邱 爽，張新科，王東亮,*

（1.北京小仙燉生物科技有限公司，北京 100020；2.河北省燕窩鮮燉技術(shù)創(chuàng)新中心，河北廊坊 065700；3.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250012）

燕窩（Edible bird's nest, EBN）是由雨燕科金絲燕在繁殖季節(jié)分泌出的唾液與羽毛在天然洞穴或墻壁中凝結(jié)筑就的巢穴，用于產(chǎn)卵及孵育雛燕。燕窩主要產(chǎn)于印度尼西亞、馬來西亞、泰國和越南等東南亞國家以及中國南部[1]。燕窩在中國的食用歷史可追溯到唐朝（公元618～907 年）[2]?，F(xiàn)代研究表明，蛋白質(zhì)是燕窩中最主要的營養(yǎng)成分，占比高達(dá)50%。燕窩中還包含唾液酸、碳水化合物、氨基酸、礦物質(zhì)元素等多種營養(yǎng)成分，具有美白、抗炎、抗氧化、抗病毒、促進(jìn)骨骼健康、促進(jìn)智力發(fā)育等多種功效[3-4]。傳統(tǒng)上的燕窩指的是洞燕，即金絲燕在天然洞穴或懸崖峭壁上筑巢，由當(dāng)?shù)鼐用癫烧⒓庸ざ傻氖秤醚喔C。20 世紀(jì)80 年代以來，不少國家開始發(fā)展屋燕產(chǎn)業(yè)，通過模擬金絲燕棲息地建造燕屋，吸引金絲燕前來筑巢。屋燕的發(fā)展不僅方便農(nóng)戶采摘，也有利于燕窩原料品質(zhì)的把控，逐漸成為燕窩主流產(chǎn)品[5-7]。

近年來，燕窩研究主要集中在燕窩成分、功效、真?zhèn)舞b別、加工工藝、質(zhì)量控制等方向。其中燕窩營養(yǎng)價值的物質(zhì)基礎(chǔ)和真?zhèn)舞b別一直是燕窩行業(yè)的研究重點。從營養(yǎng)價值考慮，許多消費者認(rèn)為暗紅色的洞燕摻有金絲燕的血液，對人體健康有更高的益處，因此其價格甚至超出屋燕兩倍[8-9]。但實際上屋燕與洞燕的營養(yǎng)差異還未被研究透徹。對于真?zhèn)舞b別，許多不法商家將便宜的白燕窩熏制、染色偽造成血燕（即洞燕），影響燕窩行業(yè)的發(fā)展[10]。可見，只有明確屋燕與洞燕營養(yǎng)差異才能更好的為燕窩原料篩選提供依據(jù)，闡明二者的區(qū)分方法對于消費者認(rèn)知和燕窩行業(yè)的發(fā)展也至關(guān)重要。目前已有部分研究對屋燕與洞燕的化學(xué)組成進(jìn)行了對比。研究表明，屋燕唾液酸含量高于洞燕，而洞燕含有更高的鈣和亞硝酸鹽[11]。Shim 等[12]利用掃描電鏡和光譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)洞燕含有的方解石晶簇是造成屋燕與洞燕差異的關(guān)鍵。此外，有研究通過元素組成對屋燕和洞燕進(jìn)行區(qū)分，如Ma 等[13]對燕窩中礦物質(zhì)元素進(jìn)行檢測，應(yīng)用線性判別分析（Linear discriminant analysis, LDA）結(jié)合交叉驗證建模發(fā)現(xiàn)以Na/Ca 為變量的LDA 預(yù)測模型能夠準(zhǔn)確區(qū)分屋燕與洞燕種類。同樣Ang 等[8]利用礦物質(zhì)比率對屋燕和洞燕樣本進(jìn)行邏輯回歸模型分析，補(bǔ)充Mg/K 組成的模型也可準(zhǔn)確區(qū)分燕窩種類。除礦物質(zhì)元素外，Lee 等[14]通過高效液相色譜（High performance liquid chromatography, HPLC）結(jié)合聚類分析、主成分分析和偏最小二乘判別分析，以氨基酸為指標(biāo)建模應(yīng)用于燕窩產(chǎn)區(qū)的鑒別。

然而，上述研究并未對屋燕與洞燕中的營養(yǎng)成分及危害因子進(jìn)行全面檢測對比，對于二者的差異，僅以某些特定的常量元素或氨基酸為指標(biāo)進(jìn)行區(qū)分過于片面，且并未闡明造成屋燕與洞燕營養(yǎng)差異的關(guān)鍵組分。基于此，本文以屋燕和洞燕為研究對象，利用HPLC、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（Inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）、氨基酸分析儀等多種技術(shù)手段對燕窩中主要的營養(yǎng)成分以及危害因子進(jìn)行全面測定，探究二者組成成分的差異。對比以往研究，本研究創(chuàng)新地利用PLSR 分析燕窩組成成分，篩選出了屋燕與洞燕組成成分的關(guān)鍵差異物，研究結(jié)果將有助于更好地區(qū)分屋燕與洞燕的營養(yǎng)差異，對揭示造成二者營養(yǎng)差異的關(guān)鍵組分有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

目前我國允許進(jìn)口燕窩的國家僅有馬來西亞、印度尼西亞、越南和泰國，其中以馬來西亞為主。馬來西亞、印度尼西亞和越南僅允許屋燕進(jìn)口，《質(zhì)檢總局關(guān)于進(jìn)口泰國燕窩產(chǎn)品檢驗檢疫要求的公告》（2017 年第66 號）中明確規(guī)定我國僅允許泰國洞燕進(jìn)口。因此本研究選用的4 種燕窩原料分別采購于馬來西亞與泰國：兩種泰國洞燕為TL1-Cave EBN和TL2-Cave EBN，兩種馬來西亞屋燕為MAS1-House EBN 和MAS2-House EBN。燕窩原料采購后儲藏于干燥箱中待后續(xù)分析。

無水乙醇 色譜純，上海安普實驗科技有限公司；鹽酸 分析純，北京世紀(jì)科博科技發(fā)展有限公司；檸檬酸鈉、硫酸氫鈉、辛酸、硼酸、氫氧化鈉 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；高氯酸 優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；16 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（丙氨酸、絲氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、精氨酸、組氨酸、纈氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、賴氨酸、酪氨酸） 色譜純，北京索萊寶科技有限公司；衍生液試劑 日本島津公司；唾液酸 色譜純，上海麥克林生化科技有限公司。

Mettler AG135 型分析天平 瑞士梅特勒公司；101-0AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 林茂科技（北京）有限公司；1260 型液相色譜儀、Agilent ZORBAX SBC18（4.6×150 mm，5 μm）毛細(xì)管色譜柱 美國Agilent公司；LC-16AAA 型全自動氨基酸分析儀、Shim-pack Amino-Na（6.0×100 mm，5 μm）色譜柱 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的檢測 燕窩中蛋白質(zhì)的檢測參考國標(biāo)《GB 5009.5-2016 食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法進(jìn)行。

1.2.2 氨基酸的檢測

1.2.2.1 樣品制備 樣品的制備方法參考穆闖錄[15]的研究，取適量燕窩樣品于105 ℃烘干2 h，用研缽研成細(xì)粉混勻。稱取0.5 g 燕窩干粉于水解管中，加入10 mL 6 mol/L 鹽酸溶液，充氮氣后于110 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)水解22 h。水解結(jié)束后取出，冷卻至室溫。將水解液過濾至50 mL 容量瓶中，去離子水定容混勻。準(zhǔn)確吸取1 mL 濾液至離心管中，40 ℃氮氣吹干，用1 mL 0.2 mol/L 檸檬酸鈉緩沖溶液溶解后混勻，0.22 μm 孔徑有機(jī)濾膜過濾后上樣檢測。其中檸檬酸鈉緩沖液制備方法為：稱取19.6 g檸檬酸鈉加入500 mL 去離子水溶解，加入16.5 mL鹽酸并用水稀釋至1000 mL 混勻，用6 mol/L 鹽酸溶液或500 g/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH2.2。

1.2.2.2 氨基酸自動分析儀檢測方法 采用全自動氨基酸分析儀對燕窩原料中氨基酸組成進(jìn)行檢測，色譜柱型號為Shim-pack Amino-Na（6.0×100 mm，5 μm）。將混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液注入氨基酸自動分析儀，參照《JJG1064—2011 氨基酸分析儀檢定規(guī)程及儀器說明書》調(diào)整儀器參數(shù)和洗脫液配比進(jìn)行檢測。各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品測定液分別以相同體積注入氨基酸分析儀，通過對比樣品中檢測出的氨基酸與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進(jìn)行定性，以外標(biāo)法通過峰面積計算樣品氨基酸的濃度。流動相A、B 均為檸檬酸鈉溶液，流動相C 為0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液。其中流動相A 的配制方法為：稱取19.6 g 檸檬酸鈉溶解于800 mL 去離子水中，添加55.3 g 無水乙醇、22.75 g 高氯酸、0.1 mL 辛酸，轉(zhuǎn)移至1 L 容量瓶中水定容，抽濾備用，溶液pH 約為3.24；流動相B 的配制方法為：稱取58.8 g 檸檬酸鈉、12.4 g 硼酸溶解于900 mL 去離子水中，加入0.1 mL辛酸、32.5 mL 4 mol/L 的氫氧化鈉溶液，轉(zhuǎn)移至1 L 容量瓶中水定容，抽濾備用，溶液pH 約為10.00。泵3 為衍生液試劑。泵1、泵2 流速分別為0.6、0.2 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，分離柱柱溫為60 ℃，衍生柱柱溫為130 ℃，檢測器為紫外可見光檢測器，檢測波長為570 nm 和440 nm。具體洗脫程序見表1。

表1 氨基酸檢測洗脫程序（%）Table 1 Elution program of amino acids detection (%)

1.2.3 唾液酸的檢測

1.2.3.1 樣品制備 參考王羚酈等[16]的方法制備樣品：稱取10 mg 燕窩干粉，加入0.5 mol/L 的硫酸氫鈉水溶液1 mL，于80 ℃水浴中水解30 min，水浴結(jié)束待其冷卻至室溫后進(jìn)行衍生化反應(yīng)。取上述溶液200 μL，加入20 mg/mL 鄰苯二胺鹽酸鹽（0.25 mol/L的硫酸氫鈉溶液溶解）200 μL，再置于80 ℃水浴中加熱40 min。水浴結(jié)束后冷卻至室溫，將該溶液于8000 r/min、4 ℃條件下離心5 min，經(jīng)0.22 μm 孔徑有機(jī)濾膜過濾后上樣檢測。準(zhǔn)確稱取唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加入0.5 mol/L 的硫酸氫鈉水溶液定容至2 mL，得到5 mg/mL 的母液備用。通過對比樣品中檢測出的唾液酸與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進(jìn)行定性，以外標(biāo)法定量。

1.2.3.2 HPLC 分析 采用1260 型液相色譜儀對燕窩原料中唾液酸進(jìn)行檢測，液相色譜柱型號為Agilent ZORBAX SB-C 18（4.6×150 mm，5 μm）。檢測方法參照王羚酈等[16]并稍作修改，具體方法如下：流動相 A 為水，B 相為乙腈。流動相洗脫程序為：0～10 min, 10% B；10～11 min, 10%～95% B；11～20 min,95% B；20～21 min, 95%～10% B；21～30 min, 10% B。流動相流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為330 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.4 元素的檢測 燕窩中鈣、鈉、鎂、鐵、錳、銅、鋅、硒、砷的檢測參考國標(biāo)《GB 5009.268-2016 食品中多元素的測定》中電感耦合等離子體質(zhì)譜法；磷的檢測參考國標(biāo)《GB 5009.87-2016 食品中磷的測定》中鉬藍(lán)分光光度法；碘的檢測參考國標(biāo)《GB 5009.267-2020 食品中碘的測定》中氣相色譜法；汞的檢測參考國標(biāo)《GB 5009.17-2021 食品中總汞及有機(jī)汞的測定》中原子熒光光譜法；鉛的檢測參考國標(biāo)《GB 5009.12-2017 食品中鉛的測定》中石墨爐原子吸收光譜法；鎘的檢測參考國標(biāo)《GB 5009.15-2014 食品中鎘的測定》；鉻的檢測參考國標(biāo)《GB 5009.123-2014 食品中鉻的測定》。

1.2.5 亞硝酸鹽的檢測 燕窩中亞硝酸鹽的檢測參考國標(biāo)《GB 5009.33-2016 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中分光光度法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)計算采用Excel 2019（Microsoft, USA）進(jìn)行；顯著性差異分析選用IBM SPSS 25.0（SPSS Inc.,Chicago, IL, USA）中的Duncan test 和T-test 進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05 表示差異顯著。PLSR 分析由SIMCA 14.1 分析繪制，蛋白質(zhì)及唾液酸柱狀圖由Sigma Plot 14.0 分析繪制，箱線圖、熱圖均由R 4.1.1 分析繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)及唾液酸結(jié)果分析

蛋白質(zhì)和唾液酸是燕窩中重要的營養(yǎng)成分。從圖1 中可以看出4 種燕窩原料蛋白質(zhì)含量為63.09～67.79 g/100 g，略高于之前研究得出的燕窩蛋白含量在50%～60%之間[17]。相比于旱季，金絲燕在雨季的食物更加充沛，通常燕窩品質(zhì)更高，加上金絲燕在旱季換羽，因而旱季采摘的燕窩沾有較多羽毛和雜質(zhì)[18]。本研究所用樣品均為雨季燕窩，這可能是燕窩蛋白質(zhì)含量較高的重要原因。中國營養(yǎng)學(xué)會提出成年人膳食營養(yǎng)素參考攝入量（DRI）中蛋白質(zhì)為男性65 g/d和女性55 g/d[19]，因此每100 g 燕窩可為人體每日提供充足的蛋白質(zhì)營養(yǎng)。TL1-Cave EBN 中蛋白質(zhì)含量為63.09 g/100 g，顯著低于其他3 種燕窩樣品（P<0.05）。雖然TL2-Cave EBN 中蛋白質(zhì)含量并未與兩種屋燕蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)顯著差異（P>0.05），但還是可以看出屋燕中蛋白質(zhì)含量高于洞燕，可能是因為研究所用原料未經(jīng)挑揀除雜等加工處理，在人工干預(yù)下屋燕的棲息環(huán)境優(yōu)于洞燕，因而羽毛和雜質(zhì)更少。此外，產(chǎn)地不同也是造成燕窩蛋白含量差異的重要原因之一，特別是產(chǎn)地差異導(dǎo)致金絲燕生存的氣候環(huán)境、飲食特點不同，進(jìn)而影響著燕窩的品質(zhì)[17]。蛋白質(zhì)占據(jù)燕窩組成的50%以上，表明燕窩是良好的蛋白來源。因此后續(xù)進(jìn)一步研究其氨基酸單體組成，以更好地表征燕窩的蛋白質(zhì)來源。

圖1 燕窩蛋白質(zhì)及唾液酸含量柱形圖Fig.1 Bar charts of protein and sialic acid contents in EBN

唾液酸又名N-乙酰神經(jīng)氨酸，是一類含有9-碳骨架的酸性單糖，在大腦中含量最高，是神經(jīng)節(jié)苷脂的重要組成成分，對大腦和神經(jīng)系統(tǒng)的產(chǎn)生和發(fā)育具有非常重要的作用[20]。燕窩是唾液酸的重要來源，許多研究將燕窩促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育的功效歸因于唾液酸的存在[21-22]。本研究中，4 種原料唾液酸含量范圍為7.22～10.41 g/100 g。屋燕與洞燕中唾液酸含量不同，雖然僅在MAS1-House EBN 與TL2-Cave EBN 樣品間唾液酸含量呈現(xiàn)出顯著差異（P<0.05），但整體來看屋燕中唾液酸含量高于洞燕。唾液酸含量受地理來源和生產(chǎn)環(huán)境的影響，馬來西亞和泰國不同的氣候特點導(dǎo)致金絲燕的生活習(xí)性差異，進(jìn)而影響唾液酸含量[17]。除產(chǎn)地影響外，金絲燕的生存環(huán)境是造成該現(xiàn)象的關(guān)鍵原因。巖洞等自然環(huán)境下存在諸多不可控因素，微生物的生長、代謝水平高于屋燕，從而增加了微生物酶促反應(yīng)導(dǎo)致唾液酸的降解[23]。

2.2 氨基酸結(jié)果分析

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元，是人體進(jìn)行正常代謝、維持生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究在燕窩中共檢測到16 種氨基酸，包括8 種必需氨基酸（Essential amino acid, EAA）：亮氨酸（Leucine,Leu）、異亮氨酸（Isoleucine, Ile）、組氨酸（Histidine,His）、纈氨酸（Valine, Val）、蘇氨酸（Threonine,Thr）、苯丙氨酸（Phenylalanine, Phe）、蛋氨酸（Methionine, Met）、賴氨酸（Lysine, Lys）和8 種非必需氨基酸（Non-essential amino acid, NEAA）：丙氨酸（Alanine, Ala）、絲氨酸（Serine, Ser）、天冬氨酸（Aspartic acid, Asp）、甘氨酸（Glycine, Gly）、精氨酸（Arginine, Arg）、脯氨酸（Proline, Pro）、谷氨酸（Glutamic acid, Glu）、酪氨酸（Tyrosine, Tyr），16 種氨基酸混標(biāo)的分離色譜圖見圖2。

圖2 16 種氨基酸混標(biāo)的分離色譜圖Fig.2 Total ion chromatography of 16 amino acids in the mixed standard

4 種燕窩原料總氨基酸（Total amino acid, TAA）含量范圍為43.82～47.04 g/100 g，具體含量見表2。在所有燕窩樣品中，Leu、Val、Thr 和Phe 是主要的EAA，Ser、Asp 和Pro 是主要的NEAA，這與Chantakun 等[11]和Chua 等[24]的研究結(jié)果類似。此外，燕窩中幾乎所有的氨基酸含量均比牛奶、雞蛋高，特別是EAA 含量（20.81～22.04 g/100 g）明顯高于牛奶（2.9 g/100 g）、雞蛋（11～17 g/100 g）和嬰幼兒奶粉（9.6 g/100 g）[24]，表明燕窩是良好的氨基酸來源，高含量的氨基酸有助于人體蛋白質(zhì)的合成。值得注意的是，燕窩中存在的Lys 在大多數(shù)植物蛋白質(zhì)中都不存在[25]，這表明燕窩可以為素食者提供更為完整的氨基酸。

表2 燕窩中氨基酸組成及含量（g/100 g）Table 2 Composition and content of amino acids in EBN (g/100 g)

具體來看，TL1-Cave EBN 總氨基酸含量最高，為47.04 g /100 g，除Glu 和His 外，該樣品在其余氨基酸含量上均占據(jù)明顯優(yōu)勢。TL2-Cave EBN 總氨基酸含量次之，且洞燕總氨基酸含量高于屋燕。燕窩中EAA 含量范圍為20.81～22.04 g/100 g，且TL1-Cave EBN>TL2-Cave EBN>MAS1-House EBN>MAS2-House EBN，其中洞燕EAA 含量顯著高于屋燕（P<0.05）。EAA 指人體無法合成或合成速率無法滿足機(jī)體需求，需從食物中獲取的氨基酸。4 種燕窩原料必需氨基酸占總氨基酸的比率均在45.76%～47.60%之間，符合FAO/WHO 推薦的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)40%的標(biāo)準(zhǔn)。Shim 等[12]認(rèn)為巖洞大氣中亞硝酸等活性氮成分含量更高，可硝酸化酪氨酸并使糖蛋白中存在的谷氨酸脫氨，從而降低洞燕中這些氨基酸的含量，這解釋了洞燕在兩種氨基酸上不占優(yōu)勢的原因。

氨基酸組成、比例及相互作用也是影響食品風(fēng)味的重要因素，根據(jù)呈味特性可劃分為鮮味、甜味和苦味氨基酸[26]，目前少有文獻(xiàn)對燕窩中呈味氨基酸組成進(jìn)行分析，本研究對屋燕與洞燕呈味氨基酸含量及占比進(jìn)行初探。3 類呈味氨基酸在燕窩原料中分布規(guī)律一致，苦味氨基酸是燕窩中最主要的呈味氨基酸，占比高達(dá)50%，甜味氨基酸次之，最后是鮮味氨基酸。對比屋燕與洞燕呈味氨基酸含量，洞燕中甜味和苦味氨基酸含量顯著高于屋燕（P<0.05），MAS2-House EBN 中鮮味氨基酸含量（8.10 g/100 g）及占比（17.81%）均最高，其次是兩種洞燕。Glu 和Asp 為主要的鮮味氨基酸，由于洞燕高含量活性氮的存在使Glu 脫氨，因而洞燕中Glu 含量顯著低于MAS2-House EBN（P<0.05），使MAS2-House EBN 的鮮味氨基酸含量更高。而其余氨基酸的味覺特點為甜味和苦味，相比于屋燕，洞燕在這些氨基酸的含量上均占據(jù)優(yōu)勢，因而甜味和苦味氨基酸含量更高。

2.3 元素結(jié)果分析

燕窩中的主要礦物質(zhì)含量如表3 所示。TL2-Cave EBN 中礦物質(zhì)元素含量最高（11.71 g/kg），其次是TL1-Cave EBN（11.33 g/kg）、MAS2-House EBN（6.60 g/kg）和MAS1-House EBN（5.54 g/kg）。Ca 和Na 是燕窩中最豐富的礦物質(zhì)，含量范圍分別為4706.67～9426.67 mg/kg 和251～5049.67 mg/kg，其次是Mg（360.67～937.00 mg/kg），這與之前的研究結(jié)果一致[8,11]。三者均是人體必需的常量元素，Ca 是骨骼和牙齒的主要成分，調(diào)控著神經(jīng)傳遞和肌肉收縮，Na 維持著人體電解質(zhì)、滲透壓的平衡，而Mg 負(fù)責(zé)酶的激活[27]，燕窩的高鈣含量解釋了其在提高骨密度、治療骨關(guān)節(jié)炎方向的功效[28-29]。根據(jù)中國營養(yǎng)學(xué)會推薦，Na、Ca 和Mg 的成年人膳食營養(yǎng)素參考攝入量（DRI）分別為1500 、800 和330 mg/d[19]。本研究結(jié)果顯示，每100 g TL2-Cave EBN 可為人體提供每天所需118%的Ca 和28%的Mg，TL1-Cave EBN可提供30%的Na，可見燕窩是良好的礦物質(zhì)來源。值得注意的是，本研究并未在燕窩樣品中檢測到P，可能是因為燕窩中P 含量低于儀器檢出限所致，相關(guān)文獻(xiàn)報道燕窩中P 含量也很低，僅為0.03～6.79 mg/100 g[30-31]。

表3 燕窩中元素組成及含量（mg/kg）Table 3 Composition and content of mineral elements in EBN (mg/kg)

除常量元素外，燕窩中含有Fe（3.39～16.07 mg/kg）、Zn（3.12～7.39 mg/kg）、Cu（3.12～4.10 mg/kg）、I（2.54～3.47 mg/kg）、Se（0.29～0.58 mg/kg）和Mn（0.90～4.22 mg/kg）6 種微量元素，F(xiàn)e 是燕窩中含量最高的微量元素，在洞燕中的含量高出屋燕3～5 倍，F(xiàn)e2+的氧化是導(dǎo)致洞燕呈現(xiàn)紅色的重要原因[32]。本研究顯示每100 g 燕窩可以為人體每天提供至少35%的Cu。Cu 在人體側(cè)腦室下區(qū)大量分布，能夠促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)以及腦部發(fā)育[33]，這可能是燕窩促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育的重要原因之一[21]。整體來看，洞燕在絕大多數(shù)礦物質(zhì)元素含量上均高于屋燕，特別是常量元素含量是屋燕的近2 倍，且均呈現(xiàn)出顯著差異（P<0.05），可能是由于巖壁中礦物質(zhì)滲入燕窩中或氧化所致[2,34]，或洞燕因生活在洞穴等海邊附近，食用的昆蟲等食物中含更高含量的Na、Ca、Mg 和K 元素[35]。

2.4 危害因子結(jié)果分析

燕窩中主要的危害因子含量結(jié)果見圖3。金絲燕排泄物產(chǎn)生NH3的氧化以及燕窩所處環(huán)境的污染是燕窩中亞硝酸鹽的主要來源，此外，血燕的人工熏制過程也會導(dǎo)致亞硝酸鹽的產(chǎn)生，如2011 年發(fā)生的燕窩亞硝酸鹽嚴(yán)重超標(biāo)的“血燕”事件[36-37]。亞硝酸鹽是劇毒物質(zhì)，因此亞硝酸鹽含量一直是評估燕窩安全性的關(guān)鍵指標(biāo)之一。本研究檢測的4 種燕窩原料中MAS1-House EBN 亞硝酸鹽含量為83.74 mg/kg，已不符合我國燕窩進(jìn)口規(guī)定亞硝酸鹽含量不得超出30 mg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)[38]。推測可能是因為樣本的進(jìn)口周期長，原料貯藏條件稍有變動，導(dǎo)致該批次樣品中亞硝酸鹽含量過高。從整體數(shù)據(jù)所呈現(xiàn)的結(jié)果來看，MAS1-House EBN 樣本中其他生理生化指標(biāo)并未受到亞硝酸鹽含量的影響。通過本次檢測，發(fā)現(xiàn)貯藏條件和時間的不同可能會對原料品質(zhì)造成影響，因此后續(xù)實驗將著重研究儲存過程中原料品質(zhì)和貯藏條件之間存在的關(guān)系。T2-Cave EBN 中亞硝酸鹽含量顯著高于MAS2-House EBN（P<0.05），而另一種洞燕T1-Cave EBN 并未與其表現(xiàn)出顯著性差異（P>0.05）。由于屋燕環(huán)境更容易把控，而洞燕周圍散布的糞便等排泄物會被細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生亞硝酸鹽，因此洞燕中亞硝酸鹽含量往往比屋燕高[36]。此外，亞硝酸鹽含量也影響著燕窩原料的顏色，通常認(rèn)為高亞硝酸鹽含量和鐵氧化是使洞燕呈現(xiàn)紅色的主要原因[9,39]。

圖3 燕窩危害因子含量箱線圖Fig.3 Boxplots of the content of hazard factors in EBN

除亞硝酸鹽外，Cd、Cr、Hg、Pb、As 等重金屬也是衡量燕窩食用安全的關(guān)鍵因素，特別是Hg 有劇毒，通過危害神經(jīng)系統(tǒng)使大腦受損。本研究在四種燕窩原料中僅檢測到Hg 和As 兩種重金屬元素，二者含量均低于0.05 mg/kg。TL2-Cave EBN 中Hg 含量顯著高于兩種屋燕（P<0.05），雖然TL1-Cave EBN中Hg 含量略低于MAS2-House EBN，但并未呈現(xiàn)出顯著性差異（P>0.05）。研究僅在TL2-Cave EBN中檢測到As，燕窩原料中本不存在重金屬，金絲燕的飲食和棲息環(huán)境的污染是造成燕窩中存在重金屬元素的主要原因[40]。

2.5 聚類分析

熱圖更直觀地顯示了4 種燕窩原料在各組成成分上的的差異（圖4 A）。具體來說80%以上的氨基酸均聚類在熱圖上半部分，與兩種洞燕及MAS2-House EBN 多呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，其中Met、Ser 和Thr與TL1-Cave EBN 樣本相關(guān)性較強(qiáng)，可作為該樣本的特征氨基酸。蛋白質(zhì)、唾液酸、亞硝酸鹽以及Cu、Zn、I 三種元素位于熱圖中部，蛋白質(zhì)和唾液酸與兩種屋燕相關(guān)性更強(qiáng)，MAS1-House EBN 中Zn 和亞硝酸鹽含量明顯高于其他燕窩原料。His、Phe 和Tyr 均與MAS1-House EBN 展現(xiàn)出了強(qiáng)相關(guān)性，三者均是具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸，且Phe 和Tyr 存在著相似的合成代謝途徑[41]，這可能是導(dǎo)致該類化合物表現(xiàn)出強(qiáng)相關(guān)性的原因之一。此外，兩種洞燕，特別是TL2-Cave EBN 與多數(shù)礦物質(zhì)元素呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系。

圖4 燕窩營養(yǎng)成分及危害因子組成熱圖及PLSR 分析Fig.4 Heatmap and PLSR analysis of nutritional components and hazard factors in EBN

為了進(jìn)一步區(qū)分屋燕與洞燕樣品，篩選造成二者差異的關(guān)鍵組分，本研究進(jìn)行PLSR 分析，模型的Rx2為0.761，Ry2為0.968，Q2為0.923，表明該模型可以準(zhǔn)確的解釋不同燕窩原料在化合物組成上的差異。PLSR 分析中前兩個主成分提取了總方差的76.1%，可解釋樣本的大部分信息（圖4 B）。不同燕窩原料根據(jù)化合物組成的差異可以很好地被分開，其中兩種屋燕位于第一主成分正半軸，第二主成分可將兩種屋燕進(jìn)一步區(qū)分開。兩種洞燕主要集中在第二和第三象限，與第一主成分呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，二者化合物組成及含量較為相似，并未作出進(jìn)一步的區(qū)分。在這些對燕窩種類具有重要影響的化合物中，有13 種物質(zhì)的變量投影重要性（Variable importance in the projection, VIP）>1（圖4 C），包括Se、Fe、I、Mn、Cu、Zn 在內(nèi)的6 種微量元素，Ser、Thr 和Ala 在內(nèi)的3 種氨基酸，Ca 和Na 在內(nèi)的2 種常量元素以及唾液酸和蛋白質(zhì)，它們對模型方差具有較高的貢獻(xiàn)率，可以用來區(qū)分屋燕與洞燕種類。整體來看，礦物質(zhì)元素對屋燕和洞燕成分組成的影響大于氨基酸、危害因子及其他營養(yǎng)成分，特別是微量元素Se、Fe、I、Mn 和Cu 貢獻(xiàn)率更高，因此后續(xù)研究區(qū)分燕窩種類時可將微量元素含量作為關(guān)注重點。

3 結(jié)論

本研究以4 種屋燕和洞燕為實驗原料，對燕窩中蛋白質(zhì)、唾液酸、氨基酸和礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)成分以及亞硝酸鹽、重金屬元素進(jìn)行了檢測分析。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)和唾液酸是燕窩中最主要的營養(yǎng)物質(zhì)（占比分別為63.09%～67.79%和7.22%～10.41%），且屋燕中蛋白質(zhì)和唾液酸含量高于洞燕。燕窩還富含人體必需氨基酸，可作為人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的來源，且洞燕中氨基酸含量高于屋燕（45.96～47.04 g/100 g>43.82～45.48 g/100 g）。不同種類燕窩礦物質(zhì)元素組成及含量差異較大，特別是洞燕中Ca、Na、Fe、Mn含量顯著高于屋燕。其中Se、Fe、I、Mn、Cu 可作為區(qū)分屋燕與洞燕的關(guān)鍵指標(biāo)，對燕窩種類進(jìn)行鑒別時以上述5 種微量元素為衡量指標(biāo)可提高準(zhǔn)確度?？偟膩碚f，不論從氨基酸還是礦物質(zhì)元素含量角度分析，洞燕的營養(yǎng)價值均高于屋燕，特別是TL1-Cave EBN 營養(yǎng)價值更高，可作為優(yōu)質(zhì)的燕窩原料。

對比以往研究中利用特定的常量元素建模區(qū)分燕窩種類，本研究利用回歸分析篩出的微量元素更加準(zhǔn)確，可應(yīng)用于市面上洞燕真?zhèn)舞b別的重要依據(jù)，但后續(xù)還需要收集大量的樣本做進(jìn)一步的驗證。燕窩富含對人體健康有益的高質(zhì)量蛋白及必需氨基酸，暗示燕窩蛋白的功效不容忽視。目前關(guān)于燕窩中蛋白質(zhì)的組成少有研究，屋燕與洞燕蛋白質(zhì)組成差異還未見報道，具體哪種蛋白質(zhì)發(fā)揮關(guān)鍵作用尚不明確，后續(xù)實驗將重點挖掘燕窩中的活性蛋白組分并對其生理功能展開一系列研究。此外，燕窩貯藏條件對燕窩品質(zhì)有重要影響，有必要對二者的線性關(guān)系開展研究，以得到燕窩貯藏的最適條件。