辛易燃，尤升波，武俊瑞，盧龍飛，仝 蕾，劉鳳彩，韓福文，于金慧,*，烏日娜,*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所，山東濟(jì)南 250100；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866；3.濟(jì)南康多寶生物技術(shù)有限公司，山東濟(jì)南 250100；4.遼寧省食品發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，遼寧沈陽(yáng) 110866；5.沈陽(yáng)市微生物發(fā)酵技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110866；6.威海長(zhǎng)青海洋科技股份有限公司，山東威海 264300）

微擬球藻是真眼點(diǎn)藻綱微擬球藻屬的一種海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)微藻，其生長(zhǎng)快、光合效率高、含油量高，是開發(fā)前景良好的未來(lái)食品[1-2]。微擬球藻高產(chǎn)二十碳五烯酸（Ethernet for Plant Automation，EPA）且不含二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA），EPA 含量可達(dá)脂肪酸總量的30%，具備低硫、高氧、低十六烷值等特點(diǎn)[3-4]，還富含藻多糖、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)功能成分，已于2021 年被國(guó)家衛(wèi)健委列為新資源食品。目前，微藻在食品領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣，市面上已有代餐粉、能量棒和飲品[5]等含微擬球藻的相關(guān)食品，但是還未見其發(fā)酵類型的產(chǎn)品。

酶菌協(xié)同發(fā)酵是指基質(zhì)經(jīng)酶解工藝后，再經(jīng)益生菌菌株發(fā)酵的過程[6]。益生菌本身具有調(diào)節(jié)腸道菌群、抗氧化、改善機(jī)體免疫力等功能[7]，通過發(fā)酵可明顯改變基質(zhì)組分、降解生物大分子物質(zhì)，提高其功能活性和生物利用率，還可改善基質(zhì)風(fēng)味。楊潔芳等[8]利用酶菌協(xié)同制備大豆肽與實(shí)驗(yàn)室制備的酶解肽相比，其DPPH 自由基清除率提高106.92%。鄒俊哲等[9]研究表明酶菌協(xié)同處理得到的ACE 抑制肽活性強(qiáng)于菌和酶單獨(dú)作用時(shí)的效果?？梢姡鳛榍疤幚矸椒ㄖ坏拿妇鷧f(xié)同工藝應(yīng)用前景廣泛，而微擬球藻豐富的營(yíng)養(yǎng)成分可作為酶菌協(xié)同處理的理想基質(zhì)。

基于以上現(xiàn)狀，本研究以微擬球藻為原料，利用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，以多肽含量為指標(biāo)，利用單因素和響應(yīng)面法確定微擬球藻最佳酶解工藝條件。篩選適合菌種對(duì)酶解過后的微擬球藻進(jìn)行發(fā)酵，明確不同菌/組合發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)活性成分變化及其對(duì)體外抗氧化、降血脂活性的影響，同時(shí)對(duì)發(fā)酵過后的微擬球藻進(jìn)行感官評(píng)定，為微擬球藻高值利用及功能型產(chǎn)品的開發(fā)提供參考與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

微擬球藻（Nannochloropsis oceanica）藻泥 由威海青逸未來(lái)生物技術(shù)有限公司提供；KB1 植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarumDY-1 CCTCCM-2016137）、KB2 干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus caseiKDB-LC CCTCCM2016431）、KB3 嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilusKDB-03 CCTCCM2016429）、KB4 發(fā)酵乳桿菌（Limosilactobacillus fermentumKDB-08 CCTCCM2016430） 為本實(shí)驗(yàn)室分離保存；木瓜蛋白酶（酶活力：80 萬(wàn) U/g） 北京索萊寶科技有限公司；1,2-二苦基-2-三硝基苯亞肼（DPPH）、2,4,6-三吡啶基-S-三嗪（TPTZ）、胰脂肪酶（酶活力：125 U/mg） SIGAMA（上海）貿(mào)易有限公司；?；悄懰徕c 上海源葉生物科技有限公司；2,4-二硝基苯酚丁酸酯 上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

3K15 臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)SIGMA 公司；756PC 紫外分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；AR124CN 電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；FE20 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LDZF 立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；INNOVA 43R 恒溫培養(yǎng)搖床 美國(guó)NBS 公司；SHA-B 恒溫水浴鍋 金壇市精達(dá)儀器制造廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微擬球藻的酶解

1.2.1.1 工藝流程及操作要點(diǎn) 取2.8 g 微擬球藻藻泥均質(zhì)于100 mL 蒸餾水中（1%干重），利用0.01 mol/L NaOH 溶液或0.01 mol/L HCl 溶液調(diào)整pH 后加入木瓜蛋白酶充分混勻，置于相應(yīng)溫度的恒溫水浴鍋中酶解，沸水浴滅酶15 min 即得微擬球藻酶解液。

1.2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn) 依次對(duì)酶量（1%、2%、3%、4%、5%）、酶解時(shí)間（1、2、3、4、5 h）、酶解溫度（40、50、60、70、80 ℃）和pH（5、6、7、8、9）。當(dāng)對(duì)酶量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為60 ℃，pH 為7；對(duì)酶解時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，酶量為3%，酶解溫度為60 ℃，pH 為7；對(duì)酶解溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，酶量為3%，酶解時(shí)間為3 h，pH 為7；對(duì)pH 進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，酶量為3%，酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為60 ℃，均以多肽含量為指標(biāo)。

1.2.1.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 基質(zhì)中微擬球藻添加量為1%（w/v），木瓜蛋白酶酶量1%（w/v）。在單組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，以酶量（A）、pH（B）、酶解時(shí)間（C）、酶解溫度（D）為自變量，以多肽含量為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法確定微擬球藻的酶解最佳工藝。響應(yīng)面優(yōu)化因素水平表如表1 所示。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化因素水平Table 1 Factors and level of response surface optimization

1.2.1.4 多肽含量的測(cè)定 多肽：采用OPA 法[10]。取50 μL 上清液，加入2 mL 0.8 mg/mL OPA 反應(yīng)液后靜置5 min，于340 nm 處測(cè)定吸光度值，以胰蛋白胨為標(biāo)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=3.2274x-0.3338，R2=0.9993。

1.2.2 微擬球藻的發(fā)酵

1.2.2.1 發(fā)酵菌種的活化 將4 個(gè)菌株接種于MRS液態(tài)培養(yǎng)基中活化，傳代培養(yǎng)2 次后放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)搖床上振蕩培養(yǎng)24 h 備用。

1.2.2.2 微擬球藻的發(fā)酵 微擬球藻酶解后添加2%葡萄糖和1%的蛋白胨作為基質(zhì)滅菌備用，分別接種KB1、KB2、KB3、KB4 四株乳桿菌，混菌處理接種四菌等比例混合后均質(zhì)得到的混合菌液，標(biāo)記為MIX。單菌和混菌發(fā)酵接種量均為1%，置于搖床培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)速80 r/min。對(duì)照（CK）組酶解滅菌后不進(jìn)行發(fā)酵處理，放置于常溫備用。取5 mL 發(fā)酵后的樣品于離心機(jī)5000 r/min 離心5 min，取上清液備用。

1.2.3 發(fā)酵微擬球藻營(yíng)養(yǎng)活性成分測(cè)定

1.2.3.1 菌量、產(chǎn)酸能力和還原糖含量的測(cè)定 菌量：將培養(yǎng)24 h 的發(fā)酵微擬球藻酶解液取100 μL在MRS 固體上進(jìn)行涂布，在37 ℃下培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照式（1）計(jì)算菌體密度（CFU/mL）。

式中，平板上的菌落數(shù)為C；100 μL 為V；稀釋倍數(shù)為M。

pH 和總酸：采用實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)測(cè)定pH。參考國(guó)標(biāo)GB/T 12456-2021 測(cè)定總酸。

還原糖：采用DNS 比色法[11]。取1 mL 上清液加入2 mL 的3,5-二硝基鄰羥基苯甲酸溶液煮沸8 min顯色，流水冷卻后加純凈水稀釋，在487 nm 下測(cè)定吸光度，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為標(biāo)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.1636x-0.1601，R2=0.9991。

1.2.3.2 總酚、黃酮和多肽含量的測(cè)定 總酚：采用Folin-Ciocalteu 法[12]。取0.2 mL 樣品上清液加入福林酚試劑反應(yīng)5 min 后加入3 mL 0.2 g/100 mL 碳酸鈉溶液，在75 ℃下反應(yīng)15 min，流水冷卻后在765 nm 下測(cè)其吸光度，以沒食子酸為標(biāo)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.0069x-0.0003，R2=0.9955。

黃酮：采用NaNO2-AlCl3法[13]。取3 mL 上清液，加入1 mL 0.5%的NaNO2反應(yīng)5 min，加入1 mL 1%的AlCl3后25 ℃水浴 6 min，加入10 mL 1%的NaOH 溶液，最后填補(bǔ)70%的乙醇至25 mL 反應(yīng)15 min，于510 nm 測(cè)定吸光度值，以榭皮素為標(biāo)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=3.4369x-0.0023，R2=0.9985。

多肽含量的測(cè)定同1.2.1.4。

1.2.3.3 抗氧化活性的測(cè)定 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定參照Martínez 等[14]方法。取2.5 mL 樣品上清液，加入7.5 mL DPPH 溶液暗處反應(yīng)30 min（A1），對(duì)照組用樣品加95%無(wú)水乙醇（A2），空白組用純凈水加DPPH 溶液（A0），在517 nm 處測(cè)得吸光度A1、A2、A0。用式（2）計(jì)算。

FRAP 參考Benzie 等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。取0.3 mL 樣品上清液，加入2.7 mL TPTZ 工作液37 ℃反應(yīng)15 min，在595 nm 處測(cè)其吸光度，以FeSO4為標(biāo)品得到回歸方程y=0.0037x+0.0003，R2=0.9999。

1.2.4 體外降血脂活性測(cè)定 ?；悄懰徕c結(jié)合率的測(cè)定參考何旭華等[16]的方法并稍作修改。取0.5 mL樣品上清液，加入2 mL 0.3 mmol/L ?；悄懰徕c溶液在37 ℃搖晃1 h 后，取0.5 mL 與2 mL 65%的硫酸溶液75 ℃水浴25 min 后冰浴10 min，387 nm 處測(cè)定吸光度為A樣品。A對(duì)照用60%乙醇溶液代替樣品，A空白用磷酸鈉緩沖液代替?；悄懰徕c，按式（3）計(jì)算。

胰脂肪酶抑制率的測(cè)定參考黃雪薇等[17]的方法并稍作修改。取1 mL 上清液與1 mL 0.5 mg/mL 胰脂肪酶溶液37 ℃反應(yīng)30 min，加入20 μL 4-硝基苯基丁酸酯溶液37 ℃反應(yīng)10 min，以加酶加樣品溶液為實(shí)驗(yàn)組Ai，不加入酶溶液為空白組A0，不加入樣品溶液為正常組A，在405 nm 處測(cè)定吸光值。按式（4）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 感官評(píng)價(jià)分析 組織12 名志愿者（6 男6 女，年齡18～40 周歲）進(jìn)行感官評(píng)測(cè)[18]，感官品評(píng)表見表2。將適量微擬球藻發(fā)酵酶解液倒入品嘗杯中并隨機(jī)排號(hào)，從四個(gè)方面進(jìn)行打分。

表2 微擬球藻發(fā)酵酶解液感官品評(píng)標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 Table of sensory evaluation criteria for fermentation enzyme hydrolysate of Nannochloropsis oceanica

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述試驗(yàn)均進(jìn)行三次平行測(cè)定，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Design-Expert 10 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)；用 SPSS 21 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及顯著性分析；用Excel 2010 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微擬球藻酶解的工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如圖1A 所示，隨著酶解時(shí)間的增加多肽含量逐漸增多，并在3 h 時(shí)出現(xiàn)了最大值，隨后下降。這可能是因?yàn)榛|(zhì)中的蛋白質(zhì)酶解后轉(zhuǎn)化為多肽被釋放出來(lái)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)多肽進(jìn)一步被降解為氨基酸，故而含量下降[19]。隨著酶量的增加多肽含量不斷增多，在4%時(shí)最高（圖1B），而后有下降趨勢(shì)。推測(cè)可能是酶量的增多導(dǎo)致微擬球藻中的成分被更充分的酶解從而使多肽被更多的釋放出來(lái)，而酶量過高時(shí)酶分子之間的相互水解作用導(dǎo)致了酶解效果下降，從而多肽含量下降[20]。隨著酶解pH 的提高，多肽含量先下降后上升再下降，在pH8 時(shí)含量最大（圖1C）。pH 影響酶分子和底物的離解狀態(tài)，如果pH 不在適當(dāng)范圍內(nèi)酶的活性就會(huì)減弱失活，降低酶水解效率[21]，而在pH8 時(shí)酶的活性得到充分的釋放，水解效率最高從而多肽含量最高。由圖1D 可知，隨著酶解溫度的增加，多肽含量先下降后緩慢上升再逐漸下降。當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，多肽含量最高，隨后溫度升高多肽含量下降。這可能是溫度對(duì)木瓜蛋白酶活性的影響，過低或過高的溫度都會(huì)影響酶活，而越接近最佳溫度酶活力越高，釋放的多肽越多。綜上，選擇酶解時(shí)間2～4 h、酶量3%～5%、酶解pH7～9 和酶解溫度60～80 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 微擬球藻酶解響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，以酶量（A）、pH（B）、酶解時(shí)間（C）、酶解溫度（D）為自變量，多肽含量為響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3 所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

通過Design-export 軟件進(jìn)行分析，得到多重二次響應(yīng)面回歸方程為：R=2.45+0.0731A+0.12B+0.15C+0.20D-0.18AB-0.030AC+0.17AD+0.030BC+0.085BD-0.077CD-0.23A2-0.67B2-0.015C2-0.26D2。根據(jù)表4 和對(duì)應(yīng)方程可知，A（酶量）、B（酶解pH）、C（酶解時(shí)間）和D（酶解溫度）對(duì)微擬球藻酶解液的多肽含量影響極顯著（P<0.01）。同時(shí)可以看出模型F=66.54，P<0.0001，模型極顯著，失擬項(xiàng)F=2.27，P>0.05，失擬項(xiàng)在回歸模型中無(wú)顯著性，說(shuō)明該模型擬合度好，R2=0.9852，R2adj=0.9704，結(jié)果表明，該回歸模型可以解釋97.04%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異，與實(shí)際情況吻合較好。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

圖2 為兩因素交互作用對(duì)多肽含量影響的3D 圖。可以觀察到交互項(xiàng)A（酶量）B（酶解pH）和交互項(xiàng)A（酶量）D（酶解溫度）對(duì)微擬球藻酶解液的多肽含量影響極顯著；交互項(xiàng)B（酶解pH）D（酶解溫度）和交互項(xiàng)C（酶解時(shí)間）D（酶解溫度）對(duì)微擬球藻酶解液的多肽含量影響顯著；交互項(xiàng)A（酶量）C（酶解時(shí)間）和交互項(xiàng)B（酶解pH）C（酶解時(shí)間）對(duì)微擬球藻酶解液的多肽含量影響不顯著。

圖2 交互項(xiàng)對(duì)微擬球藻多肽含量影響的響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface diagram of the influence of interaction terms on the polypeptide content of Nannochloropsis oceanica

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到最優(yōu)微擬球藻酶解工藝為酶量5.000%、pH8.009、酶解時(shí)間4.000 h、酶解溫度75.635 ℃，多肽含量的理論值為2.484 mg/mL。為便于實(shí)際操作，將其修改為酶量5%、pH8.0、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度76 ℃，試驗(yàn)得含量為2.45 mg/mL，與最佳值接近，說(shuō)明該模型可用。

2.2 微擬球藻發(fā)酵酶液特性的變化

益生菌增殖是微擬球藻中有效物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的前提。微擬球藻發(fā)酵24 h 后，混菌組活菌數(shù)最多，KB1 次之，菌量均大于107CFU/mL（圖3A），說(shuō)明微擬球藻是益生菌較好的生長(zhǎng)基質(zhì)，但是不同菌株之間具有一定的差異性，同時(shí)從側(cè)面反映了微擬球藻在混菌發(fā)酵過程中乳桿菌之間的協(xié)同作用更加突出[22]，所以混菌組有相對(duì)最多的活菌數(shù)。

圖3 微擬球藻酶解液發(fā)酵24 h 后菌量（A）、pH（B）、總酸（C）、還原糖（D）的變化Fig.3 The changes of viable count (A), pH (B), total acid (C)and residual sugar (D) after 24 h fermentation of enzymatic hydrolysate of Nannochloropsis oceanica

如圖3B、3C 所示，益生菌發(fā)酵24 h 后pH 均顯著下降（P<0.05），總酸含量顯著增加（P<0.05）。與CK 組相比，各發(fā)酵處理總酸提高了4.9～6.1 倍。益生菌發(fā)酵可通過戊糖磷酸途徑（HMP）和糖酵解途徑（EMP）途徑將基質(zhì)中的糖類代謝產(chǎn)生乳酸和CO2，其中，CO2會(huì)形成碳酸，醛類會(huì)被氧化成酸類，從而降低發(fā)酵液的pH[23]?？芍l(fā)酵后微擬球藻酶液產(chǎn)酸降低了發(fā)酵液的pH，且提高了其總酸的含量。

由圖3D 可看出，發(fā)酵組的還原糖含量顯著下降（P<0.05），其中KB4 發(fā)酵降幅最大，達(dá)57.6%。由于發(fā)酵過程中乳酸菌對(duì)微擬球藻基質(zhì)中的糖類物質(zhì)進(jìn)行降解代謝，為自身生長(zhǎng)繁殖利用，導(dǎo)致還原糖含量降低[24]?？芍闂U菌在發(fā)酵微擬球藻酶液的過程中利用了還原糖促進(jìn)自身的繁殖。

2.3 發(fā)酵微擬球藻酶液主要活性成分的變化

植物基質(zhì)經(jīng)益生菌發(fā)酵后，經(jīng)過一系列生物轉(zhuǎn)化，可顯著改變基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和功能組分[5]。如圖4A 所示，不同處理?xiàng)l件下，總酚含量分別在9.3±0.1～10.0±0.0 μg/mL 之間，與CK 組相比，發(fā)酵組有上升且存在顯著性差異（P<0.05）?？偡雍康奶岣呖赡苁怯捎诎l(fā)酵過程產(chǎn)生的淀粉酶、纖維素酶等水解酶促進(jìn)了總酚物質(zhì)的釋放，也可能與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的單寧酶有關(guān)，單寧酶可以將復(fù)雜單寧降解為游離酚類物質(zhì)從而提高總多酚的含量[25]，所以發(fā)酵后微擬球藻酶液中多酚含量會(huì)有上升的趨勢(shì)。

圖4 微擬球藻酶解液發(fā)酵24 h 后的總酚（A）、多肽（B）、黃酮（C）含量的變化Fig.4 The changes of total phenol (A), polypeptide (B) and flavone (C) contents after 24 h fermentation of enzymatic hydrolysate of Nannochloropsis oceanica

如圖4B 所示，發(fā)酵可顯著提高微擬球藻多肽含量（P<0.05），與CK 相比，混菌組多肽含量提高了近1.3 倍。其原因可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌株產(chǎn)酶量增加，特別是混菌酶系更加豐富，進(jìn)一步酶切木瓜蛋白酶未發(fā)揮作用的位點(diǎn)使多肽增加，也有可能是微擬球藻在發(fā)酵過程中細(xì)胞的破壞程度不同，有效破壞微擬球藻細(xì)胞壁有利于胞內(nèi)有效成分釋放，使某些成分發(fā)生生物轉(zhuǎn)化或者破壞一些大分子蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，從而將蛋白質(zhì)分解成多肽等小分子物質(zhì)[26]，所以發(fā)酵后微擬球藻酶液中多肽含量會(huì)顯著上升。

由圖4C 可知，除KB1 組外其余組發(fā)酵后總黃酮含量顯著下降（P<0.05）。其中，KB2 組總黃酮下降幅度最大，降幅為47.3%，一個(gè)可能原因是乳桿菌產(chǎn)生的二次代謝產(chǎn)物與黃酮化合物反應(yīng)生成衍生物；另一種可能性是乳桿菌酶系種類繁多，不同的酶系可引發(fā)的化學(xué)反應(yīng)不同，若黃酮類成分因乳桿菌酶的酶解作用發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，也可能產(chǎn)生發(fā)酵后含量降低的情況[27]。綜上，發(fā)酵后微擬球藻酶液中總酚和多肽的含量有上升趨勢(shì)而黃酮含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.4 發(fā)酵微擬球藻酶液抗氧化活性的變化

乳酸菌發(fā)酵可以促進(jìn)植物基質(zhì)中活性物質(zhì)的釋放及新活性成分的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)發(fā)酵基質(zhì)的生物活性功能[28-30]。Niccolai 等[31]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵螺旋藻能顯著提高其抗氧化能力。由圖5A 可知，與CK 相比，發(fā)酵組的DPPH 自由基清除率顯著提高（P<0.05），其中，MIX 發(fā)酵組清除率最高，較CK 提高了119.8%。FRAP 代表的是亞鐵離子濃度，濃度越高樣品的抗氧化能力越強(qiáng)[32]。由圖5B 可以看出，發(fā)酵可明顯提高其鐵離子還原力，KB3 發(fā)酵組和MIX 發(fā)酵組與CK 組差異顯著（P<0.05），增幅為3.3%～24.3%。

圖5 微擬球藻酶解液發(fā)酵24 h 后的抗氧化活性的變化Fig.5 The change of antioxidant activity after 24 h fermentation of enzymatic hydrolysate of Nannochloropsis oceanica

抗氧化能力一般與黃堿素和植物單寧的含量呈顯著正相關(guān)[13]，且多肽等成分也有很好的抗氧化活性，從本文結(jié)果來(lái)看，發(fā)酵后總酚和多肽含量上升而黃酮含量下降，可能原因是發(fā)揮抗氧化作用的成分發(fā)生了改變，具有更高抗氧化活性物質(zhì)的含量增加[33]。因此推測(cè)微擬球藻酶解后在益生菌的作用下，產(chǎn)生了一些有效的次生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物取代了原來(lái)的活性成分發(fā)揮了抗氧化作用?？梢?，乳酸菌發(fā)酵可提高微擬球藻酶解液的抗氧化活性，但具有明顯的菌株差異。

2.5 發(fā)酵微擬球藻酶液降血脂活性的變化

膽汁酸鹽（膽汁酸的鈉鹽）可以增強(qiáng)脂肪和脂溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在腸道中的水解程度，促進(jìn)身體的消化吸收，因此樣品對(duì)膽酸鹽的結(jié)合率可以反映其降血脂的能力[34]。胰脂肪酶可促進(jìn)脂肪的分解和吸收，抑制胰脂肪酶活性可以減少體內(nèi)甘油單酯和脂肪酸，從而起到降血脂的作用[35]。如圖6A、6B 所示，不同菌株發(fā)酵微擬球藻酶液的?；悄懰徕c結(jié)合率和胰脂肪酶抑制率各不相同。其中，KB1、KB2 和KB3 發(fā)酵組的牛磺膽酸鈉結(jié)合率顯著增加（P<0.05），分別較CK 組提高2.5%、2.9%和3.3%，而KB4 和MIX 發(fā)酵組變化不顯著（P>0.05）；KB2、KB3 和KB4 和MIX 發(fā)酵組的胰脂肪酶抑制率顯著提高（P<0.05），與CK 組相比增幅分別為23.9%、20.5%、17.2%和59.4%，而KB1 發(fā)酵組變化不顯著（P>0.05）。微擬球藻發(fā)酵產(chǎn)物的?；悄懰徕c結(jié)合能力和胰脂肪酶活力抑制能力的不同可能與乳酸菌在基質(zhì)中產(chǎn)生的特異性物質(zhì)有關(guān)[36]。乳桿菌結(jié)合膽酸鹽能力可能與其產(chǎn)生的膽鹽水解酶有關(guān)，在厭氧條件下催化分離結(jié)合態(tài)的膽鹽為去結(jié)合型膽鹽[37]，從而提高膽酸鹽結(jié)合能力，乳酸菌膽鹽水解酶不同，催化分離結(jié)合態(tài)膽鹽的能力也就不同，所以發(fā)酵?；悄懰徕c結(jié)合率不同。從發(fā)酵后胰脂肪酶抑制活性變化可知，混菌發(fā)酵后的抑制活性最高，推測(cè)其原因可能是多個(gè)乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的某些有效物質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)存在差異，而這些物質(zhì)在抑制脂肪酶活性上存在一定的協(xié)同效應(yīng)[38]。綜上可知，酶菌協(xié)同處理微擬球藻是提高其降血脂活性的有效方法。

圖6 微擬球藻酶解液發(fā)酵24 h 后的降血脂活性的變化Fig.6 The change of hypolipidemic activity after 24 h fermentation of enzymatic hydrolysate of Nannochloropsis oceanica

2.6 發(fā)酵微擬球藻酶液的感官評(píng)定

感官評(píng)定總分是香氣、滋味、外觀色澤、總體可接受性四部分總分之和。由圖7 可知，發(fā)酵對(duì)微擬球藻感官評(píng)價(jià)有積極作用，未經(jīng)發(fā)酵的CK 組感官評(píng)價(jià)最低，總分為46.6±8.6 分，發(fā)酵后均有提高，且混菌發(fā)酵MIX 組為最高總分64.2±6.2 分，二者差異顯著（P<0.05），尤其是發(fā)酵后滋味顯著改善，能明顯區(qū)別出未發(fā)酵與發(fā)酵微擬球藻，發(fā)酵后的微擬球藻對(duì)其自身的腥味等異味有很大的改善作用。

圖7 發(fā)酵對(duì)微擬球藻酶解液感官評(píng)定的影響Fig.7 The effect of fermentation on sensory evaluation of enzymatic hydrolysate of Nannochloropsis oceanica

腥味物質(zhì)主要有多不飽和脂肪酸、醛類、胺類和酮類物質(zhì)[39]，而乳酸菌發(fā)酵可以將醛類、酮類等轉(zhuǎn)化為醇類和酯類等風(fēng)味物質(zhì)[40]，從而緩解不良風(fēng)味。從感官評(píng)定結(jié)果可以得知，通過發(fā)酵處理可以顯著改善風(fēng)味，特別是混菌發(fā)酵效果最佳。混菌發(fā)酵能夠彌補(bǔ)單一菌株的不足，各菌株之間發(fā)揮協(xié)同作用，協(xié)同眾多的酶系參與蛋白質(zhì)、多糖等復(fù)雜成分的合成從而改善風(fēng)味。顧賽麒等[41]報(bào)道了發(fā)酵海帶后揮發(fā)物數(shù)量降至24 種且感官評(píng)分到達(dá)70 分，即發(fā)酵可改善海帶的感官品質(zhì)。從本實(shí)驗(yàn)來(lái)看，盡管微擬球藻經(jīng)發(fā)酵后感官風(fēng)味有顯著提升，但是總體上得分較低，可能是由于該藻本身腥味較重，單純發(fā)酵所改善的程度還很難達(dá)到讓人愉悅的感官體驗(yàn)，后期還需結(jié)合其他去腥和改善風(fēng)味的方法，從產(chǎn)品研發(fā)的角度進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

本文以微擬球藻藻泥為原料，采用木瓜蛋白酶酶解微擬球藻，利用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)獲得其最佳酶解工藝為：酶量5.0%、pH8.0、酶解時(shí)間4.0 h、酶解溫度76 ℃；隨后通過益生菌發(fā)酵酶解基質(zhì)，酶菌協(xié)同處理后多肽的含量提高了20.9%～126.1%，總酚含量的提高幅度在4.3%～7.2%，同時(shí)總黃酮的含量降低幅度在28.1%～47.3%，混菌發(fā)酵組DPPH 自由基清除率提高了119.8%而胰脂肪酶清除率提高了59.4%。

綜上所述，微擬球藻酶解液發(fā)酵后的多肽含量及抗氧化活性和降血脂活性顯著提高，具有輔助治療高血脂的潛在功效。然而后期還需全面分析益生菌發(fā)酵對(duì)微擬球藻產(chǎn)物中營(yíng)養(yǎng)功能成分的影響，解析物質(zhì)變化規(guī)律，同時(shí)利用動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其在慢性疾病防治方面的作用效果并闡釋相關(guān)機(jī)制。此外，盡管發(fā)酵后風(fēng)味顯著改善，在研發(fā)消費(fèi)者能普遍接受的產(chǎn)品方面還需進(jìn)行更深入的研究?？傊?，酶菌協(xié)同處理是微擬球藻高值化利用的有效方式，可利用微擬球藻發(fā)酵產(chǎn)物開發(fā)功能型食品。