李麗春，劉書貴，林嘉薇，尹 怡,*，鄭光明，趙 城，馬麗莎，單 奇，戴曉欣，魏琳婷，周 豪

（1.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東廣州 510380；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外來入侵水生生物防控重點實驗室，廣東廣州 510380；3.廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣東廣州 510380）

四環(huán)素類抗生素是一類對常見的革蘭氏陽性菌、陰性菌均具有較強抗菌作用的廣譜性抗生素，被廣泛用于動物性疾病的預防治療[1]。近年來隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，集約化高密度養(yǎng)殖越來越普遍，導致養(yǎng)殖環(huán)境水體惡化，各種疾病頻發(fā)。養(yǎng)殖者常超劑量長時間使用抗菌藥物進行病害防治。四環(huán)素類抗菌藥作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的限用藥物，在淡水養(yǎng)殖中廣泛使用。水產(chǎn)養(yǎng)殖中不合理使用的四環(huán)素類抗生素，會通過水生動物的吸收和代謝轉(zhuǎn)移至水體環(huán)境，給環(huán)境安全帶來風險[2-3]。通過水生動物的生物富集，藥物在其組織中殘留，隨著人們食用水產(chǎn)品而進入人體，給人體健康帶來危害[4-5]。因此，美國、歐盟、日本等制定了四環(huán)素類抗生素在不同食品中的最大殘留限量（MRL），四環(huán)素類藥物在可食動物中的MRL 值分別為美國：2.0～12 mg/kg[6]，歐盟：100～600 μg/kg[7]，日本：0.2～1.2 mg/kg（總和）[8]，我國規(guī)定四環(huán)素類總殘留量不超過100 μg/kg[9]。

目前動物性食品中四環(huán)素類抗菌藥的殘留檢測方法主要有薄層色譜法[10]、化學發(fā)光法[11]、免疫分析法[12-13]、高效液相色譜法[8,14-15]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16-17]。其前處理大多采用固相萃?。⊿PE）[18-21]、固相分散萃?。⊿PME）[19,22]、超聲輔助提?。║AE）[15]、加速溶劑萃?。ˋSE）等[17,23]較為繁瑣復雜的方法。Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe（QuEChERS）前處理方法是近年來迅速發(fā)展的一種快速前處理方法，具有快速、簡單、低成本、耐用、可靠、安全和多類型化合物同時檢測的特點，在藥物殘留檢測中廣泛應用[18-19,24-25]，動物源食品中抗菌藥物殘留測定方面也有報道[23-24]，采用QuEChERS 前處理方法可以大大提高檢測效率，獲得更便捷和更準確的分析方法。目前四環(huán)素類藥物殘留檢測方法大多采用固相萃取方法，操作繁瑣且費時，本研究擬采用響應面法對影響方法準確性和精密度的前處理條件進行優(yōu)化，有望建立一種簡單快速且準確性和精密度較高的烏鱧肌肉中土霉素、金霉素、四環(huán)素和強力霉素的QuEChERS 結(jié)合UPLC-MS/MS 檢測方法。并采用建立的方法測定廣東主要養(yǎng)殖池塘的烏鱧樣品中四環(huán)素殘留量，分析其膳食風險，為烏鱧養(yǎng)殖中四環(huán)素類抗菌藥物的風險評估及監(jiān)管提供有效依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

空白烏鱧樣品 來自于中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖基地，養(yǎng)殖過程未使用過四環(huán)素類藥物；實際檢測的烏鱧樣品 均采集于廣東主要養(yǎng)殖區(qū)域的養(yǎng)殖池塘；鹽酸土霉素（OTC，純度96.5%）、鹽酸金霉素（CTC，純度93%）、鹽酸多西環(huán)素（DC，純度98.7%）、鹽酸四環(huán)素（TC，純度96.5%） 標準品，德國Dr.Ehrenstorfer 公司；氘代四環(huán)素（TC-D6，純度>80%） 加拿大Toronto Research Chemicals（TRC）公司；二水合乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O）、氯化鈉（NaCl）、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、一水合檸檬酸（C6H8O7·H2O）、鹽酸（HCl） 分析純，廣州化學試劑廠；甲酸、N-丙基乙二胺（PSA，40-63 μm）、中性氧化鋁（Alumina-N，100-300 MESH）、弗羅里硅土（Florisil，150-250 μm）

德國CNW 公司；乙酸銨 色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18，40-60 μm）、石墨化碳黑（GCB，120-400 MESH） 天津Agela 公司；乙腈、甲醇 色譜純，美國Burdick & Jackson 公司；實驗用水為超純水。

1290-6470 超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI） 美國安捷倫公司；MS3 旋渦混勻 德國IKA 公司；Direct-Q3 超純水機 美國Millipore 公司；TDL-5-A 離心機 上海安亭公司；N-EVAP-12 氮吹儀 美國Organomation 公司；3k15 高速離心機 美國Sigma 公司；KQ5200 型超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液及試劑配制 標準溶液配制：準確稱取適量的TC、OTC、CTC、DC 和內(nèi)標TC-D65 種標準品，分別用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的單標儲備液。準確移取四種單標標準儲備液各1 mL 用甲醇稀釋并定容至10 mL，搖勻，配制成10 μg/mL 的混合標準中間溶液，將100 μg/mL的TC-D6內(nèi)標溶液用甲醇稀釋成10 μg/mL 標準中間液，于-18 ℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine（pH4.5）緩沖溶液配制[25]：分別準確稱取37.2 g Na2EDTA·2H2O、10.9 g Na2HPO4·12H2O 和12.9 g C6H8O7·H2O，用1.00 L 超純水充分溶解，加入適量鹽酸調(diào)節(jié)pH 為4.5，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用前放至室溫?/p>

1.2.2 前處理方法 提?。簻蚀_稱取2.00 g 勻漿后的肌肉樣品于50 mL 具塞離心管中，加入2 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine（pH4.5）緩沖溶液，渦旋混勻后加入10 mL 1%甲酸酸化乙腈和2.0 g 氯化鈉，渦旋振蕩2 min，5000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中待凈化。

凈化：提取液中加入500 mg 無水硫酸鈉、150 mg PSA 和200 mg C18，渦旋1 min，5000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 玻璃管中于45 °C 下氮氣吹干，然后用1 mL 15%甲醇水充分溶解后，10000 r/min 離心5 min，過0.22 μm 微孔濾膜，待UHPLC-MS/MS 檢測。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（2.1 mm×50 mm，18 μm）；流動相A 為0.5%甲酸水，B 為甲醇；流速：0.40 mL/ min；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL，梯度洗脫程序列于表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；毛細管電壓3000 V；霧化器溫度325 ℃；鞘氣溫度350 ℃；掃描模式為多反應監(jiān)測（MRM），其他MRM 參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameter

1.2.5 單因素實驗 為了建立高效、準確的烏鱧肌肉中四環(huán)素類化合物殘留分析方法，針對影響四種四環(huán)素類化合物回收率的因素，通過空白基質(zhì)加標法，優(yōu)化提取劑類型，分別采用10 mL 甲醇、乙腈、酸化乙腈、酸化甲醇和酸化乙腈+2 mL Na2EDTA-McIlvanie 緩沖液對加標的樣品進行提取，比較其回收率；確定提取劑類型后對提取劑體積進行優(yōu)化選擇，分別采用5、10、15 和20 mL 提取劑提取烏鱧肌肉中目標化合物，以回收率為100%確定提取劑體積；分別采用100 mg 的PSA、C18、GCB、中性氧化鋁和弗羅里硅土對提取液進行凈化，選擇回收率較高且無雜質(zhì)峰干擾的凈化劑；對選擇的凈化劑用量進行優(yōu)化選擇，分別采用50、100、150、200、250 和300 mg 凈化劑凈化，比較其回收率和凈化效果，每個處理設3 次平行。

1.2.6 響應面優(yōu)化 通過單因素實驗獲得對烏鱧肌肉中四環(huán)素類化合物回收率影響較大的因素進行響應面優(yōu)化，以期獲得最優(yōu)的前處理方法。分別以PSA 用量（X1）、C18用量（X2）和Na2EDTA-McIlvanie緩沖液體積（X3）為自變量，四種四環(huán)素的各自回收率為應變量，采用Box-Behnken Design（BBD）法設計3 因素3 水平優(yōu)化試驗[26]，試驗設計因素與水平如表3 所示。

表3 Box-Behnken 試驗設計的編碼水平和相應的自變量實際水平Table 3 Coded levels and corresponding actual levels ofindependent variables used for Box-Behnken design

1.2.7 方法學驗證 采用QuEChERS 結(jié)合UHPLCMS/MS 法測定水產(chǎn)品中4 種四環(huán)素類藥物的殘留量，用空白樣品加標法評估方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ），在空白基質(zhì)樣品中添加4 種化合物，分別以信噪比（S/N）大于或等于3 和10 的最低濃度為方法LOD 和LOQ[27]。在空白基質(zhì)中加入一定量的標準溶液后，采用建立的方法進行測定，通過加標樣品的濃度與實際添加濃度的比值計算加標回收率，分別以LOQ、3 倍LOQ 和5 倍LOQ 為加標水平，每個水平重復6 次，通過計算加標回收率和相對標準偏差驗證方法的準確性和精密度；通過分析3 d 內(nèi)6 個添加樣品在5.0 μg/kg 濃度下的回收率，計算相對標準偏差評價日間精密度。

采用提取后加標法，通過比較基質(zhì)提取物和溶劑在0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50 和100 ng/mL 濃度下的校準曲線斜率評價基質(zhì)效應（ME）?；|(zhì)效應按照以下公式計算[28]：

式中，Sm為基質(zhì)匹配標準溶液所得曲線的斜率，Ss為純?nèi)軇藴嗜芤核们€的斜率。當ME 的值在-20%到+20%之間時，認為其基質(zhì)效應是可接受的；如果它們介于-50%～-20%或+20%～+50%之間，則被認為是中等基質(zhì)效應；如果這些值低于-50%或高于+50%則認為具有較強的基質(zhì)效應[28]。

1.2.8 實際樣品檢測及風險評估 在廣東烏鱧主要養(yǎng)殖區(qū)域的養(yǎng)殖池塘采集烏鱧樣品，測定其肌肉中4 種四環(huán)素類藥物殘留量。采用風險商（HQ，hazard quotient）對膳食中四環(huán)素類抗生素暴露量進行風險評估的表征。以人體重量為60 kg 的每日允許受攝入量（ADI）為指標，對烏鱧中四環(huán)素類化合物的殘留風險進行評估。為了評估膳食風險，根據(jù)Diao 等[29]和Ramaswamy 等[30]的方法計算了膳食暴露量（EDI）和風險商（HQ）值。通過將人均日消費量與公式（2）中所示的藥物殘留量相乘，計算出膳食暴露量（EDI）。通過計算公式（3）中所示的風險商（HQ）進行膳食風險評估[31-32]。

式中，EDI 為膳食暴露量（μg/（kg·bw·d）），C 為樣品中藥物殘留濃度（μg/kg），M 為人均消費量（g），BW 為成年平均體重60 kg；ADI 為每日允許攝入量（μg/（kg·bw·d））。當HQ 值大于1 時，風險被認為是不可接受的，而HQ 值小于1 則表示對人類的潛在風險較低[31]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 軟件2021 版本進行統(tǒng)計分析和圖形輸出，并使用Design-Expert 軟件12.0 版本（State Ease, Inc.）進行響應面方差分析（ANOVA）和響應面圖形輸出，以確定線性項、二次項和交互項的回歸系數(shù)，所有實驗均進行3 次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

四環(huán)素類化合物分子中的雙鍵和含氧或氮原子的基團可與其它物質(zhì)相互作用[33]，不僅可與金屬離子形成二價、三價化合物，與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，還可以與C18色譜柱上的硅醇基強烈作用，導致分離樣品時出現(xiàn)拖尾峰[34]。因此需要選擇合適的流動相，從而避免螯合物的形成及色譜柱的吸附，同時可以消除殘留的金屬離子[35-36]，獲得較好的分離度和理想的色譜峰。ESI+離子模式下在流動相中加入一定量的甲酸，可以增加目標物的離子化狀態(tài)，提高其離子化效率，達到改善峰形，提高分離度的效果。為此對常用的酸化試劑甲酸、乙酸銨和乙酸進行了優(yōu)化比較，結(jié)果表明在甲醇-0.5%甲酸水中四種四環(huán)素類化合物可獲得較高的響應且峰形尖銳對稱。同時對質(zhì)譜的電離源、錐孔電壓和碰撞能等參數(shù)進行優(yōu)化，最終優(yōu)化值見表2。通過對色譜條件的優(yōu)化獲得的四環(huán)素類化合物的色譜圖峰形較好（圖1）。

圖1 4 種四環(huán)素類藥物在加標濃度為5 μg/kg 烏鱧肌肉樣品中的MRM 譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the 4 tetracycline drugs in muscle samples of Channa argus at 5 μg/kg supplemented concentration

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑選擇 為了建立簡單、通用和高效的樣品前處理方法，獲得較為潔凈的提取物，對分析物具有較低的離子抑制，本研究對提取溶劑進行了優(yōu)化選擇。QuEChERS 前處理方法常用的提取劑主要有甲醇、乙腈和酸化乙腈，因此采用加標回收法比較了甲醇、乙腈、酸化乙腈和酸化甲醇對水產(chǎn)品中四環(huán)素類化合物的提取效率（提取劑體積均為10 mL）。

不同提取劑對四種目標物的提取回收率見圖2，結(jié)果表明，采用酸化乙腈和Na2EDTA-McIlvanie 緩沖液作為提取劑，四種四環(huán)素類化合物的提取效率較高，其加標回收率在80%～120%之間，可滿足藥物殘留檢測的要求。由于四環(huán)素類化合物可與基質(zhì)中的二價金屬離子（Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+）結(jié)合形成強配合物[37]，需要在提取時阻止二價金屬離子和蛋白質(zhì)在提取過程中與四環(huán)素類化合物作用[8,38]。為了使目標物從金屬配合物中釋放出來，須在基質(zhì)中加入EDTA或檸檬酸等螯合劑。在樣品提取時加入Na2EDTAMcIlvanie（pH4.5）緩沖液作為金屬離子螯合劑，可提高基質(zhì)中四環(huán)素類化合物的提取效率。因此選擇Na2EDTA-McIlvanie 緩沖液和1%甲酸乙腈作為四環(huán)素類藥物的提取劑。

圖2 提取劑對四環(huán)素類化合物回收率的影響Fig.2 Effect of extraction agent on recovery of tetracyclines

同時比較了Na2EDTA-McIlvanie 緩沖液體積分別為1、2、3、4 和5 mL 時四種化合物的回收率，結(jié)果如圖3A 所示，當緩沖液體積為2 mL 時可獲得較高的回收率。此外比較了5、10、15 和20 mL 提取劑對四種目標物回收率的影響（圖3B），結(jié)果表明，5 mL 1%甲酸乙腈難以充分提取回收率較低，當酸化乙腈體積大于10 mL 時回收率在80%～110%之間，因此選擇1%甲酸乙腈的體積為10 mL。

圖3 Na2EDTA-McIlvanie 和提取劑體積對四環(huán)素類化合物回收率的影響Fig.3 Effect of Na2EDTA-McIlvanie and extraction volume on recovery of tetracyclines

2.2.2 凈化劑優(yōu)化 QuEChERS 方法常用的凈化劑有PSA、C18、GCB、中性氧化鋁（Alumina-N）和弗羅里硅土（Florisil），PSA 通常用于去除提取液中的脂類和糖類物質(zhì)，C18具有良好的除脂能力，GCB 可去除提取液中的色素成分，但對含苯環(huán)官能團的化合物有較強的吸附作用。本研究優(yōu)化比較了PSA、C18、GCB、中性氧化鋁（Alumina-N）和弗羅里硅土（Florisil）5 種吸附劑對4 種四環(huán)素類藥物的凈化效果（圖4A）。在空白烏鱧肌肉樣品中加入同一濃度水平（5.0 μg/kg）的四環(huán)素類混合標準溶液，分別用100 mg 的上述5 種吸附劑凈化，比較其回收率。結(jié)果表明，GCB、中性氧化鋁（Alumina-N）和弗羅里硅土對四種四環(huán)素類抗菌藥具有極強的吸附性能，三種吸附劑中四環(huán)素類藥物的回收率低于20%，而在吸附劑PSA 和C18凈化下可獲得較好回收率（80%～110%），因此選擇PSA 和C18作為前處理方法的吸附劑進行優(yōu)化。

圖4 吸附劑種類和用量對加標回收率的影響Fig.4 The influence of type and dosage of cleaning agents on recoveries

分別對吸附劑PSA 和C18的用量進行優(yōu)化比較，四環(huán)素類藥物在不同劑量吸附劑下的回收率結(jié)果見圖4B 和圖4C。結(jié)果表明，吸附劑用量對回收率有較大影響。從圖4B 可知，吸附劑C18的用量對四種四環(huán)素類藥物的回收率有較大影響，C18用量從50 mg 增加至200 mg 時回收率逐漸增加，當C18用量為200 mg 時回收率較為理想（90.3%～97.8%），但C18用量大于250 mg 時，回收率明顯降低。PSA 用量同樣也影響回收率，當PSA 用量為150 mg 時，四種藥物回收率在94.3%～96.8%之間，但是PSA 用量在100 mg 以下或200 mg 以上時回收率偏低。因此選擇C18用量分別為150、200 和250 mg，PSA 用量為100、150 和200 mg 進行響應面優(yōu)化。

2.3 響應面優(yōu)化

在單因素實驗結(jié)果基礎上，選擇PSA 用量（X1）、C18用量（X2）和Na2EDTA-McIlvanie 緩沖液體積（X3）進行三因素三水平的Box-Benken 響應面優(yōu)化試驗（BBD），響應值為四環(huán)素（Y1）、土霉素（Y2）、金霉素（Y3）和多西環(huán)素（Y4）的回收率，結(jié)果見表4。

表4 Box-Benken 響應面優(yōu)化試驗方案與結(jié)果Table 4 Experimental scheme and results of Box-Behnken design

2.3.1 模型建立及方差分析 對BBD 實驗設計的結(jié)果進行了模型擬合和統(tǒng)計分析，以預測最佳QuEChERS 條件。采用Design-Expert 12.0 軟件將實驗數(shù)據(jù)擬合成二階多項式模型，通過多元回歸分析各自變量與響應之間的關(guān)系，獲得4 種四環(huán)素類藥物的擬合回歸方程：

四環(huán)素（ TC） ： Y1=-146.72+0.55X1+1.82X2+31.54X3-0.0004X1X2+0.082X1X3+0.030X2X3-0.0024 X12-0.0046X22-12.42X32

土霉素（OTC）：Y2=-127.14+0.966X1+1.24X2+29.99X3-0.0019X1X2+0.0498X1X3+0.0121X2X3-0.0033X12-0.0031X22-10.08X32

金霉素（CTC）：Y3=-166.93+1.63X1+1.08X2+47.98X3+0.0003X1X2+0.037X1X3-0.0246X2X3-0.0059 X12-0.0030X22-12.53X32

多西環(huán)素（DC）：Y4=-158.37+1.30X1+1.37X2+32.36X3-0.0006X1X2+0.0585X1X3+0.0355X2X3-0.0044 X12-0.0035X22-12.30X32

為了檢驗模型的擬合程度，對模型進行方差分析和顯著性檢驗，方差分析由FisherF檢驗進行推導[39]，結(jié)果見表5。一般而言F值越高，P值越低，回歸模型越顯著[40]，四種藥物回歸模型F值在14.59～46.43 之間（自由度df=9），P值均遠低于0.01，回歸模型差異極顯著（表5）。四種藥物回歸方程的回歸系數(shù)R2分別為0.9574（TC）、0.9835（OTC）、0.9494（CTC）和0.9575（DC），調(diào)整回歸系數(shù)R2adj 分別為0.9027（TC）、0.9623（OTC）、0.8843（CTC）和0.9028（DC），表明模型擬合良好。且四種藥物模型失擬值不顯著，F(xiàn)值較低（0.0738～0.7510），P值均大于0.05（0.5762～0.9709），表明回歸模型在本研究中可行[39]，具有較好的準確性和可靠性，可用來分析和預測各因素對4 種目標物回收率的影響。

表5 四環(huán)素類藥物回收率響應面模型及預測結(jié)果方差分析Table 5 ANOVA of response surface model and predicted results for recovery of tetracyclines

2.3.2 響應面分析 為了最大限度的提高方法回收率，根據(jù)擬合方程進行響應面分析，繪制各變量之間的交互作用三維響應面曲線，四種四環(huán)素類藥物的回收率受PSA 用量（X1）、C18用量（X2）和Na2EDTAMcIlvanie 緩沖液體積（X3）的影響如圖5（TC:A1～A3，OTC:B1～B3，CTC:C1～C3，DC:D1～D3）所示。響應面的斜率越大，表明該因素對響應的影響更大[41]；響應面曲面可直觀反映各因素間的交互作用對目標物回收率的影響，圖中因素的曲面越陡表明該因素對目標物回收率影響越大。如由圖5 可知，對于四環(huán)素和土霉素PSA 用量（X1）和Na2EDTA-McIlvanie緩沖液體積（X3）的響應面曲面比較陡，表明兩者間交互作用顯著；而PSA 用量（X2）和C18用量（X2）的響應面曲線比較緩，表明兩者之間交互作用不明顯。

圖5 各因素交互作用對回收率影響的響應面圖Fig.5 Response surface estimated showing the interaction of two different parameters on the recovery

通過Design-Expert 12.0 軟件分析，以四環(huán)素類化合物的回收率均為100%，確定最佳QuEChERS條件為PSA：146.4 mg、C18：185.5 mg 和Na2EDTAMcIlvanie 緩沖液體積：1.95 mL，該最優(yōu)條件下的四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素的回收率預測值分別為：100%、102%、99.4%、99.4%。調(diào)整實際條件最佳QuEChERS 條件為PSA：150 mg、C18：200 mg和Na2EDTA-McIlvanie 緩沖液體積：2.0 mL，采用優(yōu)化后的參數(shù)進行驗證實驗，經(jīng)6 次平行實驗后測得平均回收率分別為：101±1.7%（TC）、97.7±3.8%（OTC）、101±3.1%（CTC）和95.7±2.8%（DC），四種化合物實際回收率與模型預測值差異不明顯，說明擬合模型優(yōu)化出的QuEChERS 條件較為準確。

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法的線性、檢出限、定量限 在上述優(yōu)化的儀器條件下，分析一系列不同濃度的基質(zhì)樣品，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標，定量離子峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，四種四環(huán)素類藥物在線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系（r>0.999）。添加不同濃度混合標準溶液至空白樣品進行測試，分別以目標峰S/N=3 和10 確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果如表6 所示。在0.5～100 ng/mL 濃度范圍內(nèi)，4 種四環(huán)素類化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；檢出限為0.25～0.75 μg/kg，定量限為0.84～2.00 μg/kg，滿足國內(nèi)外藥物殘留檢測要求。

表6 四環(huán)素類化合物線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應Table 6 Linear equation, correlation coefficient, LOD, LOQ and matrix effects for tetracyclines

2.4.2 回收率和精密度 采用基質(zhì)加標法對方法回收率和精密度進行了考察，分設置LOQ、3 倍LOQ和5 倍LOQ 三種添加濃度水平，按照本方法確定的前處理方法和儀器條件進行測定，每個濃度水平設置6 次重復，結(jié)果見表7。四種四環(huán)素類化合物日內(nèi)和日間回收率在89.5%～118%之間，精密度小于10%，與現(xiàn)有文獻報道的方法相比（表8），本方法回收率和精密度較好，可滿足國內(nèi)外藥物殘留檢測要求。

表7 四環(huán)素類抗生素在烏鱧肌肉中的加標回收率和精密度（n=6）Table 7 Recovery and precision of tetracyclines in the muscle of Channa argus (n=6)

表8 本方法與其他報道的水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留檢測方法比較Table 8 Comparison of the proposed method with other reported methods for the determination of TCs in fish samples

2.4.3 基質(zhì)效應 采用空白基質(zhì)提取后加標法，用空白烏鱧肌肉樣品按照優(yōu)化的前處理方法進行前處理后，分別采用定溶液（15%甲醇水）和空白基質(zhì)溶液配制0.5～100 ng/mL 的標準溶液，按照優(yōu)化好的儀器條件進行測定，計算烏鱧基質(zhì)中四環(huán)素類化合物的基質(zhì)效應，結(jié)果見表6。四種四環(huán)素類化合物的基質(zhì)效應在-36.0%～5.30%之間，其中四環(huán)素存在基質(zhì)增強效應，其他三種物質(zhì)存在基質(zhì)抑制效應，為減少基質(zhì)效應對檢測結(jié)果的影響，在實際樣品檢測中應采用基質(zhì)標準曲線進行定量校準。

2.5 實際樣品測定及風險分析

從廣東省烏鱧主要養(yǎng)殖區(qū)域采集烏鱧肌肉樣品33 個，按照本研究優(yōu)化的方法檢測樣品中四環(huán)素類化合物的殘留量，并通過計算風險商（hazard quoti-ent，HQ）對4 種四環(huán)素類化合物的殘留風險進行風險評估。烏鱧樣品中四環(huán)素類化合物殘留結(jié)果見表9。

表9 烏鱧肌肉中四環(huán)素類抗生素殘留濃度和風險商Table 9 The residual concentrations and HQ of tetracyclines in the muscle of Channa argus

以我國制定的抗生素每日允許攝入量（Acceptable Daily Intake，ADI μg/（kg·bw·d））為標準進行評價，四環(huán)素、金霉素和土霉素ADI 均為30 μg/（kg·bw·d），多西環(huán)素ADI 為3.0 μg/（kg·bw·d）。根據(jù)國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)，2020 年我國人均水產(chǎn)品消費量為38.08 g/d，通過計算可知，土霉素HQ 值在1.07×10-4～1.78×10-4之間，四環(huán)素HQ 值在7.51×10-5～1.36×10-4，金霉素HQ 值在5.33×10-5～7.31×10-4，多西環(huán)素HQ 值為2.28×10-4～3.07×10-3。所有四環(huán)素類化合物HQ 值均遠低于1.0，表明通過食用廣東養(yǎng)殖烏鱧攝入四環(huán)素類藥物對人體的健康沒有影響，風險較低，膳食安全性較高。

3 結(jié)論

本研究采用響應面法優(yōu)化了四環(huán)素類抗生素在烏鱧肌肉中的QuEChERS 結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）檢測方法，樣品用10 mL 1%甲酸酸化乙腈和2 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine（pH4.5）緩沖溶液提取，經(jīng)150 mg PSA 和200 mg C18凈化后，采用UHPLC-MS/MS 測定，內(nèi)標法定量。結(jié)果表明，該方法簡便快捷、溶劑用量少，且準確性和精密度較高。在0.5～100 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；檢出限為0.25～0.75 μg/kg，定量限為0.84～2.00 μg/kg。在三個添加濃度水平下四種四環(huán)素類化合物的日內(nèi)和日間回收率在89.5%～118%之間，精密度小于10%，滿足國內(nèi)外藥物殘留檢測要求，可用于烏鱧肌肉中四環(huán)素類藥物殘留檢測。本方法的定量限較已有報道的方法低，回收率、精密度和基質(zhì)效應與現(xiàn)有方法基本一致。采用優(yōu)化的快速檢測方法檢測了廣東省烏鱧主要養(yǎng)殖區(qū)域的33 個烏鱧樣品，通過計算風險商（HQ）進行風險評估，結(jié)果表明廣東烏鱧中四環(huán)素的膳食風險較低，其殘留對人體健康無影響。