賴玉萍，陳穎儀，魏婉娉，安苗青，鄒澤斌，杜 冰，黎 攀

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

衰老是一個(gè)保守的、復(fù)雜且不可逆轉(zhuǎn)的退行性生理過(guò)程，其特征是身體生理功能的下降和綜合表現(xiàn)的退化，甚至可能危及生命[1]。已發(fā)表的與衰老有關(guān)的理論大多可分為程序化衰老和損傷衰老兩種，其中最普遍的觀點(diǎn)是氧化應(yīng)激損傷，其強(qiáng)調(diào)的是生物體在代謝過(guò)程中由一些相互關(guān)聯(lián)的反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)量ROS 對(duì)核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等細(xì)胞生物大分子造成漸進(jìn)和累積性損傷，進(jìn)而加速衰老[2-3]。隨著衰老模型和衰老表型指標(biāo)的建立，具有功能多樣性的天然植物提取物已被證明能預(yù)防和/或緩解生理功能的自然下降，有望成為健康壽命和長(zhǎng)壽的促進(jìn)劑[4-6]。

美藤果（Sacha inchi，又名Plukenetia volubilisLinneo），亦稱南美油藤、印奇花生、星油藤等，屬大戟科多年生常綠木質(zhì)含油攀援植物，原產(chǎn)于南美洲亞馬遜地區(qū)的熱帶雨林，包括秘魯和巴西西北部的部分地區(qū)，其葉子和種子被一些土著部落群體以煮熟和烘烤形式作為傳統(tǒng)食物食用[7]。研究表明[8]，美藤果葉乙醇提取物在7000 mg/kg 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)瑞士白化小鼠沒(méi)有產(chǎn)生任何不利影響，即沒(méi)有毒副作用，可以安全食用。Lin 等[9]發(fā)現(xiàn)，美藤果葉水提取物可改善小鼠的高血糖癥狀和腸道微生物群的結(jié)構(gòu)紊亂，有成為功能性飲料的潛力。Nascimento 等[10]對(duì)從水、甲醇、乙醇、氯仿和己烷這5 種不同溶劑中提取的新鮮美藤果葉提取物進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)它們含有酚類化合物、蛋白質(zhì)、糖以及萜類化合物和/或類固醇，活性試驗(yàn)結(jié)果表明這些提取物具有抗氧化活性，可刺激成纖維細(xì)胞3T3 的增殖，還能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，不同程度地抑制腫瘤細(xì)胞HeLa 和A549 的增殖活性。Kittibunchakul 等[11]對(duì)經(jīng)烘箱干燥和冷凍干燥后美藤果嫩葉和成熟葉中的酚類成分含量和抗氧化潛力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)凍干葉的總酚含量高于烘干葉，烘干后幼葉的抗氧化活性高于成熟葉，而冷凍干燥的結(jié)果則與之相反。綜上所述，美藤果葉提取物有成為功能食品或藥物補(bǔ)充劑的潛力。

從目前來(lái)看，大多數(shù)具有抗衰老作用的生物活性成分都是首先以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模式生物的活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的。這可歸因于線蟲(chóng)所具有的優(yōu)勢(shì)：微小透明、解剖結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，這為在體式顯微鏡下觀察線蟲(chóng)的行動(dòng)軌跡提供了便利；基因組特征明確，有與人類同源的腸道、神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞，這對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和代謝功能至關(guān)重要[12-14]；生命周期較短、繁衍能力強(qiáng)與人類高度保守的衰老信號(hào)網(wǎng)絡(luò)等[15]，這些優(yōu)勢(shì)滿足了實(shí)驗(yàn)的靈活性、穩(wěn)定性和可靠性等要求，使其成為衰老生物學(xué)研究的理想模型生物。另外，以哺乳動(dòng)物為模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)雖然很有說(shuō)服力，但它耗時(shí)長(zhǎng)且有倫理問(wèn)題的限制。

因此，本文以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模型生物，探究了美藤果葉醇提物（SILAE）的抗衰老活性，豐富了對(duì)美藤果葉功效作用的認(rèn)識(shí)，為綜合開(kāi)發(fā)美藤果葉提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

N2 野生型線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans） 美國(guó)秀麗隱桿線蟲(chóng)遺傳中心；美藤果葉（干燥） 普洱聯(lián)眾生物資源開(kāi)發(fā)有限公司；大腸桿菌OP50（以下簡(jiǎn)稱OP50） 上海南方模式生物科技股份有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、MDA 試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑 廣州齊湘生物科技有限公司。

SN-HWS250B 型恒溫生化培養(yǎng)箱 甘易儀器設(shè)備（上海）有限公司；FA2204 型萬(wàn)分之一天平 上海舍巖儀器有限公司；LD-SY96S 型多功能酶標(biāo)儀美谷分子儀器（上海）有限公司；MF53-N 型熒光顯微鏡 上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；LC-LX-HR185C型冷凍離心機(jī) 日本久保田公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的制備 干燥的美藤果葉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)80 目篩后，參考文獻(xiàn)[16]進(jìn)行超聲輔助乙醇提取。提取液4000 r/min 離心10 min，合并上清液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥。用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液復(fù)溶，過(guò)0.22 μm 濾膜，采用D101大孔樹(shù)脂進(jìn)行柱層析[17]，先后分別用去離子水、體積分?jǐn)?shù)10%和70%的乙醇梯度洗脫，收集70%乙醇的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥得SILAE，用于基本活性成分的含量測(cè)定和線蟲(chóng)的抗衰老實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 培養(yǎng)基及相關(guān)溶液配制

1.2.2.1 線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM） 0.08 g 鏈霉素硫酸鹽，1.0 g 胰蛋白胨，1.2 g NaCl，8.0 g 瓊脂粉，加入一級(jí)水390 mL，121 ℃滅菌30 min。然后轉(zhuǎn)入無(wú)菌超凈臺(tái)中，降至適宜溫度后，加入1 mol/L CaCl2、1 mol/L MgSO4和5 mg/mL溶解于乙醇中的膽固醇（已過(guò)濾除菌）各400 μL，以及10 mL 1 mol/L pH 為6.0 的磷酸鹽緩沖液（除膽固醇外，其余三種溶液高溫滅菌后再加入），混勻后在無(wú)菌超凈臺(tái)中趁熱將其倒進(jìn)培養(yǎng)皿中，待平板水汽干燥后方可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.2 M9 緩沖液 取3 g Na2HPO4或7.56 g Na2HPO4·12H2O，1.5 g KH2PO4，2.5 g NaCl，0.125 g MgSO4·7H2O，加水至500 mL，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2.3 OP50 的制備 在超凈臺(tái)內(nèi)，挑取OP50 單菌落接入晾涼至約60 ℃的20 mg/mL 的LB 培養(yǎng)基中，而后置于恒溫?fù)u床內(nèi)，在37 ℃，150 r/min 條件下，培養(yǎng)20 h，至OD595=1.0 左右即可。

1.2.3 線蟲(chóng)的培養(yǎng)和同期化 線蟲(chóng)的培養(yǎng)：用NGM于20 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，NGM 中涂有0.2 mL OP50 作為線蟲(chóng)的食物。

線蟲(chóng)的同期化：將處于產(chǎn)卵期的線蟲(chóng)用1 mL M9 緩沖溶液從NGM 洗至無(wú)菌離心管中，3000 r/min離心1 min，棄去上清液，重復(fù)上述步驟2～3 次后。再向其中加入1 mL 裂解液（5 mol/L NaOH:質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的NaClO:超純水=1:1:1），上下輕緩顛倒，裂解約4 min 后3000 r/min 離心1 min，吸除上清液，再向管中加1 mL M9 緩沖液沖洗線蟲(chóng)，3000 r/min離心1 min，重復(fù)兩次，棄去上清液后用移液槍吸取離心管中的線蟲(chóng)懸液50～100 μL 滴在NGM 的無(wú)菌區(qū)，在20 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)約48 h（不超過(guò)60 h）后，此時(shí)的線蟲(chóng)即為同一生長(zhǎng)發(fā)育水平L4 期的幼蟲(chóng)，可用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組與給藥途徑 實(shí)驗(yàn)分組：以H2O2氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，設(shè)置含有質(zhì)量濃度為5、10、15 mg/mL SILAE 的低、中、高劑量樣品組，以及用超純水和維生素C（10 mg/mL）代替樣品的空白組和陽(yáng)性對(duì)照組。

給藥途徑：樣品、VC、超純水分別與OP50 按3:2 的比例配制成給藥樣液，向新鮮NGM 中央滴入0.1 mL 樣液，放置24 h 后用于線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 SILAE 中基本活性成分的測(cè)定 將1.2.1 中獲得的SILAE 配制成0.1 mg/mL 的樣品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2.5.1 總酚含量的測(cè)定 參考楊云等[18]方法并調(diào)整。用沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品配制0.1 mg/mL 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。以沒(méi)食子酸濃度（mg/mL）為X 軸，吸光值為Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取12.5 μL 0.1 mg/mL 的SILAE，定容至250 μL作為樣品待測(cè)液。向待測(cè)樣品和蒸餾水中加入福林酚試劑0.25 mL，混勻，避光反應(yīng)2 min，依次加入1 mL 的7.5% Na2CO3和0.5 mL 水，混勻。40 ℃避光水浴30 min。在760 nm 處測(cè)定吸光值。

1.2.5.2 多糖含量的測(cè)定 參考海力茜·陶爾大洪等[19]的方法，略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用一級(jí)水配制成0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1 mL 0.1 mg/mL 的SILAE 于試管中，而后依次加入1 mL 5%苯酚和5 mL 濃硫酸，混勻，30 ℃水浴20 min，490 nm 處檢測(cè)吸光值，計(jì)算總糖含量。

1.2.5.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 參考黃婉玉等[20]方法。以2 mg/mL 牛血清蛋白溶液為母液，配制濃度分別為0、5、25、50、125 和500 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品20 μL 于96 孔板中，再加入200 μL 考馬斯亮藍(lán)G250，混合均勻，在595 nm 出檢測(cè)吸光值。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用待測(cè)SILAE 替換牛血清蛋白溶液，重復(fù)上述步驟，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。

1.2.5.4 總黃酮含量的測(cè)定 參考王冰芳[16]的方法，略有修改。用60%乙醇配制0.20 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，準(zhǔn)確移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于6 個(gè)10 mL 的刻度比色管中。先加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液于各管中，充分搖勻后靜置6 min；再向各管中加入0.3 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻，靜置6 min；最后加入4.0 mL 4%的NaOH 溶液于各管中，并用60%的乙醇定容至刻度，搖勻后靜置15 min。以60%乙醇作為空白對(duì)照，分別在510 nm 處測(cè)定吸光值值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

用待測(cè)SILAE 替換蘆丁溶液，重復(fù)上述步驟，測(cè)定其總黃酮含量。

1.2.6 線蟲(chóng)壽命的測(cè)定 挑取同步化的L4 期幼蟲(chóng)到新的各組平板上（每個(gè)平板30 條，每組3 個(gè)平板），于20 ℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，定為第0 d。為保證處理化合物的濃度，隨后每天將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的新鮮NGM 板中，直到生殖后期（第6 d），此后每2 d將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)到新的各組平板中，記錄線蟲(chóng)存活、死亡以及剔除條數(shù)，直至所有組線蟲(chóng)死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)束[21]。

線蟲(chóng)死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)吞咽或移動(dòng)動(dòng)作，鉑絲輕觸蟲(chóng)體仍無(wú)任何反應(yīng)。剔除標(biāo)準(zhǔn)：鉆入瓊脂中；逃離至平皿壁或蓋上而干死；蟲(chóng)卵在體內(nèi)孵化而成袋樣蟲(chóng)。剔除意外死亡、逃逸和袋樣蟲(chóng)。

1.2.7 線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的測(cè)定 在同步的壽命實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估，每4 d 觀察并記錄線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)情況[22]。記錄標(biāo)準(zhǔn)：蟲(chóng)體20 s 內(nèi)有自發(fā)連續(xù)協(xié)調(diào)的正弦運(yùn)動(dòng)，不需要觸碰刺激，記為“A”；蟲(chóng)體必須受到觸碰刺激才運(yùn)動(dòng)，記為“B”；線蟲(chóng)受到觸碰刺激后只擺頭或尾，記為“C”。

1.2.8 線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的測(cè)定 挑取同期化的L4 期幼蟲(chóng)到各組NGM 中，每組5 個(gè)板，每個(gè)平板1 條線蟲(chóng)。每隔24 h 將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的新NGM 中（大約轉(zhuǎn)移4～5 次），直到線蟲(chóng)不再產(chǎn)卵。將有蟲(chóng)卵的NGM 再放回恒溫培養(yǎng)箱中20 ℃孵育24 h，待蟲(chóng)卵孵化長(zhǎng)大后（在其進(jìn)入產(chǎn)卵期之前）進(jìn)行計(jì)數(shù)，即為每條線蟲(chóng)的產(chǎn)卵量。

1.2.9 線蟲(chóng)應(yīng)激能力實(shí)驗(yàn) 氧化應(yīng)激NGM 的配制：將0.1% H2O2和用無(wú)水乙醇配制好的240 μmol/L胡桃醌溶液，在無(wú)菌超凈臺(tái)中倒入冷卻至60 ℃左右的NGM 中（按400 mL 計(jì)），混勻后倒入培養(yǎng)皿中，避光放置。

H2O2急性氧化應(yīng)激[23]：挑取同期化的L4 期幼蟲(chóng)到各組NGM 中（每個(gè)平板20 條，每組3 個(gè)板），干預(yù)5 d 后，將各組線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至含有0.1% H2O2的NGM 中，每隔1 h 統(tǒng)計(jì)一次線蟲(chóng)的生存情況，直到線蟲(chóng)全部死亡。

胡桃醌氧化應(yīng)激[24]：挑取同期化后處于L4 期的幼蟲(chóng)到各組NGM 中（每個(gè)平板30 條，每組3 個(gè)平板）繼續(xù)干預(yù)5 d，隨后將各組線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至含有240 μmol/L胡桃醌的NGM 中，每隔1 h 統(tǒng)計(jì)一次線蟲(chóng)的生存情況，直到線蟲(chóng)全部死亡。

1.2.10 線蟲(chóng)體內(nèi)ROS 及脂褐質(zhì)水平測(cè)定 ROS 水平的測(cè)定：將同期化的L4 期幼蟲(chóng)挑到新的各組NGM上（每個(gè)平板30 條，每組3 個(gè)平板）繼續(xù)干預(yù)5 d 后，用M9 緩沖溶液沖洗培養(yǎng)基3 次并轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，離心取上清液。從上清液中吸取50 μL 和50 μL H2DCF-DA 避光混勻加入黑色96 孔板中，在熒光顯微鏡下每20 min 進(jìn)行1 次熒光強(qiáng)度測(cè)定（激發(fā)波長(zhǎng)：485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：530 nm），連續(xù)測(cè)定2 h，并以上清液蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行相對(duì)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化。

脂褐質(zhì)水平的測(cè)定[25]：將同期化的L4 期幼蟲(chóng)挑到相應(yīng)的NGM 上（每個(gè)平板30 條，每組3 個(gè)平板）繼續(xù)干預(yù)7 d 后，以1%疊氮化鈉溶液作麻醉劑麻醉各組線蟲(chóng)，隨即轉(zhuǎn)移到2%瓊脂糖凝膠墊片上，并在激發(fā)波長(zhǎng)365 nm、發(fā)射波長(zhǎng)420 nm 下用熒光倒置顯微鏡、單色數(shù)碼相機(jī)以及Image J 獲取熒光圖像。

1.2.11 線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶活性和MDA 水平的測(cè)定將同期化后生長(zhǎng)到L4 期的線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到各組NGM上，分別繼續(xù)干預(yù)5 d 后，用M9 緩沖溶液沖洗2 次培養(yǎng)皿并將各板上的成蟲(chóng)收集到無(wú)菌離心管中。冷凍研磨后離心，收集上清液后制成5%的線蟲(chóng)勻漿，分別按照試劑盒測(cè)定CAT、SOD、GSH-Px 活力及MDA 與GSH 含量，并以上清液蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 SILAE 基本活性成分的含量

表1 是SILAE 中總糖、總酚、蛋白質(zhì)和總黃酮含量的比重。由表1 可知，在所測(cè)定的四個(gè)指標(biāo)中，總糖的含量最高，占34.70%±2.30%，依次分別是總酚、蛋白質(zhì)和總黃酮。

表1 SILAE 中活性成分含量Table 1 Content of active ingredients in SILAE

2.2 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響

衰老是一種與時(shí)間依賴性損傷、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)衰退和功能能力下降的生理過(guò)程，其特征主要是線粒體功能障礙、細(xì)胞衰老、蛋白質(zhì)平衡喪失和營(yíng)養(yǎng)傳感失調(diào)等，最終會(huì)導(dǎo)致死亡易感性的增加[27]。因此，抗衰老研究中的壽命長(zhǎng)度可作為老化的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

本研究以VC為陽(yáng)性對(duì)照，探究了低、中、高（5、10、15 mg/mL）劑量的SILAE 對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響，結(jié)果如圖1 和表2 所示。由圖1 可知，與空白組相比，不同劑量的SILAE 使線蟲(chóng)的生存曲線明顯右移，延長(zhǎng)了壽命，尤其是低、中劑量組。由表2 可知，空白組線蟲(chóng)的平均壽命為9.86±0.93 d，陽(yáng)性對(duì)照組線蟲(chóng)的平均壽命為10.60±0.23 d，低劑量組線蟲(chóng)的平均壽命較二者分別延長(zhǎng)了59.3%和48.2%，中劑量組則分別提高了30.2%和21.1%，高劑量組也提高了21.4%和12.9%。由此可見(jiàn)，SILAE 延長(zhǎng)線蟲(chóng)健康壽命的效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照VC。

圖1 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響Fig.1 Effect of SILAE on life span of C.elegans

表2 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)平均壽命和最長(zhǎng)壽命的影響Table 2 Effects of SILAE on average and maximum life span of C.elegans

綜上，不同濃度的SILAE 雖然不同程度地延長(zhǎng)了線蟲(chóng)的壽命，但卻呈現(xiàn)劑量依賴地縮短了壽命的延長(zhǎng)。這種劑量反應(yīng)效應(yīng)與甾體皂甙Shatavarin IV[28]、柚皮苷[29]和番茄堿[30]一致，即延長(zhǎng)壽命的作用在較高濃度下被降低了。這可能是因?yàn)楦邼舛鹊腟ILAE 作為一種壓力刺激引發(fā)了一種類似于毒物興奮效應(yīng)的現(xiàn)象，進(jìn)而降低SILAE 的正向保護(hù)作用[31]。另外，較高濃度的SILAE 可能還抑制了線蟲(chóng)體內(nèi)的線粒體分裂融合蛋白導(dǎo)致線粒體功能障礙，使線粒體中的超氧陰離子自由基等ROS 累積增多，進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激并損傷細(xì)胞，細(xì)胞增殖受到抑制而降低了壽命的延長(zhǎng)[32-33]。

2.3 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響

機(jī)體衰老通常伴隨著各項(xiàng)生理機(jī)能的衰退，包括引起機(jī)體肌肉的退化而導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)能力隨著壽命的延長(zhǎng)而降低[34]。圖2 表明了SILAE 對(duì)第4、8、12、16、20、24 d 線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響：在線蟲(chóng)壽命的早期階段（第4 d 和第8 d），各組均有70.0%以上的線蟲(chóng)處于A 狀態(tài)，較為活躍，其中保持在A 狀態(tài)的SILAE 各組線蟲(chóng)高于空白組和陽(yáng)性對(duì)照組；與早期線蟲(chóng)相比，第12 d 時(shí)，除了低劑量組（5 mg/mL）仍有接近50.0%的線蟲(chóng)保持在A 狀態(tài)，其余各組線蟲(chóng)大都處于B 狀態(tài)，其中中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組分別有66.7%、56.2%、61.5%的線蟲(chóng)處于B 狀態(tài)，與空白組比分別提高了33.3%、50%、33.3%。黃少杰等[35]的研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛多糖對(duì)處于生命早期的線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力影響并不顯著，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。而在第16、20 d 時(shí)，處于A 狀態(tài)的線蟲(chóng)比例出現(xiàn)上升（與第12 d 比），推測(cè)出現(xiàn)這種情況的原因可能是從第12 d 存活下來(lái)的線蟲(chóng)生存能力較強(qiáng)。直到壽命的末期（第24 d），僅有SILAE 組線蟲(chóng)存活?？梢?jiàn)，SILAE 在延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命的同時(shí)，還能有效延緩肌肉的退化，提高其運(yùn)動(dòng)能力。

圖2 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響Fig.2 Effect of SILAE on athletic ability of C.elegans

2.4 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響

衰老研究發(fā)現(xiàn)，壽命延長(zhǎng)的代價(jià)通常是生殖能力的降低或喪失[36-37]，但也有研究報(bào)道表明壽命的延長(zhǎng)并不影響線蟲(chóng)的生殖能力[38-39]。因此，本研究通過(guò)測(cè)定產(chǎn)卵量來(lái)評(píng)價(jià)SILAE 在延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命的同時(shí)是否會(huì)損害其生殖能力，結(jié)果如圖3 所示。由2.2 可知，低劑量（5 mg/mL）的SILAE 能顯著延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命，但由圖3 可知該組線蟲(chóng)的產(chǎn)卵量與空白組無(wú)顯著性差異（P>0.05），即壽命的延長(zhǎng)，沒(méi)有影響低劑量組線蟲(chóng)的生殖能力。而中、高劑量組線蟲(chóng)的總產(chǎn)卵量均高于空白組產(chǎn)卵量，存在高度顯著的差異性（P<0.001）。另外，高劑量組線蟲(chóng)的生殖能力亦極顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.01）。由此可見(jiàn)，SILAE 在延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命的同時(shí)，不會(huì)損傷線蟲(chóng)的生殖能力，且在一定濃度范圍內(nèi)能提高線蟲(chóng)的生殖能力，符合對(duì)抗衰老物質(zhì)的需求。

圖3 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響Fig.3 Effect of SILAE on oviposition of C.elegans

2.5 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)應(yīng)激能力的影響

H2O2是胞內(nèi)最常見(jiàn)的一種活性氧，會(huì)觸發(fā)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生自由基，進(jìn)而引起急性氧化損傷[40]。圖4 表明，在H2O2急性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，空白組線蟲(chóng)的最長(zhǎng)存活時(shí)間為2 h，低、中、高劑量和陽(yáng)性對(duì)照組線蟲(chóng)的存活時(shí)間分別被延長(zhǎng)至4、7、6 和7 h，且生存曲線較空白組均有明顯右移。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)[41]，中、高劑量的玫瑰類黃酮能顯著提高線蟲(chóng)在H2O2應(yīng)激環(huán)境中的存活率。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SILAE不同程度地緩解了H2O2引起的氧化應(yīng)激對(duì)線蟲(chóng)造成的損傷，延長(zhǎng)其存活率，且與陽(yáng)性對(duì)照無(wú)顯著性差異。

圖4 H2O2 急性氧化應(yīng)激損傷線蟲(chóng)的壽命曲線Fig.4 Lifespan curves of C.elegans with H2O2-induced acute oxidative stress

本研究還用細(xì)胞內(nèi)活性氧發(fā)生器—胡桃醌[42]，評(píng)估了SILAE 對(duì)線蟲(chóng)氧化應(yīng)激耐受性的影響，結(jié)果如圖5 所示。由表3 可知，低、中、高劑量組線蟲(chóng)的壽命較空白組分別延長(zhǎng)了41.7%、58.3%、16.7%，但與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著性差異。其中，低、中劑量組線蟲(chóng)的生存能力顯著高于空白組線蟲(chóng)（P<0.05）。

圖5 胡桃醌氧化應(yīng)激損傷線蟲(chóng)的壽命曲線Fig.5 Lifespan curves of C.elegans with jutaquinone oxidative stress

表3 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)應(yīng)激能力的影響Table 3 Effect of SILAE on stress ability of C. elegans

以上結(jié)果說(shuō)明，一定濃度范圍內(nèi)的SILAE 在過(guò)氧化氫應(yīng)激、胡桃醌等急性氧化應(yīng)激環(huán)境下對(duì)線蟲(chóng)有一定的保護(hù)作用，能延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命。

2.6 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)ROS 及脂褐質(zhì)水平的影響

過(guò)量的ROS 會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并損害脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，如炎癥、衰老和癌癥等[43-44]。由圖6 和圖7 可知，線蟲(chóng)體內(nèi)ROS 水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在120 min 時(shí)，SILAE 各劑量組線蟲(chóng)體內(nèi)的ROS 相對(duì)水平較空白組有極顯著降低（P<0.001），但與陽(yáng)性對(duì)照無(wú)顯著性差異。這表明，SILAE 能有效清除線蟲(chóng)體內(nèi)的ROS，降低ROS 對(duì)線蟲(chóng)的氧化損傷，提高其生存能力。

圖6 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)ROS 相對(duì)水平的影響Fig.6 Effect of SILAE on ROS levels in C.elegans

圖7 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)ROS 相對(duì)水平的影響（120 min）Fig.7 Effect of SILAE on ROS levels in C.elegans (120 min)

脂褐質(zhì)是一種能自發(fā)熒光的黃褐色物質(zhì)，其沉積量與熒光強(qiáng)度成正比，細(xì)胞成分的氧化降解和自噬會(huì)促進(jìn)脂褐質(zhì)的形成[45]。而隨著壽命的延長(zhǎng)，脂褐質(zhì)會(huì)在線蟲(chóng)體內(nèi)沉淀并損傷組織細(xì)胞，加速衰老[45-46]。因此，脂褐質(zhì)可作為衰老的生物標(biāo)志物。如圖8 所示，與空白組相比，SILAE 各劑量組以劑量依賴的方式極顯著地降低了線蟲(chóng)體內(nèi)的脂褐質(zhì)水平（P<0.001），其中高劑量組（15 mg/mL）線蟲(chóng)體內(nèi)的脂褐質(zhì)水平較空白組降低了56.1%。此外，經(jīng)中、高劑量SILAE 喂養(yǎng)的線蟲(chóng)，其體內(nèi)的脂褐質(zhì)水平與陽(yáng)性對(duì)照組VC無(wú)顯著性差異。由此可見(jiàn)，SILAE 能有效減少脂褐質(zhì)在線蟲(chóng)體內(nèi)的積累，降低脂褐質(zhì)堆積造成的細(xì)胞成分的氧化降解，延緩氧化損傷并延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命。

圖8 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)脂褐質(zhì)水平的影響Fig.8 Effect of SILAE on lipofuscin levels in C.elegans

2.7 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)和MDA 含量的影響

抗氧化防御系統(tǒng)作為機(jī)體具有抗氧化能力的重要組成部分，其復(fù)雜的酶和非酶抗氧化劑可通過(guò)抵消總ROS 水平來(lái)維持生理穩(wěn)態(tài)[47]。該系統(tǒng)涉及了包括SOD、CAT 和GSH-Px 在內(nèi)的多種酶系統(tǒng)，以及由谷胱甘肽、維生素E 等組成的非酶抗氧化劑，它們通過(guò)直接淬滅自由基、清除過(guò)氧化物質(zhì)或螯合金屬離子參與抗氧化[48]。MDA 是氧化應(yīng)激的重要生物標(biāo)志物，也是ROS 引發(fā)的主要脂質(zhì)過(guò)氧化物[49]。因此，為了評(píng)價(jià)SILAE 對(duì)線蟲(chóng)內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的影響，本研究測(cè)定了抗氧化酶（SOD、CAT 和GSH-Px）的活性以及非酶抗氧化劑（GSH）的含量，并對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)的MDA 含量進(jìn)行了測(cè)定。

提高SOD 活力有助于將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2，而H2O2又是CAT 和GSH-Px 的底物，CAT 能將H2O2代謝分解成水和氧氣，GSH-Px 則是在與非酶抗氧化劑GSH 反應(yīng)時(shí)減少H2O2和有機(jī)氫過(guò)氧化物[50]。由圖9 可知，經(jīng)SILAE 干預(yù)的線蟲(chóng)，其體內(nèi)的SOD 活力較空白組有高度顯著差異（P<0.001），都提高了約2 倍，但與陽(yáng)性對(duì)照無(wú)顯著性差異；CAT 活力較空白組分別提高了66.8%、60.3%、125.6%，其中高劑量組線蟲(chóng)體內(nèi)的CAT 活力與VC組具有顯著性差異（P<0.05）；中劑量組（10 mg/mL）線蟲(chóng)中的GSH-Px 活力極顯著提高了95.5%，且與VC組也存在極顯著差異（P<0.01）。而非酶抗氧化劑GSH 在中劑量組線蟲(chóng)體內(nèi)的含量也極顯著高于空白組（P<0.01），且顯著高于VC組。此外，如圖10 所示，SILAE 各劑量組線蟲(chóng)中的MDA 含量較空白組均有顯著下降（P<0.05），但與陽(yáng)性對(duì)照無(wú)顯著性差異。

圖9 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的影響Fig.9 Effect of SILAE on antioxidant defense system in C.elegans

圖10 SILAE 對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)MDA 含量的影響Fig.10 Effect of SILAE on MDA content in C.elegans

這些數(shù)據(jù)表明，SILAE 能有效提高線蟲(chóng)體內(nèi)酶和非酶物質(zhì)的抗氧化活性，增強(qiáng)其對(duì)氧化應(yīng)激的響應(yīng)和防御能力，降低體內(nèi)MDA 等氧化產(chǎn)物的含量，進(jìn)而減緩衰老過(guò)程中過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)線蟲(chóng)造成氧化損傷，提高其生存能力，延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命。

3 結(jié)論

基于衰老的自由基理論，本文以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模型生物，相對(duì)完整地評(píng)價(jià)了SILAE 對(duì)線蟲(chóng)壽命及與年齡相關(guān)的生理機(jī)能、抗氧化應(yīng)激能力、抗氧化防御系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明，SILAE 以不損傷線蟲(chóng)生殖能力的方式延長(zhǎng)了其壽命，并在一定劑量范圍內(nèi)還能有效提高其生殖能力和運(yùn)動(dòng)能力。SILAE 也提高了線蟲(chóng)體內(nèi)的抗氧化酶SOD、CAT 和GSH-Px 的活力和非酶抗氧化劑GSH 的含量。此外，SILAE 還能有效降低線蟲(chóng)體內(nèi)的ROS 水平及其引發(fā)的氧化應(yīng)激產(chǎn)物—脂褐質(zhì)和MDA 的水平，提高線蟲(chóng)的氧化應(yīng)激抵抗力，降低由此引發(fā)的氧化損傷。

綜上，SILAE 可能通過(guò)捕獲并猝滅線蟲(chóng)體內(nèi)的活性氧和降低不利于健康長(zhǎng)壽的物質(zhì)含量，增強(qiáng)線蟲(chóng)的氧化應(yīng)激抵抗能力和抗氧化能力并提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)了健康壽命。因而，SILAE 有可能成為一種潛在的膳食補(bǔ)充劑和具有抗氧化衰老特性的替代藥物。本實(shí)驗(yàn)也為天然植物抗氧化劑在功能食品中的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供了新的來(lái)源和理論參考。