冷京京，涂 偉，趙 璠，伊揚(yáng)磊,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西咸陽 712100；2.陜西華州醫(yī)藥生物工程有限公司，陜西西安 710054；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西咸陽 712100）

近年來骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）的發(fā)病率隨著老年群體及肥胖人群的不斷增加而隨之攀升。由于被廣泛應(yīng)用于治療骨關(guān)節(jié)炎的鎮(zhèn)痛藥和非甾體抗炎藥長期使用會給人體帶來一定副作用[1]，因此，從動物軟骨及結(jié)締組織中分離得到的硫酸軟骨素由于具有抗炎[2-3]、抗凝血[4-5]、抗氧化[6]、抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖[7]、促進(jìn)骨缺損愈合[8-9]等優(yōu)良特性獲得了極大的關(guān)注。硫酸軟骨素是一種硫酸化糖胺聚糖，主要由N-乙酰-D-氨基半乳糖和葡糖醛酸重復(fù)連接而成[10]，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分化，使其可用于成軟骨和成骨構(gòu)建體[9]，目前已被廣泛用于治療骨關(guān)節(jié)炎的營養(yǎng)保健品和藥品中。

鹿骨是鹿科的骨架，作為一種中藥成分，其富含大量蛋白質(zhì)、膠原蛋白、軟骨素、磷脂等成分，有助于促進(jìn)膠原蛋白的合成、體內(nèi)軟骨成骨[11]，能夠強(qiáng)健肌腱，緩解老年患者的關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)炎等癥狀[12]。郭曉琳等[13]研究發(fā)現(xiàn)了梅花鹿骨粉可以明顯改善骨質(zhì)疏松癥；王旭東等[14]研究發(fā)現(xiàn)鹿骨可以改善骨質(zhì)疏松癥，明顯增加骨小梁成分；有研究表明，鹿骨提取物可以改善小鼠絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥癥狀，同時(shí)對小鼠腸道菌群也有促進(jìn)作用[15]。

目前保健品的需求隨著人們對自身健康的關(guān)注不斷增加，功能性食品的安全性也逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前對于硫酸軟骨素和馬鹿骨治療骨關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)問題的作用已有報(bào)道，但二者復(fù)合使用的安全性及效果卻鮮少闡明[12]。本試驗(yàn)根據(jù)《保健食品功能檢驗(yàn)與評價(jià)方法（2022 年版）征求意見稿》[16]，研究以硫酸軟骨素、馬鹿骨、鹽酸氨基葡萄糖為主要成分的馬鹿骨膠囊對增加骨密度性能的影響及安全性評價(jià)，以期為增加骨密度相關(guān)的保健品及藥品安全應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鹿骨膠囊 自制，標(biāo)志性成分及含量為：鹽酸氨基葡萄糖（12 g/100 g）、硫酸軟骨素（6 g/100 g）；膠囊的主要原料為鹽酸氨基葡萄糖、馬鹿骨、硫酸軟骨素鈉；用于細(xì)菌回復(fù)突變的菌株TA97、TA98、TA100、TA102 均購自上海北諾生物科技有限公司；疊氮化鈉（NaN3）、1,8-二羥基蒽醌（Dan）、2-氨基芴（2-AF）

FIuka 公司；絲裂霉素C 浙江海正藥業(yè)股份有限公司；碳酸鈣 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)樣品均采用純水配制和稀釋。

SPF 級成年雌性 SD 大鼠 130 只，雄性 SD 大鼠30 只 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK（川）2013-19；200 只昆明種小鼠雌雄各半 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0011，飼養(yǎng)于屏障級動物房，條件為溫度20～26 ℃，濕度40%～70%。

AU480 全自動生化分析儀 Beckmen Coulter實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；Medonic M-series TD 全自動血液細(xì)胞分析儀 布爾醫(yī)療設(shè)備（北京）有限公司；小動物全自動高分辨率X 光機(jī) Bruker In-Vivo DXS Pro公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品制備 洗凈檢驗(yàn)合格的馬鹿骨首先進(jìn)行脫脂處理，用3～6 倍量水煎煮2～5 次，每隔2 h換水一次，之后在55～60 ℃下進(jìn)行干燥，粉碎后過100 目篩得到馬鹿骨粉。將馬鹿骨粉、鹽酸氨基葡萄糖和硫酸軟骨素鈉混合30 min 得到混合粉，用70%乙醇制軟材，16 目制粒，之后在55～60 ℃下進(jìn)行干燥，14 目整粒獲得顆粒和粉末，裝入0 號明膠空心膠囊，0.4 g/粒，檢驗(yàn)包裝即得。

1.2.2 增加骨密度試驗(yàn) 大鼠隨機(jī)分為六組：假手術(shù)組、模型對照組（卵巢切除模型）、高劑量碳酸鈣組、馬鹿骨膠囊三個(gè)劑量組，每組12 只。假手術(shù)組手術(shù)：腹腔麻醉后切除小腸系膜；模型對照組和馬鹿骨膠囊三個(gè)劑量組手術(shù)：麻醉方法同上，摘除雙側(cè)卵巢后止血縫合。術(shù)后四天，假手術(shù)組和模型對照組用純水灌胃；高劑量碳酸鈣組口服192 mg/kg·bw 的碳酸鈣（該劑量相當(dāng)于馬鹿骨膠囊高劑量組鈣水平，馬鹿骨膠囊樣品中碳酸鈣含量為6.4 g 鈣/100 g 樣品，高劑量組1200 mg/kg·bw 中，含鈣為76.8 mg/kg·bw，換算成碳酸鈣：192 mg/kg·bw）。馬鹿骨膠囊分為三個(gè)劑量組，即200、400 和1200 mg/kg·bw 組（分別相當(dāng)于馬鹿骨膠囊人體攝入量40 mg/kg·bw 的5、10和30 倍）。所有動物均以10 mL/kg·bw 進(jìn)行灌胃，持續(xù)90 d，每周根據(jù)體重調(diào)整灌胃量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取右側(cè)股骨，于105 ℃烤至恒重后稱量骨重。用小動物全自動高分辨率X 光機(jī)測定大鼠左股骨樣品的骨密度（測定條件—exposure time：1 min；binning：none；KVP：45；X-RAY Fliter：0.8 mm；f-stop：2.51；FOV：120 mm; Focal Plane：20 mm）。采用原子吸收分光光度法測定右股骨骨鈣含量[17]。

1.2.3 安全性毒理學(xué)評價(jià)試驗(yàn)

1.2.3.1 急性毒性試驗(yàn) 稱取馬鹿骨膠囊90 g，加純水至240 mL，間隔4 h 按2 mL/100 g·bw 空腹灌胃2 次。根據(jù)大鼠最大耐受量判斷馬鹿骨膠囊的急性毒性[18]。

1.2.3.2 遺傳毒性試驗(yàn)Ames 試驗(yàn) 用TA97、TA98、TA100 和TA102 菌株進(jìn)行有無大鼠肝S9 的標(biāo)準(zhǔn)平皿摻入法試驗(yàn)。設(shè)五個(gè)馬鹿骨膠囊劑量：8、40、200、1000 和5000 μg/皿，設(shè)自發(fā)對照、溶劑對照（純水100 μL/皿）和陽性對照。不加S9 試驗(yàn)的陽性對照為0.2 μg/皿的2,4,7-三硝基-9-芴酮（TA97、TA98），1.5 μg/皿的疊氮化鈉（TA100），0.5 μg/皿的絲裂霉素C（TA102）；加S9 試驗(yàn)的陽性對照為10 μg/皿的2-氨基芴（TA97、TA98、TA100）和50 μg/皿的1,8-二羥基蒽醌（TA102）。每個(gè)劑量平行三次[18]。

1.2.3.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 昆明種小鼠（體重25～30 g）隨機(jī)分為5 組，每組10 只，雌雄各半，設(shè)2.5、5.0 和10.0 g/kg·bw 三個(gè)馬鹿骨膠囊試驗(yàn)組，另設(shè)陰性對照（純水）、陽性對照（環(huán)磷酰胺40 mg/kg·bw）組。灌胃后24 小時(shí)再次經(jīng)口灌胃，6 小時(shí)處死動物制片。計(jì)數(shù)一千個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE）和兩百個(gè)紅細(xì)胞中PCE 和成熟紅細(xì)胞（NCE）所占數(shù)目，并計(jì)算比值[18]。

1.2.3.4 小鼠精子畸形試驗(yàn) 設(shè)2.5、5.0 和10.0 g/kg·bw三個(gè)馬鹿骨膠囊試驗(yàn)組，另設(shè)陰性對照和陽性對照組。按2 mL/100 g·bw 經(jīng)口灌胃5 d。30 d 后取雙側(cè)附睪制片，記錄不同類型畸形精子數(shù)[18]。

1.2.3.5 大鼠4 周喂養(yǎng)試驗(yàn) 設(shè)對照組（基礎(chǔ)飼料）和1.2、2.8 和4.0 g/kg·bw 三個(gè)馬鹿骨膠囊劑量組。大鼠4 周自由進(jìn)食和飲水，每天灌胃一次，每周測定大鼠體重、兩次給食量和剩食量以及攝食量，4 周后處死動物（處死前禁食16 h），進(jìn)行血清生化學(xué)及組織病理學(xué)檢查[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用PEMS 3.1 統(tǒng)計(jì)軟件包，各組數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS 21.0 進(jìn)行分析，試驗(yàn)均數(shù)比較使用方差分析，方差不齊采用秩和檢驗(yàn)，骨密度實(shí)驗(yàn)中模型組和假手術(shù)組間的差異比較使用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鹿骨膠囊增加骨密度評價(jià)結(jié)果

2.1.1 馬鹿骨膠囊對大鼠體重的影響 對六組小鼠持續(xù)灌胃90 d，試驗(yàn)前（第1 d）、試驗(yàn)中（第45 d）、試驗(yàn)?zāi)ǖ?0 d）各組小鼠體重如圖1 所示，試驗(yàn)之前各組小鼠的體重?zé)o顯著差異（P>0.05）；試驗(yàn)中期和試驗(yàn)后期，模型對照組體重均極顯著高于假手術(shù)組（P<0.01），說明卵巢切除模型建立成功。馬鹿骨膠囊三個(gè)劑量組的體重在試驗(yàn)第1 d 開始至試驗(yàn)90 d結(jié)束與模型對照組比較均無顯著性差異（P>0.05），說明連續(xù)飼喂馬鹿骨膠囊不會對小鼠體重產(chǎn)生顯著影響。

圖1 馬鹿骨膠囊對大鼠體重的影響Fig.1 Effects of Malugu capsule on weight of rats

2.1.2 馬鹿骨膠囊對大鼠骨密度含量的影響 連續(xù)灌胃90 d 后分別測定各組小鼠的右股骨骨重、左股骨骨密度和右股骨骨鈣含量。由圖2 可見，模型對照組的骨密度為0.6307 g/cm3，骨鈣含量為236.073 mg/g，極顯著低于假手術(shù)組骨密度0.6663 g/cm3，骨鈣含量267.113 mg/g（P<0.01）。馬鹿骨膠囊三個(gè)劑量組的骨重與骨鈣含量與模型對照組比較無顯著差異（P>0.05），馬鹿骨膠囊三個(gè)劑量組的左股骨骨密度分別為0.6651 、0.6560、0.6605 g/cm3顯著高于模型對照組0.6307 g/cm3（P<0.05），這與蘇輝等[19]的研究結(jié)果一致。高劑量組與碳酸鈣組比較無顯著性差異（P>0.05）。馬鹿骨膠囊三個(gè)劑量組的骨重、骨密度和骨鈣含量之間卻沒有顯著差異，可能是由于三個(gè)劑量組之間劑量差異過大導(dǎo)致。

圖2 馬鹿骨膠囊對大鼠骨重、骨密度及骨鈣含量的影響Fig.2 Effects of Malugu capsule on bone weight, bone mineral density and bone calcium content in rats

2.2 馬鹿骨膠囊安全性評價(jià)結(jié)果

2.2.1 大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 15 g/kg·bw 劑量的馬鹿骨膠囊灌胃后，14 d 內(nèi)大鼠生長正常，行為敏捷，無死亡或不良反應(yīng)，結(jié)果見表1。說明馬鹿骨膠囊應(yīng)屬無毒級產(chǎn)品。

表1 大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of acute toxicity test in rats

2.2.2 遺傳毒性試驗(yàn) Ames 試驗(yàn)結(jié)果如表2 和表3所示，2 次測試中，無論體系是否存在S9 試驗(yàn)，自發(fā)對照組的回變菌落數(shù)均為正常值，而陽性對照組數(shù)值遠(yuǎn)高于自發(fā)對照組，呈陽性反應(yīng)。馬鹿骨膠囊各組的數(shù)值均小于2 倍數(shù)量的自發(fā)對照組的數(shù)值，呈陰性，表明S9 添加與否，馬鹿骨膠囊均不會誘發(fā)菌株突變。

表2 第一次Ames 試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the first Ames test

表3 第二次Ames 試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the second Ames test

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果如表4 所示，雄鼠和雌鼠的PCE/NCE 比值與陰性對照組比較均無顯著性差異（P>0.05）。陽性對照組雌、雄動物的微核率分別為21.4%和21.0%，顯著高于陰性對照組0.8%（P<0.05），試驗(yàn)各組的微核率相比陰性對照無明顯差異（P>0.05），說明馬鹿骨膠囊不會造成小鼠骨髓細(xì)胞的突變。

表4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result of micronucleus test in mouse bone marrow cell

小鼠精子畸形試驗(yàn)如表5 所示，陽性對照組的精子畸形率為5.52%，陰性對照為2.22%，有明顯差異（P<0.05），馬鹿骨膠囊各組的精子畸形率分別為2.22%、2.06%、2.28%，相對陰性對照無顯著性差異（P>0.05），表明馬鹿骨膠囊對小鼠精子無致畸性作用。

表5 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of sperm malformation test in mice

2.2.3 大鼠4 周喂養(yǎng)試驗(yàn) 30 d 喂養(yǎng)期間，大鼠健康狀況良好，無中毒及非正常表現(xiàn)。當(dāng)馬鹿骨膠囊劑量為人體推薦攝入量100 倍時(shí)，沒有對大鼠組織形態(tài)、器官等指標(biāo)造成顯著影響，表明馬鹿骨膠囊的最大無作用劑量大于4.0 g/kg·bw。

馬鹿骨膠囊對大鼠體重的影響如圖3 所示，各劑量組的動物周體重與對照組比較均無顯著性差異（P>0.05）。表明馬鹿骨膠囊不會影響大鼠體重及食物利用率。綜上所述，馬鹿骨膠囊不會導(dǎo)致受試物身體的損害性改變。

圖3 30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn)雄鼠（A）和雌鼠（B）體重變化Fig.3 Changes in body weight of male (A) and female (B) rats during the 30 d feeding experiment

3 討論與結(jié)論

本研究對馬鹿骨膠囊的增加骨密度性能進(jìn)行了評價(jià)。在成功建立切除卵巢模型的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)組的實(shí)驗(yàn)中期和末期體重與模型對照組比較均無顯著性差異。試驗(yàn)各組的左股骨骨密度顯著高于對照組。按照評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：馬鹿骨膠囊具有增加骨密度功能。本研究同時(shí)對馬鹿骨膠囊的安全性進(jìn)行了評價(jià)。馬鹿骨膠囊經(jīng)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)屬無毒級別；遺傳毒性試驗(yàn)表明馬鹿骨膠囊不會導(dǎo)致骨髓細(xì)胞突變，不影響精子畸形率；連續(xù)30 d 喂養(yǎng)馬鹿骨膠囊不會導(dǎo)致動物身體的異常變化。

馬鹿骨膠囊所用原料鹽酸氨基葡萄糖、馬鹿骨、硫酸軟骨素鈉的安全性在長期研究中得到驗(yàn)證。鹽酸氨基葡萄糖可以提高軟骨細(xì)胞的修復(fù)能力，從而改善關(guān)節(jié)活動度，緩解疼痛[20]、提高免疫[21]。目前已有很多學(xué)者研究對于治療骨關(guān)節(jié)疾病的藥物復(fù)配的治療情況，有研究表示骨癆愈康丸聯(lián)合鹽酸氨基葡萄糖能有效抑制炎性因子[22]；補(bǔ)腎壯筋湯聯(lián)合鹽酸氨基葡萄糖能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞中膠原蛋白的表達(dá)，降低軟骨細(xì)胞的凋亡水平[23]。顏晨燕等[24]將鯊魚軟骨的硫酸軟骨素和膠原蛋白復(fù)配，發(fā)現(xiàn)了該配方能改善骨關(guān)節(jié)炎，恢復(fù)關(guān)節(jié)軟骨中流失的膠原蛋白。

近年來硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖用以改善骨關(guān)節(jié)性能的研究十分廣泛[25-28]，但對于硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖與馬鹿骨的復(fù)配研究卻非常少。馬鹿骨作為一種中藥藥材，傳統(tǒng)上常將其用于防治各種骨關(guān)節(jié)疾病，認(rèn)為其具有生髓、補(bǔ)髓，減緩骨髓老化，恢復(fù)骨髓年輕態(tài)的功效[29]。目前大多數(shù)馬鹿骨研究集中在其成分分析和制備方法上，對其詳細(xì)的功能和安全性評價(jià)的研究較少。研究表明，馬鹿骨含有大量的人體所需的營養(yǎng)保健物質(zhì)以及磷脂質(zhì)、糖蛋白、維生素，多種礦物質(zhì)元素如鈣、鎂、鐵、鋅、鉀、銅等，鹿骨的軟骨中還富含大量的酸性粘多糖及其衍生物，具有重要的生理功能和多種藥理活性[30]。鹿骨中的膠原蛋白含量也較高，可作為功能性食品開發(fā)的重要原料[31]。馬鹿骨膠能明顯增強(qiáng)小鼠耐缺氧、抗疲勞、耐寒及耐高溫能力，能增強(qiáng)正常和免疫抑制小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能[32]。

鹿骨粉在臨床上能夠治療繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，緩解患者臨床骨痛的癥狀，提高患者的骨密度[33]。有報(bào)道顯示，梅花鹿骨粉對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠也表現(xiàn)出良好的治療作用[13]。然而，以鹿骨粉與其它成分復(fù)配進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)、功能測定和安全性評價(jià)的研究較少，曾有學(xué)者用鹿骨以及補(bǔ)骨脂等為主要成分研制了一種壯骨泡騰片，但是對其骨密度增強(qiáng)效果及安全性未做系統(tǒng)評價(jià)[34]。

本試驗(yàn)將具有預(yù)防和改善骨關(guān)節(jié)性能的鹽酸氨基葡萄糖、馬鹿骨、硫酸軟骨素鈉進(jìn)行復(fù)配，研究其是否具有增加骨密度的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對于增加大鼠骨密度具有良好作用，且安全性良好，無有毒或不良反應(yīng)產(chǎn)生，本試驗(yàn)為馬鹿骨作為保健品原料提供一定的理論依據(jù)，但馬鹿骨和硫酸軟骨素復(fù)配作用的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究論證。