龔 蕾，韓 智，彭青枝，周陶鴻，黃 徽，于 果，王福燕

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北武漢 430075；2.國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（動(dòng)物源性食品中重點(diǎn)化學(xué)危害物檢測技術(shù)），湖北武漢 430075；3.湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430075；4.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北武漢 430056）

食品色澤是食品品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，艷麗的色澤可提高人們的消費(fèi)欲望。合成色素作為食品添加劑廣泛應(yīng)用在食品工業(yè)中，具有穩(wěn)定性高、著色能力強(qiáng)、成本低廉、易調(diào)色等優(yōu)點(diǎn)[1]。但合成色素主要以甲苯、苯等為原料，經(jīng)過磺化、偶氮化等化學(xué)反應(yīng)而制得，經(jīng)人體代謝分解，可生成潛在的致癌物質(zhì)，損害身體健康[2]。

在肉制品工業(yè)中，合成色素的使用有著嚴(yán)格要求，我國僅允許胭脂蟲紅、誘惑紅等色素在肉制品中限量、限范圍使用，而檸檬黃、莧菜紅等常見合成色素禁止在肉制品中使用[3-4]。但在利益的驅(qū)動(dòng)下，一些不法商家存在超范圍、超限量使用色素的現(xiàn)象，甚至添加非食用色素，達(dá)到改善肉制品色澤的目的，危害食品安全[5]。據(jù)報(bào)道，在市場監(jiān)督管理部門的日常監(jiān)督抽檢和專項(xiàng)抽檢中，發(fā)現(xiàn)肉制品中檢出酸性橙Ⅱ（酸性橙7）、酸性紅1 等非食用色素[6]。GB 5009.35-2016[7]、GB/T 9695.6-2008[8]、SN/T 1743-2006[9]及SN/T 3536-2013[10]等國家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，規(guī)范了對檸檬黃、胭脂紅、日落黃、酸性橙7 等色素的檢測方法，但是針對肉制品中可能非法添加酸性紅1、偶氮玉紅等化合物還沒有相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)方法，缺少同時(shí)檢測多種色素的技術(shù)，日常監(jiān)督檢測存在一定盲區(qū)。

目前，檢測肉制品中色素常用方法包括薄層色譜法[11]、高效液相色譜法[12-14]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-18]等。蔣榮華等[19]采用高效液相色譜法對肉制品中的莧菜紅、檸檬黃、胭脂紅等6 種色素進(jìn)行檢測，方法的檢出限為0.12～0.21 mg/kg，方法的回收率為70.33%～93.08%。王韋達(dá)等[20]建立了固相萃取-超高效液相色譜分析方法，對不同食品中的紅2G 進(jìn)行檢測，方法檢出限為0.03 mg/kg，平均回收率在80%以上。李道霞等[21]建立了陰離子固相萃取-HPLC 法測定肉制品中酸性橙Ⅱ、喹啉黃、紅2G 等色素的方法，該方法定量限為0.6～1.5 mg/kg，平均回收率為65.2%～102.0%。高效液相色譜法是目前國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測色素的主要方法，但是存在定性不準(zhǔn)、靈敏度較差等問題，相較于高效液相色譜和薄層色譜法而言，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有定性準(zhǔn)確、分析時(shí)間短等優(yōu)勢。因此，本文針對肉制品中超量超范圍以及非法添加色素的現(xiàn)象，通過對樣品前處理及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定條件進(jìn)行優(yōu)化，以期建立一種快速同時(shí)測定肉制品中酸性紅1、酸性橙7 等17 種合成色素含量的方法，為肉制品中合成色素的濫用提供一種高效便捷的快速篩查及定量儀器方法，為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

26 批次火腿腸、26 批次香腸、10 批次鴨脖、10 批次臘肉等樣品 購自武漢市、鄂州市、黃石市的超市以及個(gè)體工商戶；乙腈、正己烷、甲酸、氨水、乙酸銨 色譜純，德國Merck 公司；硫酸銨 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ；標(biāo)準(zhǔn)品信息見表1。WAX 固相萃取柱（200 mg, 6 mL）、ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）美國Waters 公司；AB 4500 液質(zhì)聯(lián)用儀，配Multi-Quant 數(shù)據(jù)分析軟件 美國AB SCIEX 公司；ME204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；MultiVortex 渦旋混合器 廣州得泰儀器科技有限公司；CLT55離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；0.22 μm水系濾膜 天津津騰公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng) 美國Millipore 公司。

表1 17 種色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息Table 1 Information of seventeen colorants

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別精密稱取17 種待測成分的標(biāo)準(zhǔn)品適量于10 mL 容量瓶中（精確至0.0001 g），加入少量超純水進(jìn)行溶解，定容到刻度，獲得不同化合物的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度范圍為0.10～2.3 mg/mL，精密量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水稀釋，配制成濃度均為10 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液在4 ℃條件下貯存。

1.2.2 樣品前處理 提?。喝∮写硇詷悠?00 g，采用粉碎機(jī)粉碎后，再將其研磨成細(xì)粉狀，裝入潔凈的玻璃盛樣容器內(nèi)，密封并標(biāo)明標(biāo)記。稱取2.0 g（精確至0.01 g）粉碎樣品于50 mL 聚丙烯離心管中，加入10 mL 水，渦旋混勻1 min，50 ℃下超聲提取10 min，加入0.5 mL 飽和硫酸銨溶液，振蕩混勻1 min，8000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至25 mL具塞試管中，加入10 mL 水再提取一次，合并兩次濾液，用水定容到25 mL，此為提取液。

凈化：將25 mL 提取液全部轉(zhuǎn)移到50 mL 離心管，加入正己烷20 mL，渦旋混勻2 min，8000 r/min離心5 min，棄去全部上層正己烷，取10 mL 下層溶液待凈化。將10 mL 待凈化液通過已活化的WAX固相萃取柱，分別用3 mL 水、3 mL 2%甲酸-甲醇淋洗，棄去淋洗液，用6 mL 5%氨水-甲醇洗脫，收集洗脫液，50 ℃水浴下氮吹至干，用水定容到1.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm 水系濾膜（聚醚砜材質(zhì)），待上機(jī)。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：A 相為5 mmol/L 乙酸銨，B 相為乙腈，流速0.3 mL/min；梯度洗脫條件如表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 The gradient elution program

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；電噴霧電壓：-4500 V；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：35 psi；碰撞氣壓力：8 psi；霧化器壓力：55 psi；輔助氣壓力：55 psi；入口電壓：-10.0 V；碰撞室出口電壓：-10.0 V。各色素的質(zhì)譜參考條件見表3。

表3 17 種化合物的定性離子、定量離子、去簇電壓和碰撞能量Table 3 Qualitative ion, quantitative ion, cone voltage and collision energy of seventeen compounds

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Analyst 軟件采集數(shù)據(jù)，運(yùn)用MultiQuant 3.0.2 進(jìn)行定性定量分析，使用Origin 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為準(zhǔn)確獲得17 種色素的母離子，對質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 的各化合物單一標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)行了一級質(zhì)譜掃描。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在負(fù)離子掃描模式下，含有1 個(gè)鈉離子的化合物能穩(wěn)定形成[M-Na]-離子峰，含有2 個(gè)鈉離子的化合物能穩(wěn)定形成[M-2Na]2-離子峰，含3 個(gè)鈉離子的化合物能同時(shí)穩(wěn)定形成[M-3Na+H]2-和[M-3Na]3-離子峰，然而在后續(xù)的上機(jī)測試中，發(fā)現(xiàn)[M-3Na]3-響應(yīng)極低，可能是因?yàn)閇M-3Na]3-為源內(nèi)裂解而產(chǎn)生[22]，而[M-3Na+H]2-具有響應(yīng)高且穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此選擇[M-3Na+H]2-。為得到穩(wěn)定性好、響應(yīng)值高的定性定量子離子，對質(zhì)譜和液相參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最佳參數(shù)見表3。在17 種化合物中，一共含有3 對同分異構(gòu)體，分別是胭脂紅SX 和酸性紅26（分子式均為C18H14N2Na2O7S2），酸性紅18 和莧菜紅（分子式均為C20H11N2Na3O10S3），酸性橙7 和酸性橙20（分子式均為C16H11N2NaO4S）。在實(shí)際的色譜分離中，通過改變流動(dòng)相的梯度，能夠很好地將酸性紅18 和莧菜紅、酸性橙7 和酸性橙20 兩對同分異構(gòu)體進(jìn)行色譜分離，再通過單一標(biāo)準(zhǔn)溶液確定其各自保留時(shí)間，莧菜紅和酸性紅18 的保留時(shí)間分別為3.32 min 和3.72 min，酸性橙20 和酸性橙7 的保留時(shí)間分別為5.14 min 和5.72 min，它們互不干擾，保留時(shí)間的不一致使得它們滿足定性定量要求；改變流動(dòng)相洗脫比例，很難將胭脂紅SX 和酸性紅26 分離，但它們碎裂的離子對具有獨(dú)立性和專一性，產(chǎn)生的碎裂離子互不干擾，因此定性定量不受影響。酸性紅18 和莧菜紅，酸性橙7 和酸性橙20 的定量離子質(zhì)譜圖及總離子流圖見圖1。

圖1 總離子流圖Fig.1 TIC of all compounds

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1 凈化與上機(jī)測試

2.2.1.1 固相萃取柱的選擇 肉制品需通過凈化以除去油脂等干擾物，保證上機(jī)樣品不污染儀器。有研究通過稀釋提取液100 倍來達(dá)到凈化和減弱基質(zhì)效應(yīng)[17]。而更多的研究選擇使用固相萃取柱對色素進(jìn)行凈化富集，包括WAX[23]、C18[24-25]、HLB[26]，但尚無文獻(xiàn)使用固相萃取柱富集凈化的方法來同時(shí)測定文中所選取的17 種色素，因此本研究通過空白加標(biāo)的方式驗(yàn)證了幾款不同的固相萃取柱對這些色素的回收率，其中上樣、淋洗、洗脫步驟按照萃取柱產(chǎn)品推薦的步驟進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有WAX 同時(shí)對這17 種化合物具有較強(qiáng)的保留能力，回收率在70%～110%之間，滿足實(shí)驗(yàn)需要，因此選擇WAX 固相萃取柱。

2.2.1.2 上樣溶液酸堿性的影響 pH 可以改變化合物的離子化或質(zhì)子化程度，從而影響目標(biāo)化合物在固相萃取小柱中的保留情況[27]。本實(shí)驗(yàn)比較了不同酸堿性下17 種化合物在固相萃取小柱的保留情況。將含量均為1000 ng 的17 種目標(biāo)化合物分別添加到5 mL 水、5 mL 0.1 mol/L 硫酸銨、5 mL 1%氨水中，再全部通過已活化的WAX 固相萃取柱，收集全部流出液，并測試目標(biāo)化合物含量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水和0.1 mol/L 硫酸銨上樣后，流出液均不含目標(biāo)物成分，說明WAX 固相萃取柱能很好地保留這17 種化合物。而1%氨水作為提取試劑進(jìn)行上樣，流出液含有部分目標(biāo)物，特別是酸性紅73、酸性紅18、亮黃，在堿性上樣條件下，目標(biāo)物回收率不足50%。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[28-29]，在pH6.0 左右時(shí)，含有磺酸基的色素能在弱陰離子固相萃取柱上柱有最佳保留[30]，因此本研究通過加入適量飽和硫酸銨溶液使上樣呈弱酸性（pH6.0）來增加其在陰離子固相萃取柱上的保留。

2.2.1.3 淋洗溶液的選擇 淋洗劑的選擇是影響固相萃取柱回收率的重要因素，它不僅能去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)，而且還能最大程度地保留目標(biāo)化合物，從而提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度[31-32]。選擇5%甲醇-水、50%甲醇水、及5%甲醇-水（含2%甲酸）、50%甲醇水（含2%甲酸）、100%甲醇（含2%甲酸）進(jìn)行淋洗，結(jié)果表明它們均能很好地保留目標(biāo)化合物而不流出固相萃取柱，但使用100%甲醇（含2%甲酸）淋洗效果最佳，原因是此時(shí)能有效除去固相萃取柱殘留的水分，下一步洗脫液在相同氮吹條件下能短時(shí)間內(nèi)完全氮吹至干，有助于定容操作。

2.2.1.4 濾膜的影響 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用尼龍材質(zhì)的濾膜，對17 種色素有不同程度的截留吸附，其中，通過尼龍濾膜后，偶氮玉紅、胭脂紅SX、酸性紅73、酸性橙20、酸性橙7、亮黃被吸附100%，其他被吸附50%以上，而聚醚砜（PES）濾膜不吸附目標(biāo)物，因此在進(jìn)行過膜上機(jī)時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格測試所使用的濾膜，以保證合成色素不被濾膜材質(zhì)所吸附。

2.3 線性范圍、檢出限、定量限、加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以色素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，質(zhì)譜的定量峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出17 種色素在20～1200 μg/L 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，R>0.99，以信噪比S/N=3 確定檢出限，以S/N=10 確定定量限，17 種化合物檢出限（LOD）為0.01～0.05 mg/kg，定量限（LOQ）為0.03～0.15 mg/kg。在香腸空白基質(zhì)中分別添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本文方法進(jìn)行處理，按高中低三水平對空白樣品提取液進(jìn)行添加，每個(gè)添加水平平行測定6 次，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。各化合物在3 個(gè)添加水平（0.15、0.30 和1.0 mg/kg）下的回收率為71.2%～103.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs，n=6）為1.3%～4.9%。線性范圍、檢出限、定量限、加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差具體結(jié)果見表4。

表4 17 種化合物的加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢出限、定量限及標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)Table 4 Average spiked recoveries, relative standard deviations, LODs , LOQs, standard curve and correlation coefficient of seventeen compounds

2.4 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

采用優(yōu)化建立的UPLC-MS/MS 方法對市售香腸、火腿腸、熟制鴨脖、臘肉等72 份樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示檢出誘惑紅樣品6 個(gè)，均為火腿腸，含量為0.71～2.7 mg/kg，含量低于國家標(biāo)準(zhǔn)限量15 mg/kg，為合格食品；檢出酸性紅1 樣品4 個(gè)，均為香腸，含量為0.39～3.2 mg/kg，酸性紅1 為非法添加色素，值得監(jiān)管部門的關(guān)注。

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)測定肉制品中17 種人工合成色素的UPLC-MS/MS 檢測方法。該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高。17 種色素在20～1200 μg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R>0.99，方法的檢出限為0.01～0.05 mg/kg，定量限為0.03～0.15 mg/kg。各色素在3 個(gè)添加水平（0.15、0.30 和1.0 mg/kg）下的回收率為71.2%～103.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs，n=6）為1.3%～4.9%。對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明在肉制品中含有非食用色素酸性紅1，含量為0.39～3.2 mg/kg，值得監(jiān)管部門的關(guān)注。本方法可實(shí)現(xiàn)同時(shí)分析肉制品中的17 種色素，大大提高了檢驗(yàn)效率，為檢驗(yàn)人員提供了一個(gè)簡單、快捷、高效的檢驗(yàn)方法，也為食品安全提供了技術(shù)保障，還可對肉制品中色素相關(guān)檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行累積從而進(jìn)行必要的風(fēng)險(xiǎn)評估，為政府監(jiān)管部門提供數(shù)據(jù)支持，具有實(shí)際意義和一定社會(huì)效益。