黃晶晶，周迎芹，程秀峰，羅 章，劉振東，謝寧寧,*

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽合肥 230001；2.安徽省食品微生物發(fā)酵與功能應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230031；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000）

糖尿病已成為全球最嚴(yán)重和最常見(jiàn)的慢性疾病之一。2021 年，全球20～79 歲人群的糖尿病患病率約為10.5%（5.366 億人），支出約9660 億美元；2045 年預(yù)估患病率將達(dá)12.2%（7.832 億人），預(yù)估支出10540 億美元[1]。糖尿病的病因包括胰島素分泌缺乏、胰島素受體功能損壞，或兩者兼有?？煞譃樗姆N類型：類型Ⅰ、類型Ⅱ、其他類型、妊娠糖尿病，其中Ⅰ型和Ⅱ型最常見(jiàn)。其并發(fā)癥包括心血管疾病和癌癥等[2]。糖尿病尚無(wú)法治愈，治療方法包括口服降糖藥、注射胰島素、胰島移植等。藥物治療的成本較高，低收入人群難以負(fù)擔(dān)，且長(zhǎng)期服藥可能導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞功能衰退等副作用，亟需新型的預(yù)防、干預(yù)、調(diào)控和治療手段。

生物活性肽是蛋白質(zhì)水解后釋放的2～20 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的片段，可與人體代謝的某些酶和細(xì)胞受體相互作用[3]，具有分子量低、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，安全性、耐受性、選擇性和效力高，代謝途徑可預(yù)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。其中，血糖調(diào)節(jié)活性肽在維持血糖水平等生理穩(wěn)態(tài)方面具有營(yíng)養(yǎng)和藥用潛力，可干預(yù)初期高血糖，從而預(yù)防糖尿病[6]。其結(jié)構(gòu)特征與生物活性之間的量變規(guī)律具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。分子對(duì)接、定量構(gòu)效關(guān)系模型等生物信息學(xué)手段，已被用于篩選和設(shè)計(jì)食源性血糖調(diào)節(jié)活性肽序列，并預(yù)測(cè)其活性[7]。本文整理歸納了近5 年發(fā)表的多篇論文，綜述了食源性血糖活性肽的研究和應(yīng)用進(jìn)展，探討多種小肽的血糖調(diào)節(jié)機(jī)制及其構(gòu)效關(guān)系，分析產(chǎn)業(yè)化推廣的挑戰(zhàn)性，以期探索血糖調(diào)節(jié)產(chǎn)品的新研發(fā)趨勢(shì)。

1 肽的血糖調(diào)節(jié)機(jī)制、食物來(lái)源與結(jié)構(gòu)特征

1.1 調(diào)節(jié)機(jī)制

活性肽的血糖調(diào)節(jié)機(jī)制較為多樣，目前主要有如下幾類：a.通過(guò)抑制糖酶（α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶）的活性，抑制胰島淀粉樣多肽的纖維化聚集，或作為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)抑制劑、胰島素模擬物等，如圖1 所示。肽可以通過(guò)氫鍵、極性和疏水性作用與酶活性位點(diǎn)和/或催化位點(diǎn)的氨基酸結(jié)合，阻止酶與底物相互作用。α-淀粉酶由胰腺和唾液腺分泌，水解淀粉等多糖中的α-D-（1-4）糖苷鍵，產(chǎn)生低聚糖。隨后低聚糖被α-葡萄糖苷酶水解成單糖，消化吸收后造成血糖升高。b.腸促胰島素分為胰高血糖素樣肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）和胃抑制肽（gastric inhibitory peptide，GIP），二者誘導(dǎo)約70%的餐后胰島素分泌[8]。GLP-1 可通過(guò)飲食達(dá)到降糖效果，應(yīng)用前景良好。目前GLP-1 受體激動(dòng)劑或類似物的研究主要包括：修飾天然GLP-1、制備長(zhǎng)效緩釋制劑、植入式滲透泵、口服等非注射制劑[9]，但未見(jiàn)公開(kāi)的高純度GLP-1 促進(jìn)肽。c.二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）會(huì)裂解腸促胰島素，降低其水平，升高血糖。DPP-IV 抑制劑與其他藥物相比，副作用較小。已在細(xì)胞水平證實(shí)燕麥球蛋白源肽LQAFEPLR[10]、鰱魚(yú)鰾蛋白源肽WGDEHIP GSPYH 及其水解物IPGSPY 具有良好的DPP-IV抑制活性[11]。小鼠模型證實(shí)了黑茶蛋白源肽AGFAGDDAPR 有效抑制了DPP-IV 并改善胰腺β細(xì)胞功能[12]。d.葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白分為鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium-dependent glucose transporters，SGLT）和非鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（glucose transporter，GLUT），分別有6 種和5 種亞型。活性肽通過(guò)促進(jìn)GLUT 異位和減少SGLT 表達(dá)可發(fā)揮降糖活性，與胰島素?zé)o關(guān)?，F(xiàn)有研究集中在改善GLUT-4 的易位障礙，提高其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜的數(shù)量。已在動(dòng)物模型中驗(yàn)證[13]，尚未進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

圖1 生物活性肽緩解Ⅱ型糖尿病的機(jī)制示意圖[6]Fig.1 Schematics of strategies for mitigating the pathogenesis of type Ⅱ diabetes mellitus by bioactive peptides[6]

1.2 血糖調(diào)節(jié)活性肽的食物來(lái)源與結(jié)構(gòu)特征

蛋白質(zhì)在自然狀態(tài)下結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無(wú)法與其他分子結(jié)合，水解暴露了不同的氨基酸殘基，形成了肽鏈的不同性質(zhì)。肽的分子量和氨基酸序列會(huì)影響其性質(zhì)，可能與殘基的疏水性或官能團(tuán)有關(guān)。而肽的蛋白質(zhì)來(lái)源需要在評(píng)估活性的同時(shí)考慮環(huán)境和經(jīng)濟(jì)因素，優(yōu)先選擇油粕、內(nèi)臟、皮膚等可持續(xù)的低值來(lái)源，提升經(jīng)濟(jì)附加值并減少污染。研究最多的植物來(lái)源是豆類和谷類，動(dòng)物來(lái)源是乳類和海洋魚(yú)類。表1 是近5 年報(bào)道的降糖活性肽序列及其來(lái)源，可見(jiàn)以下特征。

表1 近5 年（2017—2022 年）報(bào)道的食源性血糖調(diào)節(jié)活性肽的來(lái)源、序列與活性評(píng)價(jià)方式Table 1 Sources, sequences and activity evaluations of food derived antidiabetic peptides reported in recent 5 years (2017—2022)

1.2.1 DPP-IV 抑制肽的來(lái)源與結(jié)構(gòu)特征 DPP-IV抑制肽的蛋白來(lái)源很豐富，植物源包括海藻[14]、榛子粕[15]、燕麥球蛋白[10]、羽扇豆[16]和大豆[17]，動(dòng)物源有乳蛋白[18]、海洋魚(yú)類，馬乳[19]、南極磷蝦[20]、蛋清[21]等。其分子量大多低于500 Da[22]，結(jié)構(gòu)特征較為清晰：序列中疏水性氨基酸的含量、N 端氨基酸的疏水性與芳香環(huán)結(jié)構(gòu)是重要特征[22]，但并不僅限于此。肽鏈的N1 位或N2 位上存在脯氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸[23-24]，或者N1 位上存在異亮氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸[14]。C1 位脯氨酸，支鏈上的亮氨酸和異亮氨酸[25]都與活性有關(guān)。氨基酸組成上富含疏水性氨基酸（丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、色氨酸和纈氨酸），也可能出現(xiàn)親水性氨基酸（蘇氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、賴氨酸和精氨酸）[26]。表1 所示的序列特征為C 端的精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸，N 端的亮氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸。

1.2.2α-葡萄糖苷酶抑制肽的來(lái)源與結(jié)構(gòu)特征 目前已從多種來(lái)源中獲得α-葡萄糖苷酶抑制肽，包括大麻籽[27]、小麥胚芽[28]、辣木籽[29]、大豆[30-31]等。α-葡萄糖苷酶抑制活性的有無(wú)和大小由特征氨基酸及其序列位置決定，可能包括N 端的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、賴氨酸和精氨酸，C2 位的脯氨酸，以及C 端的甲硫氨酸或丙氨酸[25]。含有疏水性氨基酸[27]、必需氨基酸和支鏈氨基酸[27]的肽鏈，通過(guò)疏水等相互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制活性，尤其是亮氨酸和脯氨酸[27,30]。表1 顯示最主要的結(jié)構(gòu)特征是C 端的精氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸，N 端的亮氨酸、脯氨酸和甘氨酸。

1.2.3α-淀粉酶抑制肽的來(lái)源與結(jié)構(gòu)特征α-淀粉酶體外抑制活性肽的來(lái)源包括小茴香籽、孜然籽[32]、羅勒種子、斑豆[33-34]、多種乳類等。對(duì)其結(jié)構(gòu)特征的闡釋相對(duì)較少，側(cè)重以局部的氨基酸結(jié)構(gòu)描述，揭示特征氨基酸及其位點(diǎn)的可能作用[32]。需進(jìn)一步研究，以建立更成熟的表征模型。已知序列中通常含有亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸等疏水性氨基酸[34-35]，以及半胱氨酸、蛋氨酸、組氨酸和絲氨酸等親水性氨基酸[34]。例如N 端存在甘氨酸[33]、脯氨酸和亮氨酸[34]，C 端存在亮氨酸，以及兩端存在苯丙氨酸[33]。同時(shí)，有支鏈（賴氨酸、苯甲氨酸、酪氨酸和色氨酸）和陽(yáng)離子殘基的肽更易與α-淀粉酶結(jié)合[36]。表1 中α-淀粉酶抑制肽序列兩端都富含疏水性的脯氨酸和亮氨酸。

1.2.4 其他血糖調(diào)節(jié)活性肽的來(lái)源與結(jié)構(gòu)特征 同一條序列可能具有多種降糖活性。例如，黑茶[37]、胡桃楸種子[38]、駱駝乳[39]、西班牙干腌火腿[23,40]小肽具有兩種活性，而燕麥種子[35]、藜麥[41]、牛乳[42]、駱駝乳小肽等同時(shí)具有上述三種活性。在抑制DPPIV 活性的同時(shí)，苦瓜肽限制了SGLT-1、GLUT-2 表達(dá)[43]，鰱魚(yú)鰾源肽WGDEHIPGSPYH 及其水解物IPGSPY 促進(jìn)了胰島素分泌[11]，方鯛源肽增強(qiáng)了BRIN-BD11 細(xì)胞的胰島素分泌活性[44]。此外，小肽還可以改善胰島素抵抗[45]、調(diào)節(jié)葡萄糖攝取和/或肝糖原形成[46]、介導(dǎo) P13K/AKT、MAPK 通路提高胰島素敏感性[47]等。

2 食源性血糖調(diào)節(jié)活性肽的制備、活性評(píng)價(jià)與構(gòu)效關(guān)系

2.1 肽段釋放

生物活性肽常見(jiàn)的制備方法有酶水解、微生物發(fā)酵、化學(xué)水解、化學(xué)合成等。化學(xué)水解法副產(chǎn)物較多，可能有毒性[3]。酶解法選用來(lái)自微生物的食品級(jí)蛋白酶，特異性和安全性高，是目前的首選工藝。酶作用在肽鏈內(nèi)部/兩端，分別為內(nèi)/外肽酶。內(nèi)肽酶將蛋白分解成多肽，隨后經(jīng)外肽酶分解成更小的肽和游離氨基酸。酶解低值魚(yú)類制備活性肽已實(shí)現(xiàn)中試生產(chǎn)[84]。然而，酶解方法學(xué)仍受到經(jīng)驗(yàn)等多因素影響。可利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)質(zhì)量、響應(yīng)面法，針對(duì)每個(gè)底物/蛋白質(zhì)優(yōu)化關(guān)鍵參數(shù)（溫度、時(shí)間、pH、酶的活性和穩(wěn)定性、復(fù)合酶解順序等）[73]。發(fā)酵法的產(chǎn)量低，產(chǎn)品不穩(wěn)定，和酶法一樣會(huì)生成次級(jí)代謝產(chǎn)物等雜質(zhì)?；瘜W(xué)合成法是定向合成已知的氨基酸序列，操作復(fù)雜，成本高，安全性存疑，主要用于藥物研發(fā)和機(jī)制探究。對(duì)于食源性肽基物質(zhì)來(lái)說(shuō)，酶-菌耦合技術(shù)工具[85]、非熱輔助預(yù)處理（高壓、超聲波、微波、脈沖電場(chǎng)等）和亞臨界水解[86]等新技術(shù)也可以提高酶解效率。

2.2 分離純化

水解產(chǎn)物是不同大小肽段、副產(chǎn)物和殘留試劑的混合物，可能會(huì)互相拮抗，必須進(jìn)行純化濃縮。純化是基于肽序列和分子的物理化學(xué)性質(zhì)（分子量、極性或電荷）進(jìn)行分離，應(yīng)用最廣泛的有超濾、色譜和透析。超濾以膜過(guò)濾為基礎(chǔ)，同時(shí)完成分離和濃縮。通過(guò)選擇截留分子量分離活性最高的組分，便于放大生產(chǎn)。但重現(xiàn)性差，疏水性肽和膜易相互作用，導(dǎo)致膜污染和堵塞[87]。色譜法分辨率高，常用的方法有尺寸排阻色譜（size exclusion chromatography，SEC）、反相色譜（reversed-phase chromatography，RPC）和離子交換色譜（ion-exchange chromatography，IEC），分別利用肽段的分子量、疏水特性和靜電特性[3]。但色譜技術(shù)可能造成肽失活，且耗時(shí)、昂貴，不利于商業(yè)化。為了克服各技術(shù)弊端，并進(jìn)行準(zhǔn)確的分離純化，多維色譜組合以及多種分離方法聯(lián)用是未來(lái)的方向。如綜合運(yùn)用電滲析、多級(jí)循環(huán)膜反應(yīng)器、色譜與超濾技術(shù)[87]。主要的挑戰(zhàn)是操作成本的增加，以及流動(dòng)相在多維系統(tǒng)中的不相容性，如正相和反相色譜、親水和疏水色譜。例如，Najafian 等[88]使用正交三維的分離方法從發(fā)酵魚(yú)提取物中鑒定了生物活性肽AIPPHPYP 和IAEVFLITDPK。

2.3 序列鑒定

鑒定序列后才能驗(yàn)證肽組分的實(shí)際活性，進(jìn)而評(píng)價(jià)生物利用度、穩(wěn)定性和功能性等。肽序列鑒定常采用質(zhì)譜技術(shù)，包括電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray spray ionization mass spectrometry，ESI-MS）[40]、快速原子轟擊質(zhì)譜（fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDI-MS）。然而質(zhì)譜手段也有局限性：高活性小肽（<4 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度）接近質(zhì)譜的檢測(cè)極限[89]；酶的非特異性切割；產(chǎn)物的復(fù)雜性（游離氨基酸、中小肽、多肽、低聚物、未消化蛋白質(zhì)）會(huì)造成干擾[3]。

2.4 活性評(píng)價(jià)

血糖調(diào)節(jié)活性評(píng)價(jià)方法分為體外評(píng)價(jià)、體內(nèi)驗(yàn)證和生物信息學(xué)分析。體外評(píng)價(jià)通常是測(cè)定DPPIV、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制活性[5]，相對(duì)成熟可靠，已有大量研究（表1）。但體內(nèi)的環(huán)境會(huì)影響降糖肽的作用方式與效果，需要細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)較為經(jīng)濟(jì)、快速，常用小鼠前脂肪細(xì)胞（3T3-L1、3T3-F442A）、C2C12 小鼠成肌細(xì)胞、GLUTag 小鼠腸內(nèi)分泌細(xì)胞、β-TC-6 小鼠胰腺細(xì)胞、L6 大鼠成肌細(xì)胞、INS-1 大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞、FAO 大鼠肝細(xì)胞、HepG2 細(xì)胞，Caco-2 細(xì)胞、BRINBD11 細(xì)胞等。目前已進(jìn)行常見(jiàn)降糖活性和通路的胞內(nèi)研究，例如HepG2 細(xì)胞中的PI3K 和AMPK 通路，肽與α-葡萄糖苷酶相互作用[29]；WGDEHIPGSPYH 和IPGSPY 對(duì)Caco-2 和INS-1 細(xì)胞的DPP-IV抑制活性與胰島素促進(jìn)作用[11]；三肽IAY 和IGY在L6 細(xì)胞內(nèi)濃度2.8 pM 時(shí)顯示出抑制活性[82]。但細(xì)胞試驗(yàn)的結(jié)果不能直接推及到體內(nèi)，體內(nèi)驗(yàn)證通常以鏈脲佐菌素等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠、小鼠模型，或者糖尿病人為對(duì)象。例如，海參水解物通過(guò)觸發(fā)PI3K/Akt 信號(hào)通路改善糖尿病大鼠的胰島素抵抗[13]。單一的動(dòng)物模型無(wú)法完全反映人體的病理特征，且大多數(shù)體內(nèi)驗(yàn)證僅達(dá)到水解物驗(yàn)證或組學(xué)篩選鑒定層面，少見(jiàn)高度純化肽序列的臨床驗(yàn)證。生物信息學(xué)方法從多肽的結(jié)構(gòu)特性入手，研究分子靶點(diǎn)和作用機(jī)制。比傳統(tǒng)方法節(jié)約時(shí)間，經(jīng)濟(jì)成本更低，但是準(zhǔn)確性仍待提高，需要結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[90]。目前相關(guān)研究大多停留在體外階段，體內(nèi)的降糖作用是應(yīng)用推廣的關(guān)鍵。

2.5 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析對(duì)于活性肽的鑒定、表征和生產(chǎn)具有重要作用[91]。不僅可分析其活性和作用機(jī)理，還可評(píng)估胃腸消化敏感性、毒性和過(guò)敏性[90]，時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本更低。常用的方法包括數(shù)學(xué)建模、計(jì)算機(jī)模擬（in silicoanalysis）、分子對(duì)接（molecular docking）和定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）。

2.5.1 計(jì)算機(jī)模擬 計(jì)算機(jī)模擬分析已知的蛋白序列和酶切割位點(diǎn)，篩選特定的肽序列，并預(yù)測(cè)其生物活性、結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性，再通過(guò)傳統(tǒng)方法驗(yàn)證。BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)可預(yù)測(cè)蛋白序列中的活性肽，或模擬蛋白酶的作用[92]；BLAST 比對(duì)新肽是否存在于前體蛋白的序列中；PepDraw 可以預(yù)測(cè)多肽的理化性質(zhì)；ExPASy 或Enzyme Predictor 可進(jìn)行虛擬水解，即電子模擬消化[91]。優(yōu)點(diǎn)是便捷可行，缺點(diǎn)是易受底物蛋白質(zhì)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和反應(yīng)條件影響。

2.5.2 分子對(duì)接 分子對(duì)接技術(shù)模擬了兩個(gè)分子結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物時(shí)的最優(yōu)構(gòu)象，可探索肽序列如何與酶結(jié)合。在RCSB PDB 等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中找到人體源α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和DPP-IV 的不同晶體結(jié)構(gòu)，篩選最佳活性化合物[22]，確定互相作用位點(diǎn)。大豆源三肽GSR、EAK 均能進(jìn)入α-葡萄糖苷酶分子的活性口袋，分別和酶的活性位點(diǎn)形成4 個(gè)、5 個(gè)氫鍵，配體和受體之間產(chǎn)生強(qiáng)烈的范德華力和陰離子-π 相互作用[93]。苦瓜源六肽EPGGGG 通過(guò)范德華力和靜電作用與胰島素以及SGLT1 受體蛋白相互作用[43]。然而，受限于不完整的分子結(jié)構(gòu)等缺點(diǎn)，分子對(duì)接尚不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)結(jié)合親和力。可以將生物大數(shù)據(jù)集成到評(píng)分函數(shù)中來(lái)改進(jìn)。

2.5.3 定量構(gòu)效關(guān)系 定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）可以定量描述結(jié)構(gòu)和活性的關(guān)系，根據(jù)分子特征預(yù)測(cè)活性并探索作用機(jī)制，已用于篩選、設(shè)計(jì)和鑒定新分子。QSAR（主要是2D-QSAR 和3D-QSAR）已廣泛應(yīng)用于生物活性肽的研究，建模過(guò)程包括數(shù)據(jù)集收集、結(jié)構(gòu)表征、變量選擇、模型構(gòu)建、模型驗(yàn)證和評(píng)估等[7]。建模所需數(shù)據(jù)集依賴于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，已公開(kāi)了幾十個(gè)。然而，數(shù)據(jù)集和描述符的有限性、數(shù)據(jù)的異質(zhì)性、以及分子構(gòu)象的柔性仍造成局限，結(jié)構(gòu)表征的新方法與描述符整合是未來(lái)的研究方向。

2.5.4 多技術(shù)聯(lián)用 多種生物信息學(xué)技術(shù)聯(lián)用是研究的發(fā)展方向。Ibrahim 等用BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)4210 條3～5 肽進(jìn)行虛擬消化，使用AutoDock Vina對(duì)844 條抗性肽進(jìn)行分子對(duì)接，以肽與人體源α-葡萄糖苷酶（PDB ID：3L4Y）、α-淀粉酶（PDB ID：4GQR）的結(jié)合自由能為指標(biāo)，篩選出SVPA 和SEPA序列[94]。Mora 等使用CPPpred、PeptideRanker、BIOPEP-UWM、AllerTOP、ToxinPred 等工具分別表征伊比利亞干腌火腿源α-葡萄糖苷酶抑制肽的滲透性、生物活性、耐消化性、過(guò)敏性和毒性[40]。?aglar等[15]使用PeptideRanker、BIOPEP 數(shù)據(jù)庫(kù)以及分子對(duì)接工具，從榛子粕源肽中篩選出7 條DPP-IV 抑制潛力序列，并利用PepSite2 軟件推測(cè)活性殘基與DPP-IV 之間的作用機(jī)制。Rolin[82]通過(guò)小分子靶點(diǎn)預(yù)測(cè)平臺(tái)Swiss Target Prediction 預(yù)測(cè)鮭魚(yú)源肽IAY和IGY 是μ型、δ型和κ型阿片受體激動(dòng)劑的肽模擬物。目前降糖活性的預(yù)測(cè)主要從序列比對(duì)、分子結(jié)構(gòu)比對(duì)、分子對(duì)接三方面進(jìn)行，提高準(zhǔn)確性需要扎實(shí)的理論基礎(chǔ)輔以有效的運(yùn)算模型設(shè)計(jì)，體內(nèi)外的活性驗(yàn)證也不可或缺。

3 產(chǎn)業(yè)化面臨的挑戰(zhàn)

許多食物衍生肽顯示出體外血糖調(diào)節(jié)潛力，而在復(fù)雜的食品基質(zhì)中對(duì)動(dòng)物模型和人體的作用有限。肽的安全性、生物利用度、生物活性和效力[6]，以及食品基質(zhì)的影響，都是產(chǎn)業(yè)化推廣面臨的挑戰(zhàn)，需要通過(guò)研究進(jìn)行評(píng)估。

3.1 消化穩(wěn)定性差

探究肽的特性及其消化穩(wěn)定性、生物利用度之間的關(guān)系，是應(yīng)用推廣的基礎(chǔ)?？诜钚噪念愒谶M(jìn)入體循環(huán)前暴露于40 余種酶，必須對(duì)腸道菌群、刷狀緣和血清肽酶具有抗性，同時(shí)能夠穿過(guò)腸膜[95]。分子量、酸堿性質(zhì)、疏水性和C/N 端氨基酸組成，以及外部因素（pH、離子強(qiáng)度）都可能影響其消化穩(wěn)定性[96]。通常認(rèn)為小分子對(duì)pH 值的耐受性好，能穿透胃腸道，但是低分子肽也可能在模擬消化過(guò)程中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較弱[97]。通過(guò)新型活性物質(zhì)載體技術(shù)：微膠囊、乳液包埋、天然聚合物、納米載體，以及化學(xué)修飾、篩選共存成分等手段，都可提高肽的穩(wěn)定性。例如，Pugliese 等[98]將IAVPTGVA 和LTFPGSAED封裝到RADA16 肽形成穩(wěn)定的納米凝膠，提高其穩(wěn)定性和DPP-IV 抑制活性。

3.2 生物利用度低

肽的功能性受限于生物利用度，而生物利用度的影響因素有：肽的結(jié)構(gòu)和組成（大小、質(zhì)量分布、疏水性）、包埋技術(shù)、個(gè)體因素（飲食、基因、腸道菌群）、作用機(jī)制等。通過(guò)體外模擬消化后的剩余活性評(píng)估生物利用度，精度有限，且因底物和酶而異[74]。通常在細(xì)胞和人體血清模型中評(píng)估生物利用度，并最終進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)[95]。例如，通過(guò)單層Caco-2 細(xì)胞評(píng)估發(fā)現(xiàn)分子量較小、中性或帶負(fù)電的肽轉(zhuǎn)運(yùn)速率較高[16]。而關(guān)于疏水性的影響，目前還未形成統(tǒng)一結(jié)論。利用殼聚糖等基質(zhì)提高肽類的上皮細(xì)胞滲透性，或者對(duì)氨基酸進(jìn)行化學(xué)修飾可能有助于提高其生物利用度。

3.3 毒性和過(guò)敏性問(wèn)題

肽一般不與DNA 或染色體直接作用，故假設(shè)食物源肽可以安全口服。但經(jīng)過(guò)胃腸道的作用存在釋放毒性肽序列的可能性。同時(shí)，尚未明晰肽的多個(gè)分子靶點(diǎn)是否導(dǎo)致副作用。Parthasarathi 等[99]總結(jié)了ToxinPred 等毒性預(yù)測(cè)工具。毒性肽中半胱氨酸、脯氨酸、組氨酸和天冬酰胺的含量相對(duì)較高，毒性與N 端的精氨酸或絲氨酸殘基有關(guān)，而亮氨酸、賴氨酸和異亮氨酸出現(xiàn)最少[100]。某些蛋白質(zhì)片段對(duì)消化水解具有抗性，保留了部分致敏性，產(chǎn)生了過(guò)敏肽[4]。針對(duì)過(guò)敏原和基序，已建立AlgPred 服務(wù)器、BIOPEPUWM 數(shù)據(jù)庫(kù)[92]和過(guò)敏蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)SDAP 等。利用非熱加工技術(shù)改變結(jié)構(gòu)表位[101]，或D-氨基酸等衍生物均可生產(chǎn)低致敏性產(chǎn)品。

3.4 半衰期短

肽在組織中的分布是循環(huán)持續(xù)時(shí)間的函數(shù)，因此肽在血液中的半衰期至關(guān)重要。而天然肽的血漿半衰期短[102]。肽一旦接觸腸粘膜，胃酸和血液中的肽酶迅速將肽轉(zhuǎn)化為氨基酸并排出體外。已有研究利用不可降解的聚合物和聚合物基質(zhì)來(lái)增加肽和蛋白的半衰期，減少頻繁給藥；或者基于已知結(jié)構(gòu)，修飾易被酶切割的氨基酸位點(diǎn)，改善其理化性質(zhì)以降低降解率，例如利拉魯肽；另外，通過(guò)BioEPDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列信息結(jié)合PLifePred 等工具可以預(yù)測(cè)肽段的血液穩(wěn)定性[103]。

3.5 食品基質(zhì)的影響

肽容易發(fā)生相互作用，并與其他分子作用，生成衍生化合物（例如呋喃、生物胺、丙烯酰胺、亞硝胺）。熱處理或非熱處理（高壓、微波、超聲波）、干燥等加工技術(shù)，儲(chǔ)存時(shí)發(fā)生的美拉德反應(yīng)[104]，氫鍵或疏水等其他作用[3]，可能造成肽和蛋白質(zhì)的聚集或沉淀，影響其穩(wěn)定性和功能性。因此，應(yīng)提高蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物在食品配方中的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。利用高纖維基質(zhì)，或聚合物、凝膠進(jìn)行膠囊化，乳液包埋等新技術(shù)，可能有利于提高肽的功能性和感官接受性?？傮w來(lái)說(shuō)，肽對(duì)加工和儲(chǔ)存抗性的研究尚未成熟。

4 總結(jié)與展望

血糖調(diào)節(jié)活性肽有豐富的食物來(lái)源，但其理論研究以及產(chǎn)品研發(fā)仍有不足，最明顯的是作用機(jī)制尚未明晰，同時(shí)缺乏臨床驗(yàn)證?？蓮囊韵聨追矫骊P(guān)注如何強(qiáng)化其體內(nèi)活性：

表征體內(nèi)作用機(jī)制。多數(shù)研究?jī)H完成生物信息學(xué)分析，尚未闡明血糖調(diào)節(jié)肽的靶器官以及作用機(jī)制，無(wú)法保證生物利用度。分子對(duì)接等手段可以識(shí)別肽的低能構(gòu)象和目標(biāo)酶催化位點(diǎn)，預(yù)測(cè)肽與靶分子結(jié)構(gòu)域之間的相互作用（氫鍵、靜電和疏水相互作用等）。但仍然需要從細(xì)胞通路、代謝組學(xué)等新角度明確機(jī)理，尋找新靶點(diǎn)。

克服活性評(píng)估的異質(zhì)性。虛擬篩選方法尚未成熟，多數(shù)活性評(píng)估僅采用體外方法，部分涉及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，臨床研究很少。而體外方法的目標(biāo)酶與人體的同源性有限?；钚噪囊部赡茉谀c道、血液和肝臟中分解、代謝和受損，并與機(jī)體內(nèi)的其他非靶向酶相互作用而失活。因此，需要分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體征變化，結(jié)合組織學(xué)、病理學(xué)等手段，進(jìn)行初步的藥代動(dòng)力學(xué)研究，最終通過(guò)臨床試驗(yàn)評(píng)估肽的消化穩(wěn)定性、生物利用度和安全性，保障并強(qiáng)化體內(nèi)功效。

促進(jìn)研究成果轉(zhuǎn)化。新儀器與工業(yè)應(yīng)用存在技術(shù)壁壘。肽的純化、鑒定和表征需要LC-MS、LCNMR、X 射線結(jié)晶學(xué)等新儀器技術(shù)；而工業(yè)化的放大生產(chǎn)需要微膠囊、乳液包埋、天然聚合物、納米載體等載體技術(shù)，以提高肽的溶解度、穩(wěn)定性和滲透性。在保證安全性的前提下，也考慮利用粗水解物直接生產(chǎn)降低成本和難度。