劉俊財，葛 珍，江 曉，崔保金，張 平，孫建安,*，毛相朝

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.青島濱海學院醫(yī)學院，山東青島 266404；3.山東豐采健康產業(yè)有限公司，山東濰坊 262612）

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）又稱老年癡呆癥，是一種起病隱匿、進行性發(fā)展的神經系統(tǒng)退行性疾病[1]。以記憶力下降和認知功能障礙為特征的復雜的多因素慢性進行性精神衰退疾病[2]，臨床表現(xiàn)為進行性記憶和認知能力減退[3]、語言障礙、精神運動異常等癥狀。患者早期以近記憶下降為主，疾病后期遠期記憶也受累及，日常生活受到影響，表現(xiàn)為學習新知識困難，工作主動性下降，承擔新任務無法勝任，并隨時間推移而加重，伴有語言障礙、計算障礙，視空間障礙，喪失日常技能，失去認知能力，最終導致大部分腦部和身體組織器官受損甚至死亡[4-5]。

阿爾茨海默癥發(fā)病原因及發(fā)病機理非常復雜，目前仍未闡明[6]，尚無特效的治療藥物。蜂王漿作為一種多領域認知增強劑，可以恢復阿爾茨海默癥模型的認知功能障礙[7]，蜂王漿的提取物能顯著地提高神經干細胞向神經元、星狀細胞和膠質細胞的分化，是一種對大腦具有神經營養(yǎng)和神經保護作用的食品。其作用機制可能與以下幾個方面有關：促進神經保護系統(tǒng)相關神經元的轉錄和免疫反應活性，增強海馬神經元生長抑素基因的表達[8]；降低血漿總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平[9]，增強神經元的代謝活動，減少阿爾茨海默癥發(fā)病機制中有毒的β-淀粉樣蛋白（Aβ）水平，減輕神經退行性變和氧化應激水平，并增加海馬區(qū)新神經元的增殖[10-12]。

目前的研究大多聚焦于蜂王漿原料對阿爾茨海默癥功能的研究，蜂王漿是蜂王的主要食物，由水、蛋白質、碳水化合物、脂質、礦物質等組成的乳液體系，營養(yǎng)豐富，蛋白質占比達15%，它有助于提升蜂王的繁殖力，可以有效促進神經保護系統(tǒng)相關神經元的轉錄和免疫反應活性，但蜂王漿味酸，口感澀，質地粘稠且不易保存，制約了其發(fā)展，蜂王漿酶解為多肽后可以改善其不良風味，增加穩(wěn)定性，更加方便貯藏運輸，但是否具有防治阿爾茨海默癥功效值得探究。蜂王漿組成復雜，發(fā)揮功效成分不明確，酶解后制備成肽測定其活性功能更有助于明確其作用組分。研究表明，將原料蛋白酶解為多肽后，也有明顯的防治阿爾茨海默癥功效[13]。本文以蜂王漿酶解產物（蜂王漿肽）為樣品，六水氯化鋁建立斑馬魚阿爾茨海默癥模型，探討蜂王漿肽對阿爾茨海默癥模型斑馬魚的影響，為蜂王漿類防治阿爾茨海默癥功能產品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂王漿 山東豐采健康產業(yè)有限公司；蜂王漿酶解液凍干粉-1（LPR-1）、蜂王漿酶解液凍干粉-2（LPR-2） 實驗室自制；酸性蛋白酶 南寧龐博生物工程有限公司，100000 U/g；野生型AB 品系斑馬魚 杭州環(huán)特杭州環(huán)特生物科技股份有限公司；黑色素等位基因突變Albino 品系斑馬魚 杭州環(huán)特杭州環(huán)特生物科技股份有限公司；鹽酸多奈哌齊 加拿大TRC 公司；六水氯化鋁 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO） Sigma 公司；吖啶橙 上海麥克林生化科技有限公司；乙酰膽堿酯酶檢測試劑盒 AAT Bioquest 公司；甲基纖維素 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RNA 快速提取試劑盒 上海奕杉生物；第一鏈合成試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

SZX7 解剖顯微鏡 OLYMPUS 公司；VertA1-CCD 相機 上海土森視覺科技有限公司；AZ100 電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡 Nikon 公司；Zebra Lab 3.22 行為分析儀 ViewPoint 公司；SPARK 多功能酶標儀 TECAN 公司；CFX96 熒光定量PCR儀 BIO-RAD 公司；BE-6100 微孔板迷你離心機海門市其林貝爾儀器制造有限公司；OSE-Y30 高速組織研磨器 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LPR-1 與LPR-2 的制備 稱取一定量的蜂王漿，在料液比（蜂王漿:水）1:4（g/mL），初始pH 為5，酶解溫度為45 ℃，加酶量9000 U/g 時使用酸性蛋白酶酶解5 h；在料液比（蜂王漿:水）為1:4（g/mL），酶解溫度為55 ℃，加酶量為10000 U/g 時使用酸性蛋白酶酶解4 h，酶解結束后沸水浴10 min，8000 r/min 離心20 min 后取上清冷凍干燥待用。分別將上述酶解液凍干粉配制成200 mg/mL 溶液，過膜后經葡聚糖凝膠G-15 層析分離，超純水洗脫，洗脫條件：流速3.5 mL/min，上樣量為1 mL。在上述兩種酶解條件，相同洗脫條件下洗脫，在第一種酶解條件下，收集1800～2700 s 的洗脫峰，命名為LPR-1，在第二種酶解條件下，收集2900～4400 s 的洗脫峰，命名為LPR-2。

1.2.2 最小中毒濃度（minimum toxic concentration，MTC）測定 LPR-1，LPR-2 分別用標準稀釋水配制成20.0 mg/mL 的母液，分裝后-20 ℃儲存。鹽酸多奈哌齊[14-15]用DMSO 配制成3.33 mg/mL 母液，-20 ℃儲存。將150 尾受精后4 d（4 dpf）野生型AB 品系斑馬魚隨機分為正常組、模型組、鹽酸多奈哌齊陽性對照組（3.33 μg/mL）、蜂王漿酶解液凍干粉-1 組（LPR-1）和蜂王漿酶解液凍干粉-2 組（LPR-2）于6 孔板中，每孔容量為3 mL，每組30 尾。除正常組外，其它組斑馬魚采用水溶給予六水氯化鋁（180 μmol/L）建立AD 斑馬魚模型，實驗組同時給予相應藥物（濃度見表2），28 ℃處理24 h 后，測定樣品對模型斑馬魚的MTC。

1.2.3 運動功能障礙恢復功效評價 隨機選取4 dpf野生型AB 品系斑馬魚于6 孔板中，每孔（實驗組）均處理30 尾斑馬魚，參照“1.2.2”建立斑馬魚阿爾茨海默癥模型，28 ℃處理24 h 后，每個實驗組隨機選擇10 尾斑馬魚轉移至96 孔板中，200 μL/尾，1 尾/孔，利用行為分析儀采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚總運動距離，以該指標的統(tǒng)計學分析結果評價樣品運動功能障礙恢復功效。

1.2.4 反應能力改善功效評價 隨機選取4 dpf 野生型AB 品系斑馬魚于6 孔板中，每孔（實驗組）均處理30 尾斑馬魚，參照“1.2.2”建立斑馬魚阿爾茨海默癥模型，28 ℃處理24 h 后，每個實驗組隨機選取10 尾斑馬魚，利用行為分析儀測定光暗刺激下斑馬魚的每分鐘光暗速度差值，以該指標的統(tǒng)計學分析結果評價樣品反應能力改善功效。

1.2.5 乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）抑制功效評價 隨機選取4 dpf 野生型AB 品系斑馬魚于6 孔板中，每孔（實驗組）均處理30 尾斑馬魚，參照“1.2.2”建立斑馬魚阿爾茨海默癥模型，28 ℃處理48 h 后，將斑馬魚轉移到96 孔板，采用乙酰膽堿酯酶測定試劑盒，利用多功能酶標儀采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚分析斑馬魚體內乙酰膽堿酯酶[16-17]熒光值，以該指標的統(tǒng)計學分析結果評價樣品對乙酰膽堿酯酶的抑制功效。

1.2.6 腦凋亡抑制功效評價 隨機選取4 dpf 黑色素等位基因突變Albino 品系斑馬魚于6 孔板中，每孔（實驗組）均處理30 尾斑馬魚。參照“1.2.2”建立斑馬魚阿爾茨海默癥模型，28 ℃處理24 h 后，用吖啶橙（AO）對凋亡細胞進行染色，染色結束后每個實驗組隨機選擇10 尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照，用NIS-ElementsD 3.20 高級圖像處理軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚腦部凋亡細胞的熒光強度，以該指標的統(tǒng)計學分析結果評價樣品對腦凋亡的抑制功效[18]。

1.2.7 對相關基因的影響 隨機選取4 dpf 野生型AB 品系斑馬魚于6 孔板中，每孔（實驗組）均處理30 尾斑馬魚。參照“1.2.2”建立斑馬魚阿爾茨海默癥模型，28 ℃處理24 h 后，使用RNA 快速提取試劑盒提取斑馬魚總RNA，用紫外-可見光分光光度計測定RNA 的濃度及A260/A280比值，A260/A280比值均在1.8～2.2 之間[19]，表明提取得到斑馬魚總RNA質量較好，可用于后續(xù)qPCR 實驗。引物序列見表1。取2.00 μg 斑馬魚樣品總RNA，按照cDNA 第一鏈合成試劑盒說明操作，合成20.0 μL cDNA，通過qPCR 檢測β-actin、TNF-α、caspase-3[20]和BDNF[21]基因的表達。qPCR 方法：采用CFX96 實時熒光定量聚合酶鏈反應體系（95 ℃下2 min；95 ℃下5 s，60 ℃下30 s，40 個循環(huán)）。反應體積為10 μL（cDNA 4.5 μL，正向引物0.25 μL，反向引物0.25 μL，5 μL SYBR Green）。用β-actin作為基因表達的內參，計算TNF-α、caspase-3和BDNF基因的RNA 相對表達量。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計學處理結果采用平均值±標準誤差（Mean±SE）表示。用SPSS26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。采用Origin 2019 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 最小中毒濃度（MTC）測定

MTC 是藥物引起毒性反應的最小濃度，其是藥物安全性的評價指標之一[22]。由表2 可知，LPR-1在濃度為1000 μg/mL 時死亡率為0%，且與模型對照組狀態(tài)相似。濃度為2000 μg/mL 時死亡率為33%。LPR-2 在濃度為1000 μg/mL 時死亡率為0%，且與模型對照組狀態(tài)相似。濃度為2000 μg/mL 時死亡率為100%。綜上，LPR-1，LPR-2 對防治阿爾茨海默癥功效評價的MTC 均為1000 μg/mL。

表2 樣品防治阿爾茨海默癥功效濃度摸索實驗結果（n=30）Table 2 Concentration of sample for prevention and treatment of AD (n=30)

2.2 運動功能障礙恢復功效評價

運動能力下降是AD 患者典型的臨床表現(xiàn)之一，通過行為分析儀分析可檢測樣品改善斑馬魚運動能力的效果。由圖1 和圖2 可知，模型組斑馬魚總運動距離較正常組顯著性下降（極顯著，P<0.001），表明造模成功，LPR-1 組，LPR-2 組和模型對照組比較，斑馬魚總運動距離延長，分別延長1.8 倍（極顯著，P<0.001）和0.7 倍（高度顯著，P<0.01），陽性對照鹽酸多奈哌齊組延長1.4 倍。實驗結果表明LPR-1，LPR-2 均具有對運動功能障礙恢復的功效。

圖1 樣品處理后斑馬魚運動軌跡典型圖Fig.1 Typical motion path of zebrafish after sample treatment

圖2 樣品處理后斑馬魚總運動距離Fig.2 Total moving distance of zebrafish after sample treatment

2.3 反應能力改善功效評價

反應能力下降是AD 患者典型的臨床表現(xiàn)之一，通過明暗交替行為學實驗可檢測樣品改善AD 斑馬魚對應激刺激的恢復能力。從圖3 可以看出，模型組斑馬魚每分鐘平均速度均低于其他組，結合圖4 可知，模型組較正常組每分鐘光暗速度差值極顯著下降（P<0.001），表明造模成功，LPR-1 組，LPR-2組和模型對照組比較，斑馬魚每分鐘光暗速度差值均極顯著延長（P<0.001），分別延長1.8 倍、2.1 倍，陽性對照鹽酸多奈哌齊組延長1.4 倍。實驗結果表明LPR-1，LPR-2 均具有對反應能力改善的功效。

圖3 樣品處理后斑馬魚每分鐘平均運動速度Fig.3 Average movement speed of zebrafish per minute after sample treatment

圖4 樣品處理后斑馬魚每分鐘光暗速度差值Fig.4 Difference of light and dark velocity of zebrafish per minute after sample treatment

2.4 乙酰膽堿酯酶抑制功效評價

盡管阿爾茨海默病的病因尚不清楚，但使用乙酰膽堿酯酶抑制劑來減少神經遞質乙酰膽堿的分解已經成為輕到中度阿爾茨海默病患者的主要對癥治療方式。乙酰膽堿酯酶抑制劑已被發(fā)現(xiàn)在廣泛的動物模型中可以改善認知障礙，并已被中國用于阿爾茨海默病的治療[17]。由圖5 可知，LPR-1 組，LPR-2 組和模型對照組比較，斑馬魚AchE 熒光值均極顯著降低（P<0.001），分別降低49%和53%，陽性對照鹽酸多奈哌齊組降低49%。實驗結果表明LPR-1，LPR-2 均具有乙酰膽堿酯酶抑制功效。

圖5 樣品處理后斑馬魚乙酰膽堿酯酶熒光值Fig.5 Fluorescence value of AchE of zebrafish after sample treatment

2.5 腦凋亡抑制功效評價

斑馬魚腦區(qū)細胞凋亡情況檢測腦區(qū)細胞凋亡是AD 典型的病理學特征之一，通過AO 染色后可以對各組斑馬魚腦區(qū)細胞凋亡情況進行檢測，驗證斑馬魚AD 樣行為與腦區(qū)細胞凋亡的關聯(lián)一致性[18]。從圖6 中可看出模型組的熒光顆粒較正常組顯著增加，表明造模成功，圖7 經過定量分析顯示，LPR-1、LPR-2 和模型對照組比較，斑馬魚腦部凋亡細胞熒光強度降低（高度顯著，P<0.01），分別降低15%、21%，陽性對照鹽酸多奈哌齊組降低22%。實驗結果表明LPR-1，LPR-2 均具有抑制斑馬魚腦凋亡功效。

圖6 樣品處理后斑馬魚腦部凋亡細胞典型圖Fig.6 Typical picture of brain apoptotic cells of zebrafish after sample treatment

圖7 樣品處理后斑馬魚腦部凋亡細胞熒光強度Fig.7 Fluorescence intensity of zebrafish brain apoptotic cells after sample treatment

2.6 對相關基因的影響

炎性細胞因子TNF-α與阿爾茨海默病轉基因小鼠記憶能力相關[23]。由圖8 可知，模型組較正常組TNF-α基因相對表達量升高（高度顯著，P<0.01），表明造模成功，LPR-1、LPR-2 和模型對照組比較，斑馬魚TNF-α基因相對表達量顯著降低（P<0.01），分別降低67%、53%，陽性對照鹽酸多奈哌齊組降低86%。實驗結果表明LPR-1，LPR-2 均具有下調TNF-α基因相對表達量功效。

圖8 TNF-α 基因相對表達量Fig.8 Relative expression of TNF-α gene

星形膠質細胞增生和caspase-3的激活通常被認為是海馬區(qū)細胞凋亡的主要標志[24]。由圖9 可知，模型組較正常組caspase-3基因相對表達量顯著升高（P<0.05），表明造模成功，LPR-1，LPR-2 和模型對照組比較，斑馬魚caspase-3基因相對表達量分別降低了48%（P<0.05）和56%（高度顯著，P<0.01），陽性對照鹽酸多奈哌齊組降低58%。實驗結果表明LPR-1，LPR-2 均具有下調caspase-3基因相對表達量功效。

圖9 caspase-3 基因相對表達量Fig.9 Relative expression of caspase-3 gene

神經營養(yǎng)因子，如腦源性神經營養(yǎng)因子，對神經元的生存和生長是必不可少的。腦源性神經營養(yǎng)因子及其受體啟動的信號轉導通路是突觸可塑性的關鍵調節(jié)因子，在學習記憶形成中起著重要作用。阿爾茨海默病已經發(fā)現(xiàn)BDNF水平和信號通路的變化，BDNF水平這些與疾病的癥狀和病程有關[21]。由圖10 可知，模型組較正常組BDNF基因相對表達量下降（高度顯著，P<0.01）表明造模成功，LPR-1，LPR-2 和模型對照組比較，斑馬魚BDNF基因相-對表達量極顯著升高（P<0.001），均升高1.8 倍，陽性對照鹽酸多奈哌齊組升高2.8 倍。實驗結果表明LPR-1，LPR-2 均具有上調BDNF基因表達的功效。

圖10 BDNF 基因相對表達量Fig.10 Relative expression of BDNF gene

3 結論

不同蛋白酶酶解對肽活性具有一定影響，生物活性肽是對人類健康有積極影響的特定蛋白質片段，通常包括2～20 個氨基酸殘基，分子量<6000 Da。這些肽在親本蛋白的序列內是無活性的，通過水解從母體蛋白中釋放出來，具有特定的功效和較少的副作用。生物活性肽的功能特性活性取決于其氨基酸序列及其反映的結構特性。不同蛋白酶水解程度不同，酶切位點不同，所得到最終的序列也不同。LPR-1和LPR-2 在制備過程中進行了蛋白酶的篩選，考察了五種商業(yè)蛋白酶抗氧化活性，實驗結果表明，酸性蛋白酶酶解效果最好，其次是堿性蛋白酶和中性蛋白酶，木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶效果較差。

目前用于治療AD 的藥物主要有乙酰膽堿酶抑制劑、谷氨酸受體拮抗劑、吡拉西坦及其他一些具有緩解AD 癥狀的藥物。乙酰膽堿酶抑制劑如他克林、加蘭他敏、利斯的明等都存在消化道不良反應，應謹慎應用；谷氨酸受體拮抗劑如美金剛可以降低神經元的損傷情況但存在一些頭暈、頭痛的不良反應[25]。蜂王漿屬于天然食物，蜂王漿肽具有更高的穩(wěn)定性、安全性，利用高效、便捷、安全的酶解法和微生物發(fā)酵法，經過工藝的合理控制，可以提供特定的生產條件實現(xiàn)產品的一致性，可廣泛應用于肽的大量生產。

Sang 等[26]表明以斑馬魚模型具有進行探究AD 機制的可行性。AD 發(fā)病機制復雜，現(xiàn)代醫(yī)學認為，細胞凋亡[27]，TNF 炎癥因子與AD 發(fā)病密切相關。任擎宇等[18]通過TUNEL 染色法探究金盞菊對AD 斑馬魚的影響，結果表明造模組凋亡細胞數(shù)明顯增多，與Hadipour 等[28]研究趨勢一致，而在經過金盞菊處理后，AD 斑馬魚腦區(qū)凋亡細胞數(shù)目顯著減少；細胞凋亡又與Caspase家族[29]密切相關，所以其也與AD 患者認知、行為功能障礙異常有關[30]，王玥等[31]等表明阿魏酸可通過降低Caspase-3表達水平改善AD 小鼠腦內細胞凋亡；Drews 等[23]研究表明，TNF炎癥因子降低后AD 小鼠星形膠質細胞遷移特性顯著改善脂質和蛋白質等的過氧化與AD 相關，其影響區(qū)域主要位于海馬區(qū)和內嗅皮層。通過蛋白質組分分析AD 患者大腦，發(fā)現(xiàn)了大量氧化功能喪失的蛋白質，而這些蛋白質在能量代謝，細胞代謝等通路上至關重要。AD 患者的臨床和動物實驗表明，在AD 患者早期已經出現(xiàn)了氧化損傷，氧化應激標志物含量明顯升高。在輕度認知障礙患者和AD 患者中都觀察到超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶等含量明顯降低，脂質過氧化產物MDA 含量顯著上升。Aβ和金屬離子動態(tài)平衡紊亂等因素誘導產生的氧化應激是阿爾茨海默病形成的關鍵因素。本實驗研究結果顯示，LPR-1，LPR-2 蜂王漿肽均具有防治阿爾茨海默癥功效，其機制可能與下調caspase-3基因水平，降低TNF-α基因相對表達量，上調BDNF基因表達，抑制腦部細胞凋亡，抑制氧化應激，減輕炎癥反應有關。這些發(fā)現(xiàn)將為蜂王漿肽防治阿爾茨海默癥提供依據(jù)。