徐杏敏，鄭遠(yuǎn)榮，劉振民,*，孫 嘉，賈向飛

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436）

隨著國人生活水平的提升和西方飲食文化的融入，我國霉菌奶酪市場有逐漸增長的趨勢。發(fā)酵菌株的選擇對奶酪品質(zhì)的影響至關(guān)重要，目前用于奶酪成熟的霉菌主要是青霉和白霉，但此類產(chǎn)品并不完全符合國人口味。青霉奶酪通常蛋白水解及脂肪分解的程度較高，產(chǎn)品含鹽量高且入口刺激辛辣[1]。白霉奶酪是表面覆蓋白色真菌的軟質(zhì)奶酪，常見的有布里奶酪、卡蒙貝爾奶酪，奶味濃郁，但是帶有一定霉味、菌菇味，與中國傳統(tǒng)飲食的口味存在一定差異。因此，有必要嘗試使用其他種類的霉菌進(jìn)行奶酪制作，以研制更加適合國人口味的霉菌奶酪。我國擁有許多歷史悠久的可食用菌株，紅曲霉便是其中一種，常用于大米、豆腐等食品的加工，已被長期食用，具有一定食用安全性，所以具備加工奶酪的潛力。此外，紅曲霉還可以產(chǎn)生紅曲色素、γ-氨基丁酸、莫納可林K 及其他生物活性化合物，有望用于生物功能乳制品的開發(fā)。迄今為止，已有研究者成功將紅曲霉用于加工霉菌成熟奶酪，開發(fā)了紅曲霉類卡蒙貝爾干酪[2]、紅紋奶酪[3]，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化加工工藝，開發(fā)出軟質(zhì)[4]、半軟質(zhì)、硬質(zhì)等不同質(zhì)地的紅曲霉奶酪。紅曲霉奶酪是一款新型霉菌成熟奶酪，其滋、氣味較國外部分霉菌成熟奶酪（例如：藍(lán)紋奶酪）更加溫和，具有實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的潛力。雖然研究人員對紅曲霉奶酪開展了一系列的研究，包括對奶酪成熟期間理化性質(zhì)、蛋白水解、揮發(fā)性及非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及變化等[5-7]。然而，目前暫無對紅曲霉奶酪特征代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究報道。隨著紅曲霉奶酪產(chǎn)業(yè)化的推進(jìn)，急需研究紅曲霉奶酪這一品類的代謝產(chǎn)物特征，探究紅曲霉奶酪與其他霉菌成熟干酪的具體差異，分析差異代謝通路，為后續(xù)產(chǎn)品的改進(jìn)及有益代謝產(chǎn)物的富集提供理論依據(jù)。

紅曲霉菌株BC20 與ZX-99 是本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)選出的兩株可用于制作霉菌干酪的優(yōu)良菌株，利用它們制作的奶酪具有良好的風(fēng)味，且奶酪中桔霉素含量低于國標(biāo)檢測限（25 μg/kg）[8]，食用安全。此外，青霉奶酪和白霉奶酪是最具代表性的霉菌成熟奶酪。因此，本研究以紅曲霉奶酪BC20、紅曲霉奶酪ZX-99 為實(shí)驗(yàn)樣品，以接受度較高的一款市售青霉奶酪（藍(lán)紋奶酪）、一款市售白霉奶酪（布里奶酪）作為對照樣品。通過非靶向代謝組學(xué)的方法來表征4 款奶酪中的低分子量代謝產(chǎn)物，通過差異分析初步推斷出屬于紅曲霉奶酪的代謝產(chǎn)物特征，并分析紅曲霉奶酪的特征差異代謝通路，為之后定義紅曲霉奶酪以及紅曲霉奶酪的風(fēng)味調(diào)控、有益代謝產(chǎn)物富集提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生牛乳、稀奶油 光明乳業(yè)股份有限公司；商業(yè)發(fā)酵劑FLORA、STI-13 科漢森（中國）有限公司；凝乳酶（酶活力：890 IMCU/g） 北京多愛特生物科技有限公司；紅曲霉菌株BC20、ZX-99 乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；琪雷薩藍(lán)紋奶酪（生產(chǎn)日期：2021 年11 月16 日） 丹麥阿爾樂公司；法蘭希布里奶酪（生產(chǎn)日期：2021 年8 月26 日） 西諾迪斯食品（上海）有限公司；乙腈 美國Merck 公司；乙酸銨美國Sigma 公司；甲醇、氨水 美國Fisher 公司。

1300 系列A2 型生物安全柜 美國Thermo Scientific 公司；PRACTUM124-1CN 電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HVE-50 高壓蒸汽滅菌鍋日本HIRAYAMA 公司；奶酪槽 英國Armfiled公司；HPP 110 奶酪成熟箱 德國MEMMERT 公司；QT-1 Votex 振蕩器 上海琪特分析儀器有限公司；JY92-II 超聲破碎儀、SCIENTZ-1LS 離心濃縮儀寧波新芝生物科技股份有限公司；5430R 低溫高速離心機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；Vanquish LC 超高效液相色譜系統(tǒng)、Q Exactive 系列Orbitrap Exploris 480 質(zhì)譜儀 美國Thermo 公司；ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜（柱1.7 μm，2.1 mm×100 mm column） 美國Waters 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 奶酪的制作 根據(jù)徐杏敏等[9]方法，使用菌株BC20 與ZX-99 進(jìn)行紅曲霉奶酪的制備與取樣。工藝流程：原料乳標(biāo)準(zhǔn)化→殺菌并冷卻→添加商業(yè)發(fā)酵劑→添加凝乳酶→凝乳后切割→裝模成型→鹽水腌漬→晾干→涂抹紅曲霉發(fā)酵液→成熟。取樣方式：整塊奶酪表皮與內(nèi)部混合均勻后取樣。

1.2.2 樣品前處理 奶酪樣品在4 ℃環(huán)境下緩慢解凍后，取適量樣本加入預(yù)冷甲醇/乙腈/水溶液（2:2:1，v/v/v），渦旋混合，4 ℃、40 kHz 超聲20 min，-20 ℃靜置10 min，14000×g 4 ℃離心20 min，取上清真空干燥（2000 r/min，15 ℃，真空度小于50 Pa），質(zhì)譜分析時加入100 μL 乙腈水溶液（乙腈:水=1:1，v/v）復(fù)溶，渦旋，14000×g 4 ℃離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.2.3 色譜條件 參考ZHANG 等[10]方法，采用超高效液相色譜系統(tǒng)（UHPLC）HILIC 色譜柱將奶酪樣品進(jìn)行分離，柱溫25 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，流動相A 為水+25 mmol/L 乙酸銨+25 mmol/L氨水，流動相B 為乙腈。梯度洗脫程序：0～1.5 min，98% B；1.5～12 min，B 從98%線性變化至2%；12～14 min，2% B；14～14.1 min，B 從2%線性變化至98%；14.1～17 min，98% B；進(jìn)樣器溫度4 ℃。

1.2.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離（Electron spray ionization，ESI）正離子和負(fù)離子模式對樣品進(jìn)行檢測。ESI 源及質(zhì)譜設(shè)置參數(shù)如下：霧化氣輔助加熱氣1（Gas1）：60，輔助加熱氣2（Gas2）：60，氣簾氣（CUR）：30 psi，離子源溫度：600 ℃，噴霧電壓（ISVF）±5500 V（正負(fù)兩種模式）；一級質(zhì)荷比檢測范圍：80～1200 Da，分辨率：60000，掃描累積時間：100 ms，二級采用分段式采集方法，掃描范圍是70～1200 Da，二級分辨率：30000，掃描累積時間：50 ms，動態(tài)排除時間：4 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用XCMS 軟件分析由UHPLC-Q-Exactive/MS得到的原始數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)的完整性進(jìn)行檢查，去除組內(nèi)缺失值超過50%的代謝物，不參與后續(xù)分析，刪除極值，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行總峰面積歸一化，以確保各樣本間和代謝物間可平行性比較。SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行多維統(tǒng)計分析（數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling 預(yù)處理），SPSS 26.0 進(jìn)行t檢驗(yàn)顯著分析，火山圖及熱圖由生信平臺（https://bio-cloud.aptbiotech.com/）繪制，火山圖在中標(biāo)記的散點(diǎn)由Inkscape 軟件進(jìn)行標(biāo)注。單維統(tǒng)計分析及其余數(shù)據(jù)由EXCEL 處理。根據(jù) OPLSDA 模型獲得的變量權(quán)重值（Variable importance for the projection，VIP），將P<0.05，VIP>1，差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）>2 或<0.5 的代謝物定義為顯著差異代謝物。每種樣品重復(fù)檢測6 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同霉菌奶酪的代謝表型分析

為研究紅曲霉奶酪與其他霉菌成熟奶酪（青霉奶酪、白霉奶酪）不同的特征代謝產(chǎn)物，利用UHPLCQ-Exactive/MS 對兩款不同紅曲霉菌株所制備的紅曲霉奶酪、一款市售青霉奶酪、一款市售白霉奶酪的可溶性化合物成分及相對含量進(jìn)行分析鑒定。在正離子模式（Positive ion mode，POS）與負(fù)離子模式（Negative ion mode，NEG）下，檢測到16841 個四款奶酪樣品中共有的代謝物離子特征，其中正離子模式下鑒定到1411 個代謝物、負(fù)離子模式下鑒定到1099 個代謝物。將鑒定到的所有代謝物根據(jù)其化學(xué)分類歸屬信息進(jìn)行分類統(tǒng)計，各類代謝物數(shù)量所占比例如圖1 所示。

圖1 合并正負(fù)離子鑒定到的代謝物在各化學(xué)分類的數(shù)量占比Fig.1 Proportion of metabolites identified by combining positive and negative ions in each chemical classification

其中，占比前3 類物質(zhì)分別是有機(jī)酸及其衍生物（Organic acids and derivatives），脂質(zhì)和類脂分子（Lipids and lipid-like molecules），有機(jī)雜環(huán)化合物（Organoheterocyclic compounds），共計占比65.703%。有機(jī)酸類物質(zhì)廣泛存在于果蔬類食物中，主要提供果味、酸味，同時是一類安全的抗血栓因子，對防治心腦血管疾病具一定積極作用[11]，能夠提高奶酪的風(fēng)味并賦予其益生功能。脂類物質(zhì)對奶酪的風(fēng)味及保存具有重要影響，不同霉菌對脂肪的分解情況不同，降解產(chǎn)物脂肪酸的差異直接影響奶酪的風(fēng)味及營養(yǎng)價值[12]。有機(jī)雜環(huán)化合物在香料界的認(rèn)可度較高，大多數(shù)具有特征香氣且閾值極低，奶酪中此類物質(zhì)的差異可能是造成風(fēng)味差異的關(guān)鍵[13]。有機(jī)硫化合物（Organosulfur compounds）雖然僅占0.289%，但由于氣味刺激特殊，其在奶酪中的含量與種類對奶酪風(fēng)味的影響較大。

將檢測到的16841 個共有代謝物離子作為因變量，4 款奶酪作為自變量，于SIMCA 14.1 進(jìn)行OPLSDA 分析，如圖2 所示，不同字母組及顏色的散點(diǎn)代表不同的奶酪樣本，可以觀察到4 種奶酪樣品之間存在顯著的分離趨勢，可以實(shí)現(xiàn)4 款奶酪的有效區(qū)分。本次分析中，自變量擬合指數(shù)PosR2x 為0.762、NegR2x 為0.823，因變量擬合指數(shù)PosR2y 為0.659、NegR2y 為0.661，模型預(yù)測指數(shù)PosQ2為0.643、NegQ2為0.645，R2與Q2>0.5，證明模型穩(wěn)定可靠。為避免模型發(fā)生過擬合，經(jīng)過200 次置換檢驗(yàn)對模型進(jìn)行檢驗(yàn)以確保模型的有效性。如圖3 所示，Q2截距小于零，說明模型不存在過擬合，穩(wěn)健性良好。這些結(jié)果表明，OPLS-DA 清楚地區(qū)分了不同的奶酪樣本，且組內(nèi)平行樣品無明顯偏差。

圖2 OPLS-DA 得分圖Fig.2 OPLS-DA scores plots

圖3 OPLS-DA 置換檢驗(yàn)圖Fig.3 OPLS-DA permutation test plots

2.2 紅曲霉奶酪的代謝產(chǎn)物特征分析

為分析紅曲霉奶酪與其他霉菌成熟奶酪（青霉奶酪、白霉奶酪）相比所具備的代謝產(chǎn)物特征，通過紅曲霉奶酪BC20 分別與青霉奶酪、白霉奶酪，紅曲霉奶酪ZX-99 分別與青霉奶酪、白霉奶酪這4 個比較組的差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）、顯著性水平（Pvalue，P）對鑒定到的2510 個代謝物進(jìn)行篩選。各組正、負(fù)離子模式下的火山圖，如圖4 所示，紅色散點(diǎn)對應(yīng)的物質(zhì)在紅曲霉奶酪中顯著上調(diào)，藍(lán)色散點(diǎn)對應(yīng)的物質(zhì)在紅曲霉奶酪中顯著下調(diào)，黑色散點(diǎn)對應(yīng)的物質(zhì)在紅曲霉奶酪與其他霉菌奶酪中差異不顯著或差異倍數(shù)在0.5～2 之間，直觀地展示了紅曲霉奶酪較其他兩款霉菌奶酪代謝物質(zhì)顯著變化的情況，并對有定性名稱且變量權(quán)重值（Variable importance for the projection，VIP）>1 的顯著性差異代謝物，選擇表達(dá)變化上調(diào)的TOP5 和下調(diào)的TOP5 進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記物質(zhì)的詳細(xì)信息見表1、表2。

表1 紅曲霉奶酪中差異代謝物上調(diào)信息Table 1 The information of differential metabolites up-regulated in Monascus cheese

圖4 不同奶酪比較組的火山圖Fig.4 Volcano map of different cheese comparison groups

結(jié)合火山圖與表1、表2 可知，紅曲霉奶酪BC20、紅曲霉奶酪ZX-99 分別與青霉奶酪、白霉奶酪的4 個比較組中，代謝物質(zhì)上調(diào)及下調(diào)的情況差異較大，這說明實(shí)驗(yàn)組所選擇的兩款紅曲霉奶酪各具特色，后續(xù)對于兩款紅曲霉奶酪各自特色的代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選后，保留下的共同富集代謝產(chǎn)物對于紅曲霉奶酪這一品類的初步描述具有較高的準(zhǔn)確性。同時，也說明青霉奶酪與白霉奶酪之間的代謝物存在較大差異，對照組的選擇對于目標(biāo)物的篩選具有較好的排除干擾作用。

由 VIPAC、AD、BC、BD>1、FCAC、AD、BC、BD<0.5 或>2、PAC、AD、BC、BD<0.05 對鑒定到的2510 個代謝物進(jìn)行篩選，得到130 個POS、79 個NEG 代謝物，此為兩款紅曲霉奶酪與青霉奶酪、白霉奶酪相比所共有的顯著差異代謝產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上，對篩選所得物質(zhì)進(jìn)行二次篩選，篩選條件為：FCAC、AD、BC、BD>2，VIPAB≤1，PAB≥0.05，得到 16 個 POS、7 個 NEG 代謝物，此為兩款紅曲霉奶酪與青霉奶酪、白霉奶酪相比所共有的顯著富集代謝產(chǎn)物（且這23 個代謝物在兩款紅曲霉奶酪間沒有顯著差異），可初步判斷紅曲霉奶酪這一品類代謝產(chǎn)物的共同特征，物質(zhì)信息如表3 所示。

對表3 中的物質(zhì)進(jìn)行信息檢索，發(fā)現(xiàn)有8 個物質(zhì)具有一定有益生物活性或藥理活性。其中，4 個物質(zhì)具有抗菌活性，分別是夫西地酸[14]、甘草皂苷h2[15]、苔黑酚[16]以及25-去乙酰基利福噴丁[17]；2 個物質(zhì)具有抗炎活性，分別是葫蘆素e[18]、甘草皂苷h2[15]；2 個物質(zhì)具有抗氧化活性，分別是葫蘆素e[18]、苔黑酚[19]；2 個物質(zhì)具有抗瘤防癌活性，分別是葫蘆素e[20,21]、苔黑酚[22]；3 個物質(zhì)對心血管疾病的治療有一定幫助，分別是喹那普利[23]、甲基多巴[24]以及甘草皂苷h2[15]；1 個物質(zhì)對良性前列腺增生及下尿路癥狀有治療作用，為阿夫唑嗪[25]?？咕翱寡趸镔|(zhì)的富集對于食品的保存具有較大積極作用，抗炎、抗瘤防癌及緩解心血管疾病物質(zhì)的富集將給食用者帶來一定益生效果。

諸多研究表明，紅曲霉的代謝產(chǎn)物紅曲色素具有抗菌、抗氧化、降血壓的作用[26-27]，但其具體活性物質(zhì)仍未明確，該研究發(fā)現(xiàn)的夫西地酸、甘草皂苷h2、苔黑酚、25-去乙?；姸?、葫蘆素e、喹那普利、甲基多巴可能是紅曲色素呈現(xiàn)相應(yīng)活性的關(guān)鍵。此外，一些紅曲霉發(fā)酵制品（紅曲米、紅曲醋、紅曲薯蕷等）被報道具有抗炎、抗癌、降血糖、降膽固醇的作用[28-29]，該研究發(fā)現(xiàn)的葫蘆素e、甘草皂苷h2、苔黑酚可能是其他紅曲霉發(fā)酵制品呈現(xiàn)相應(yīng)活性的關(guān)鍵。目前，尚未有研究發(fā)現(xiàn)青霉奶酪和白霉奶酪具有緩解心血管疾病方面的益生效果，若具有該類益生功效的物質(zhì)在紅曲霉奶酪中達(dá)到起效濃度，則緩解心血管疾病是紅曲霉奶酪較青霉奶酪、白霉奶酪所獨(dú)有的益生功能。

除了以上這些具有功能性的有益代謝產(chǎn)物，短肽由于具有更易被人體吸收代謝的優(yōu)勢也受到多方面的關(guān)注，而對于表3 所涉及的短肽“酪氨酸-亮氨酸-賴氨酸”，暫無關(guān)于生物活性和對風(fēng)味影響方面的報道。吡嗪類物質(zhì)通常具有成熟豆豉的風(fēng)味[30]，而表3 中該類物質(zhì)的具體風(fēng)味暫無研究表明，這可能是區(qū)分紅曲霉奶酪與其他霉菌奶酪風(fēng)味差異的關(guān)鍵之一。更多紅曲霉奶酪共同顯著富集代謝產(chǎn)物的具體生物功能或風(fēng)味特征還有待深入研究。

2.3 KEGG 代謝途徑分析

通過紅曲霉奶酪與其他霉菌奶酪差異代謝途徑的分析，可更好地了解紅曲霉對成熟奶酪?guī)淼挠绊?。圖5 展示了不同比較組中顯著性較高且上調(diào)的前20 條差異代謝通路，共有的顯著差異代謝通路有10 條，分別為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)（ABC transporters），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（Alanine, aspartate and glutamate metabolism） ， 氨酰-tRNA 生物合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis），氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids），γ-氨基丁酸能突觸（GABAergic synapse），甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝（Glycine, serine and threonine metabolism），礦物質(zhì)吸收（Mineral absorption），mTOR 信號通路（mTOR signaling pathway），蛋白質(zhì)消化和吸收（Protein digestion and absorption），纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成（Valine, leucine and isoleucine biosynthesis）。

其中，在紅曲霉奶酪BC20 vs 青霉奶酪、紅曲霉奶酪BC20 vs 白霉奶酪、紅曲霉奶酪ZX-99 vs 青霉奶酪這3 個比較組中，蛋白質(zhì)消化和吸收通路的富集程度顯著高于其他通路；在紅曲霉奶酪ZX-99 vs 白霉奶酪比較組中，蛋白質(zhì)消化和吸收通路的富集程度顯著低于ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路并高于其他通路。與蛋白質(zhì)消化和吸收通路相關(guān)的代謝物有異戊酸，DL-色氨酸，賴氨酸，吲哚，丙酸，DL-酪氨酸等。以上舉例的6 個代謝物同時為2.2 中分析所得的顯著差異代謝產(chǎn)物，其中異戊酸的物質(zhì)含量在兩款紅曲霉奶酪中顯著減少，丙酸與DL-酪氨酸的物質(zhì)含量在兩款紅曲霉奶酪中顯著增加。

在10 條紅曲霉奶酪共有差異代謝通路中，與氨基酸相關(guān)的通路占比較大，所涉及的共同差異代謝產(chǎn)物有高三尖杉酯堿，2-異丙基蘋果酸，肌酸，DL-色氨酸，DL-酪氨酸，L-蘇氨酸，賴氨酸，丙酮酸，琥珀酸，酮亮氨酸，甜菜堿等。以上舉例的11 個代謝物同時為2.2 中分析所得的顯著差異代謝產(chǎn)物，其中丙酮酸、酮亮氨酸、甜菜堿的物質(zhì)含量在兩款紅曲霉奶酪中顯著減少，高三尖杉酯堿、2-異丙基蘋果酸、肌酸、DL-酪氨酸、琥珀酸的物質(zhì)含量在兩款紅曲霉奶酪中顯著增加。

異戊酸具有刺激性和酸敗的味道，在濃度極低時則呈現(xiàn)出甜潤的果香，丙酮酸具有酸味和醋酸氣味，這兩個物質(zhì)在兩款紅曲霉奶酪中的含量相對較小，可能是紅曲霉奶酪較青霉奶酪、白霉奶酪口味更加溫和的原因之一。甜菜堿有甜味，可為奶酪增添風(fēng)味，同時具備抗炎、抗氧化等活性，可為奶酪?guī)硪欢ㄒ嫔Ч鸞31]，但其含量在兩款紅曲霉奶酪中相對較小，后續(xù)可嘗試通過代謝的定向調(diào)控來富集此類物質(zhì)。丙酸對食品具有防腐保鮮的作用，但具有一定刺激性氣味，后續(xù)可對紅曲霉奶酪中的丙酸進(jìn)行定量，研究其在奶酪中適宜的濃度范圍。琥珀酸具有酸味，閾值為0.039%，有研究表明其對紅腐乳的風(fēng)味特征起重要作用[32]，故琥珀酸可能是紅曲霉發(fā)酵制品的共有特征物質(zhì)。

通過KEGG 代謝途徑富集分析，由蛋白質(zhì)消化和吸收通路的富集程度及共有差異代謝通路中氨基酸相關(guān)通路的占比可知，蛋白質(zhì)和氨基酸這兩部分對于紅曲霉奶酪具有較大的生物學(xué)重要性，后續(xù)研究可重點(diǎn)關(guān)注相關(guān)部分所涉及的節(jié)點(diǎn)物質(zhì)，可能是定向調(diào)控的關(guān)鍵。

對于紅曲霉的功能性代謝產(chǎn)物，較為熟知的有具有降脂功效的莫納克林K[33]、可降壓凝神的γ-氨基丁酸[34]以及可作為著色劑或提供抗菌性的紅曲色素[26]。除此之外，在KEGG 代謝途徑所涉及的產(chǎn)物中又發(fā)現(xiàn)了一些新的顯著富集功能性代謝產(chǎn)物，例如高三尖杉酯堿、2-異丙基蘋果酸、肌酸。高三尖杉酯堿（Homoharringtonine，HHT）是一種可從三尖杉屬植物中提取獲得的生物堿，被廣泛應(yīng)用于血液病的治療，且具有一定抗腫瘤活性[35-37]，其物質(zhì)含量在紅曲霉奶酪BC20 中最高，是青霉奶酪中的55 倍、白霉奶酪中的63 倍。2-異丙基蘋果酸（2-Isopropylmalic acid，2-IPMA）具有溫和的抗菌及抗氧化活性且無細(xì)胞毒性，適宜應(yīng)用于食品防腐劑[38]，其物質(zhì)含量在紅曲霉奶酪BC20 中最高，是青霉奶酪中的84 倍、白霉奶酪中的193 倍。肌酸（Creatine，Cr）主要存在于動物源食物中，是一種功能性膳食補(bǔ)充劑，具有改善機(jī)體能量代謝、促進(jìn)肌細(xì)胞發(fā)育、抗氧化等生物學(xué)功能[39-40]，在紅曲霉奶酪中的物質(zhì)含量是其他兩款奶酪的2～4 倍。通過代謝途徑與代謝產(chǎn)物的結(jié)合，有望通過定向代謝調(diào)控，進(jìn)行紅曲霉生物功能乳制品的研發(fā)，使產(chǎn)品更具益生功能。

3 結(jié)論

兩款紅曲霉奶酪、一款青霉奶酪、一款白霉奶酪之間的差異代謝產(chǎn)物中共鑒定出2510 種代謝物，有23 個代謝物在紅曲霉奶酪BC20 與紅曲霉奶酪ZX-99 中共同富集且在紅曲霉奶酪組間無顯著差異，初步判斷這些物質(zhì)為紅曲霉奶酪代謝產(chǎn)物的特征。同時，有研究表明這23 個代謝物中，有8 個物質(zhì)具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗瘤防癌、緩解心血管疾病等生物或藥理活性，分別是夫西地酸、甘草皂苷h2、阿夫唑嗪、苔黑酚、25-去乙?；姸　⒑J素e、喹那普利、甲基多巴，為紅曲霉奶酪?guī)砹艘欢ㄒ嫔δ堋Ｍㄟ^KEGG 代謝通路分析，確定了10 條差異代謝通路，包括ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)消化和吸收、氨基酸類代謝通路等。一些與這些代謝途徑相關(guān)的特征代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等功效，例如高三尖杉酯堿、2-異丙基蘋果酸、肌酸，對于生物功能乳制品的開發(fā)極具參考價值。

目前通過代謝組學(xué)系統(tǒng)全面的表征了紅曲霉奶酪與其他霉菌成熟奶酪在代謝產(chǎn)物方面的差異，為紅曲霉奶酪的定義、目標(biāo)代謝方向的調(diào)控以及有益代謝物質(zhì)的富集提供了一定依據(jù)。但由于非靶向代謝組學(xué)在檢測過程中并未對代謝產(chǎn)物定量，故暫不明確紅曲霉奶酪中富集的有益物質(zhì)是否達(dá)到起效濃度，后續(xù)可研究該類物質(zhì)在紅曲霉奶酪中的具體含量以及經(jīng)消化后對人體的影響。在分析過程中，部分代謝物質(zhì)的具體功能暫無相關(guān)文獻(xiàn)表明，后續(xù)可嘗試研究其具體功能及調(diào)控方法。目前，由于同時具備食用安全性、奶酪成熟能力以及風(fēng)味優(yōu)勢的紅曲霉菌株較為稀缺，故該研究只選用了兩株紅曲霉所制成的奶酪進(jìn)行分析。但是，紅曲霉菌株的種類非常豐富，不同紅曲霉菌株之間存在一定差異。因此，后續(xù)可尋找更多適宜用于奶酪成熟的風(fēng)味優(yōu)勢紅曲霉菌株，并對更多紅曲霉奶酪的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，以便更全面、準(zhǔn)確地認(rèn)識其代謝產(chǎn)物特征。