fig.3 Fluorescence microscopy images of freshly prepared PEO NE and PEO NE stored at room temperature for 30 days

2.4 掃描電子顯微鏡

PEO NE 的 SEM 圖如圖4 所示。PEO NE 具有顆粒均勻的球形表面形態(tài)，這是因為 PEO 中的酚類物質可以與CTS 的酰胺基發(fā)生相關反應來形成共價鍵，從而增強PEO NE 的凝膠網絡。與此同時，共價交聯(lián)降低了在水中分散的PEO NE 的溶脹度，共價交聯(lián)作用能夠在冷凍干燥過程中保護PEO NE 的完整，從而能夠維持PEO NE 的完整性[36]。

圖4 PEO NE 的掃描電鏡圖Fig.4 SEM of PEO NE

2.5 傅里葉變換紅外光譜

傅立葉變換紅外光譜法（FT-IR）是確定納米載體結構中各組分之間相互作用的一種很好的技術，可以分析關于有機和無機成分分子結構的基本信息，并提供從高空間分辨率（一般為10 μm）的生物樣品中收集化學信息的獨特可能性[37]。采用FT-IR 對冷凍干燥過的PEO NE 的化學結構進行了分析。如圖5所示，PEO NE 與CTS 在3007、2923、2879、2856、1745、1708、1462 和1404 cm-1處出現(xiàn)不同的峰值。3000～3400 cm-1范圍內的典型峰被認為是氫鍵，氫鍵和疏水力都有助于大分子結構的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，氫鍵附近疏水殘基的存在通過形成脫水環(huán)境提高了后者的穩(wěn)定性，從而保護蛋白質或多肽免受水侵蝕。3007 cm-1處的寬而強的譜帶可以歸因于廣藿香醇單體之間通過O-H 鍵的分子間相互作用而產生的O-H 鍵的伸縮振動模式。不同的樣品在2800～3000 cm-1范圍內有多個峰，這可能是由于-CH3基團在不同位置的拉伸振動模式引起的[38]。2923、2879和2856 cm-1處的譜帶與PEO 單體之間的C-H 伸縮振動有關。蛋白質二級結構主要特征是酰胺I 帶，1600～1640 cm-1處的條帶歸屬于β-折疊，1640～1650 cm-1處的條帶對應于隨機結構，1650～1660 cm-1處的條帶表示α-螺旋結構，1660～1700 cm-1處的條帶表示β-轉角。1745 cm-1和1708 cm-1處的條帶分別歸因于PEO 中δ-愈創(chuàng)木烯的不對稱和對稱振動。1462 cm-1和1404 cm-1處出現(xiàn)了指定的峰，可能跟PEO NE 過程中添加的焦磷酸硫胺素有關[39]。

圖5 傅里葉變換紅外光譜圖Fig.5 Fourier transform infrared spectrogram

2.6 X 射線衍射

圖6 顯示了CTS（A）的晶體結構、PEO NE（B）的晶體結構。CTS 的衍射光譜顯示在20°的2θ處有一個尖峰，而PEO NE 的衍射圖中峰值較小，這可能是由于其無定形，其結晶度較高[40]。并且乳化過程中TPP 的交聯(lián)反應破壞了CTS 的晶體結構，這表明PEO 的加入可能導致CTS TPP 復合物結構的改變，從而導致PEO NE 的峰值較小。

圖6 X 射線衍射圖Fig.6 X-ray diffraction pattern

2.7 DPPH 和ABTS 抗氧化性實驗

本研究通過DPPH 和ABTS 法對PEO NE 的抗氧化活性進行測定，其結果如圖7 所示。DPPH和ABTS 實驗結果均表明，與純濃度的PEO 相比，PEO NE 具有更強的抗氧化能力，DPPH 自由基清除率達到69.64%，ABTS+自由基的清除能力可達到66.53%，PEO NE 的自由基清除能力得到增強，表明PEO 經過乳化作用，具有較好的抗氧化能力。NE對PEO 的保護作用更強，抗氧化性能更好。這是由于PEO 中強抗氧化組分百里香酚的成功負載。PEO強大的抗氧化活性歸因于百里香酚結構中存在大量的酚基，其被認為是酚類物質抗氧化功能的活性位點[41]。已有研究報道酚基在姜黃素的抗氧化活性中起主要作用[42]。

圖7 PEO、CTS、PEO NE 的抗氧化能力Fig.7 Antioxidant capacity of PEO, CTS, PEO NE

2.8 抑菌性能

在抑菌實驗中，選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為本實驗的實驗菌種，在不同的時間段分別檢測PEO NE 的抑菌性。如圖8 所示，在 7 d 內 PEO 對金黃色葡萄球菌的抑菌圈變化范圍是11.9～14.3 mm，PEO NE 對金黃色葡萄球菌的抑菌圈變化范圍是13.9～17.1 mm。在7 d 內PEO 對大腸桿菌的抑菌圈變化范圍是5.6～8 mm，PEO NE 對大腸桿菌的抑菌圈變化范圍是7.9～11 mm。由此可見，在相同含量的PEO 和PEO NE 以及其他外界因素一致的情況下，PEO NE 對2 種供試菌抑菌效果均比PEO 的抑菌效果好。這可能是因為NE 通過運輸活性物質，PEO NE 在水中的溶解性和穩(wěn)定性均明顯提升，增加了分散性，提高了比表面積，并且可以與細菌細胞膜相互作用導致細胞裂解[43]。而且研究結果還表明PEO NE 對金黃色葡萄球的抑制效果要好于大腸桿菌。

圖8 PEO NE 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的影響Fig.8 Impact of PEO nanoemulsion on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 結論

本文通過將PEO 制備成NE，對PEO NE 進行表征，還探究了PEO NE 的穩(wěn)定性和抑菌性等性能。熒光顯微鏡和掃描電鏡結果顯示PEO NE 具有良好的穩(wěn)定性；傅里葉變換紅外光譜和X 射線衍射圖譜分析PEO NE 的具體化學鍵變化。通過測定PEO NE 的 DPPH 和 ABTS 抗氧化活性，表明 PEO NE 具有良好的抗氧化穩(wěn)定性；抑菌實驗表明PEO NE 對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有良好的抑制效果。PEO NE 對革蘭氏陽性菌的敏感性大于其他種類的菌株，可在后續(xù)深入研究NE 對革蘭氏陽性菌的作用機制。NE 作為一種極具前景的抗菌劑，可以提高營養(yǎng)物質的貯藏期和生物利用度，改善生物活性化合物的遞送，可進一步開發(fā)在食品保鮮等方面中的應用。