巫永華，王解語，黃莉莉，潘斯岑，張建萍，劉恩岐

（徐州工程學院江蘇省食品資源開發(fā)與質量安全重點建設實驗室，江蘇徐州 221018）

牛蒡是藥食兩用的植物，具有很高的營養(yǎng)和保健價值，牛蒡根含有豐富的菊糖、多酚、蛋白質、膳食纖維、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分[1]，被開發(fā)成了牛蒡茶、牛蒡飲料、牛蒡酒等產(chǎn)品。多酚化合物，包括綠原酸、蘆丁、咖啡酸、槲皮素等，是牛蒡中的主要活性成分之一，具有抗氧化、降血糖、保肝護肝、降血脂、抗過敏的等多種生物活性[2]，引起了廣泛關注，研究人員對其制備技術和生物活性進行了探討[3-5]，但多以有機溶劑為提取劑制備牛蒡多酚，存在易燃、易爆、易揮發(fā)和有毒有害等缺點，因此有必要探討綠色、安全高效的牛蒡多酚制備工藝。

低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DESs）是由氫鍵受體和氫鍵供體在適當?shù)哪柋葮嫵傻?，季銨鹽類為最常用的氫鍵受體，而尿素、有機酸、多元醇、糖類等則常作為氫鍵供體，其熔點一般會遠低于各組分的熔點，具有原料易得、合成方便、無需純化、無毒性、不易燃、可回收、可降解等一系列優(yōu)點，在綠色溶劑領域內(nèi)應用廣泛，有代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機溶劑的巨大潛質[6]。Ali 等[7]研究表明超聲波輔助DES（氯化膽堿:對甲苯磺酸=1:2）較傳統(tǒng)提取方法能明顯提高枸杞果實中包括楊梅素、桑色素和蘆丁在內(nèi)的黃酮類化合物的得率；Cui 等[8]研究表明DES 提取沙棘葉中黃酮類化合物的效果明顯優(yōu)于70%乙醇溶劑；Tatjana 等[9]提取薄荷中的總酚和Paula 等[10]從橄欖葉中提取酚類化合物的研究中都得到了相似的結果，表明DES 是一種新型和有效的從植物中提取活性成分的綠色溶劑，而采用綠色環(huán)保的DESs 提取牛蒡多酚還未見報道。

本文研究篩選適合提取牛蒡多酚的DESs 體系，并通過Box-Behnken 設計優(yōu)化超聲波輔助DESs 提取牛蒡多酚的最佳工藝，并通過測定DPPH?清除能力、總還原力、對α-葡萄糖苷酶的抑制作用和膽酸鹽的結合能力，分析其體外生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛蒡 購于農(nóng)副產(chǎn)品市場；氯化膽堿、丙二醇、丙三醇、乳酸、乙二醇、乙酰丙酸、沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、福林酚、抗壞血酸、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS） AB-8 大孔吸附樹脂（比表面積 480～520 m2/g） 上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、碳酸鈉、檸檬酸 國藥集團化學試劑有限公司公司；總膽汁酸測試盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

SB-120D 超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16G 高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；HL-2S 恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；真空冷凍干燥機 德國CHRIST 公司；TU-1810 紫外分光光度計 北京普析通用有限公司；L550 離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；1260Ⅱ高效液相色譜儀（配二極管陣列（DAD）檢測器、自動進樣器進樣，Agilent C18色譜柱） 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛蒡的預處理 將新鮮牛蒡根清洗晾干后切片，置于1%的檸檬酸溶液中浸泡5 min，瀝干水分后，于60 ℃恒溫干燥箱中干燥，粉碎，過60 目篩，于-20 ℃冰箱中保存，待用。

1.2.2 多酚含量的測定 參考文獻[11]采用福林-酚比色法測定多酚含量，稍作修改，以沒食子酸為標準品，分別取一定體積的沒食子酸標準液于10 mL 棕色容量瓶中，分別加入1 mL 10%的福林-酚試劑，搖勻，靜置5 min 后加入10 mL 7% Na2CO3，避光放置30 min，設置空白，測定765 nm 的吸光度。所得回歸方程為y=0.0095x+0.0547，R2=0.9959；樣品測定時，將樣品適當稀釋，取1 mL 稀釋液按上述步驟進行測定，按公式（1）計算得率。

式中：c 為多酚的質量濃度（mg/mL）；n 為樣品的稀釋倍數(shù)；V 為上清液液總體積（mL）；m 為樣品質量（g）。

1.2.3 低共熔溶劑的制備與牛蒡多酚提取過程DESs 由氫受體（氯化膽堿）與氫供體（葡萄糖、乳酸、乙二醇等）按照不同摩爾比混勻、加熱制得。分別取一定量的反應物于100 mL 試劑瓶中，放置于80 ℃水浴鍋中加熱攪拌得到均一透明液體，冷卻至室溫，即得DESs，保存于干燥容器中，備用。

準確稱取50 mg 牛蒡粉末置于離心管中，加入1 mL DESs，搖勻，置于超聲波清洗器中提取，然后于5000 r/min 離心15 min，收集上清液測定多酚含量。

1.2.4 超聲波輔助低共熔溶劑提取牛蒡多酚的工藝優(yōu)化

1.2.4.1 最佳DESs 體系的確定 以氯化膽堿作為氫供體，按表1 所示配制不同體系的DESs，由于體系黏度較大，都加入30%的水，篩選最佳的DESs。

表1 DESs 組成Table 1 Composition of the DESs

1.2.4.2 單因素實驗 在確定最佳DESs 體系的基礎上，以料液比55:1 mg/mL，提取溫度50 ℃，提取時間為30 min，研究不同含水率（10%、20%、30%、40%和50%）對牛蒡多酚得率的影響；以含水率為40%，提取溫度50 ℃，提取時間為30 min，研究不同料液比（25:1、35:1、45:1、55:1、65:1 和75:1 mg/mL）對牛蒡多酚得率的影響；以含水率為40%，料液比55:1 mg/mL，提取時間為30 min，研究不同提取溫度（30、40、50、60 和70 ℃）對牛蒡多酚得率的影響；以含水率為40%，料液比55:1 mg/mL，提取溫度50 ℃，研究不同提取時間（10、20、30、40 和50 min）對牛蒡多酚得率的影響。

1.2.4.3 響應面優(yōu)化試驗設計 在單因素實驗的基礎上，采用響應面法（BBD-RSM）試驗設計，考查含水率（A）、提取溫度（B）和提取時間（C）3 個對牛蒡多酚得率的影響，因素與水平見表2。

表2 響應面分析因素與水平Table 2 Response surface analysis factors and levels

1.2.5 大孔吸附樹脂富集回收牛蒡多酚 參考Cui等[8]報道的方法，將活化好的AB-8 大孔吸附樹脂填充在玻璃柱中（40 mm×600 mm）用于牛蒡多酚的富集。將在最佳提取條件獲得到的50 mL 提取液以3 BV/h 的恒定流速流過柱，在樣品吸附達到平衡后，首先用500 mL 去離子水洗脫，然后用500 mL 70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，旋轉蒸發(fā)后冷凍干燥，于-20 ℃下保存，備用。

1.2.6 牛蒡多酚的生物活性研究

1.2.6.1 清除 DPPH?能力測定 參照郎明紫等[12]報道的方法測定樣品清除DPPH?的能力，并稍作修改，配置質量濃度3～45 μg/mL 的牛蒡多酚溶液，各取2 mL 于試管中，加入2 mL 0.05 mmol/L 的DPPH-乙醇溶液，混合均勻，避光反應30 min 后，使用0.5 cm光圈的比色皿測定517 nm 處的吸光度值，記為A1；以樣品和無水乙醇的為對照管，記為A2；以無水乙醇和DPPH 溶液的為空白管，記為A0；并以抗壞血酸作為陽性對照，按公式（2）計算DPPH?清除率。

1.2.6.2 總還原力的測定 參照劉文穎等[13]報道的方法測定樣品總還原力，并稍作修改，配制質量濃度0.2～2.0 mg/mL 的牛蒡多酚溶液，各取1 mL 加入離心管中，加入0.2 mmol/L 磷酸緩沖（pH 為6.6）溶液2 mL 和1%的鐵氰化鉀溶液1 mL，混勻后于50 ℃恒溫水浴鍋中反應20 min，冷卻后加入10%的三氯乙酸溶液2 mL，渦旋混勻，3000 r/min 離心10 min，取上清液2 mL 于試管中，加入2 mL 蒸餾水，最后加入0.4 mL 0.1%的FeCl3溶液，反應10 min 后使用0.5 cm 光圈的比色皿測定700 nm 處的吸光值，吸光值越高，表示還原力越強。

1.2.6.3 抑制α-葡萄糖苷酶活性測定 參照於雨碟等[14]報道的方法測定樣品抑制α-葡萄糖苷酶活性，并稍作修改，配制不同濃度的樣品溶液，于試管中分別加入樣品溶液、α-葡萄糖苷酶溶液（40 U/mL）和5 mmol/L PNPG 試劑各100 μL，再加入700 μL 磷酸緩沖液（pH6.0），混勻后在37 ℃水浴30 min，然后立即加入2 mL 0.1 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應。5 min 后用0.5 cm 光圈的比色皿測定405 nm的吸光值，記為A1；以磷酸緩沖液代替PNPG 試劑的吸光值，記為A2；以磷酸緩沖液代替樣品溶液的吸光值，記為A0；以阿卡波糖作為陽性對照，按照公式（3）計算抑制率。

1.2.6.4 牛黃膽酸鹽結合能力的測定 參照古麗米熱?祖努納等[15]報道的方法測定樣品結合牛黃膽酸鹽的能力，并稍作修改，取不同質量濃度的牛蒡多酚1 mL 于試管中，加入0.01 mol/mL 的HCl 1 mL，在37 ℃下模擬胃消化振蕩消化1 h 后，用0.1 mol/mL NaOH 調(diào)pH 至6.90，再分別加入1.5 mL 0.3 mmol/mL牛黃膽酸鈉溶液和2 mL 10 mg/mL 胰酶溶液，再于37 ℃下振蕩消化1 h，于4500 r/min 離心20 min 后取上清液，按試劑盒的方法測定上清液中的總膽汁酸（TBA）含量。后按照公式（4）計算結合率。

1.2.7 牛蒡多酚的組分分析 參考文獻[16]的方法對牛蒡多酚進行分析。配置沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和蘆丁的單一標準液和混合標準品，樣品用甲醇溶解，測定前用0.22 μm 濾膜過濾。流動相 A 為 0.8%乙酸，B 為甲醇，柱溫 28 ℃，進樣量 10 μL，流速 0.9 mL/min，梯度洗脫程序見表3 所示。用單一標準品繪制標準曲線后根據(jù)峰面積計算樣品中組分的含量。

表3 梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution method

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3 次，采用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，采用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)差異性進行分析；IC50值由曲線增長階段擬合線性方程后計算獲得（抑制率為50%或吸光值為0.5 時的樣品質量濃度）。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助低共熔溶劑提取牛蒡多酚的工藝確定

2.1.1 最佳低共熔溶劑體系的選擇 DESs 的黏度、極性、溶解性和表面張力等理化特性會隨著其氫供體和氫受體的組成和摩爾比的變化而改變，而這些特性是影響其對天然產(chǎn)物提取效率的重要原因[17]。試驗依據(jù)氫鍵供體的不同設計了三類DESs，分別為多元醇類（丙二醇、丙三醇、乙二醇）、糖類（葡萄糖）和羧酸類（乳酸、乙酰丙酸），考查不同的DESs 對多酚得率的影響，結果如圖1 所示，6 種DESs 中，DES-5 對多酚的提取效果最佳，得率為1.08%，顯著高于其他組分和80%乙醇組（P<0.05）；Cui 等[18]在考察DESs 提取綠茶多酚時，也得到相似的結果，并認為可以用“相似相溶”的原理來解釋。故選擇DES-5（氯化膽堿/乙二醇，摩爾比1:4）進行后續(xù)試驗。

圖1 不同溶劑體系對牛蒡多酚得率的影響Fig.1 Effects of different DESs on the yield of BPs

2.1.2 含水率的選擇 受氫鍵、范德華力等作用的影響，DESs 一般具有較高的黏度，使其不易擴散到提取物的內(nèi)部，影響目標活性物質的傳質速率[19]。在DESs 中加入適量的水能降低其黏度，改變體系的表面張力，使其更易進入細胞內(nèi)部，改善提取效率[20]。不同含水率對多酚提取效率的影響結果見圖2 所示，隨著含水率的增加，牛蒡多酚的得率先升高，在含水率為40%時達到最高，而當含水率超過40%時，多酚得率快速下降，這可能是由于過量的水會減弱DESs 與多酚之間的相互作用[21]。因此選擇40%左右的含水率進行后續(xù)試驗。

圖2 深共熔溶劑含水率對牛蒡多酚得率的影響Fig.2 Effect of water content on the yield of BPs

2.1.3 料液比的選擇 料液比對牛蒡多酚得率的影響如圖3 所示，料液比在25:1～55:1 mg/mL 時，牛蒡多酚的得率呈略微上升趨勢，且當料液比為55:1 mg/mL 時得率達到最高值，而當料液比從55:1 mg/mL增大到75:1 mg/mL 時，得率呈快速下降趨勢。這是由于在提取過程中，適當?shù)脑龃罅弦罕?，必然會導致傳質推動力的提高，有利于多酚的提取[22]。然而，當溶質和溶液的比例擴大到一定程度后，萃取劑對多酚的提取已經(jīng)達到飽和，再提高料液比可能會導致已被提取的多酚脫附重回到待提取物中[23]，也會增加雜質的溶出，造成得率的下降。料液比從25:1 增大到55:1 過程中，對牛蒡多酚的得率影響較小，因此在后續(xù)工藝優(yōu)化中選擇料液比為55:1 mg/mL 進行試驗。

圖3 料液比對牛蒡多酚得率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on the yield of BPs

2.1.4 提取溫度的選擇 提取溫度對牛蒡多酚得率的影響見圖4 所示，溫度在30～50 ℃內(nèi)，多酚得率隨溫度的增高而增大，并在50 ℃時達到頂峰，隨后再升高溫度時，多酚得率逐漸下降。結果與尚憲超[24]提取煙草綠原酸結果相似?？赡苁怯捎谶m當?shù)靥岣邷囟瓤梢越档?DESs 的黏度，加速分子運動，使細胞內(nèi)部的多酚類物質快速地擴散到溶劑中[25]；但當溫度過高時，多酚的結構會被破壞，從而得率就會下降。因此選擇50 ℃左右的溫度進行后續(xù)試驗。

圖4 提取溫度對牛蒡多酚得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the yield of BPs

2.1.5 提取時間的選擇 提取時間對牛蒡多酚得率的影響見圖5 所示，提取時間在10～40 min 時，牛蒡多酚的得率逐漸上升，并在40 min 時達到最高，之后多酚的得率開始下降。可能是由于過長的提取時間，會導致已溶出的多酚發(fā)生分解，從而使得率下降[26]。因此選擇40 min 左右的提取時間進行后續(xù)試驗。

圖5 提取時間對牛蒡多酚得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of BPs

2.1.6 響應面優(yōu)化試驗結果

2.1.6.1 回歸模型分析 單因素實驗表明，料液比對結果的影響較小，而含水率（A）、提取溫度（B）和提取時間（C）對結果影響較大，同時為了優(yōu)化獲得最佳的工藝條件，選擇這三個因素最佳的單因素結果附近的值進行響應面設計試驗，結果見表4，通過軟件分析，得到牛蒡多酚得率（Y）的回歸方程：Y=1.16-0.084A-0.062B+0.051C+0.047AB+0.001AC-0.078BC-0.26A2-0.17B2-0.18C2。

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 Response surface test design and results

對結果進行響應面回歸分析，結果見表5 所示，由表5 可知，模型P<0.0001（極顯著）；而表示模型與試驗擬合程度的失擬項P>0.05（不顯著），說明所得模型成立。模型的決定系數(shù)R2=0.9774，表明該模型的試驗值與預測值擬合度良好的；校正決定系數(shù)R2Adj=0.9501，表明本模型可以解釋95.01%響應值的變化。綜上，試驗所得的模型可以對低共熔溶劑提取牛蒡多酚工藝進行分析預測。此外，一次項A、B 和二次項A2、B2、C2對牛蒡多酚得率影響極顯著（P<0.01），一次項C 及交互項BC 對結果影響顯著（P<0.05），由圖6（c）中也可看出提取溫度與提取時間相互作用的等高線呈橢圓形，進一步表明兩者相互作用顯著，3D 響應面圖可看出提高溫度和延長提取時間時，牛蒡多酚得率先增大后減??；三個自變量對多酚得率的影響程度為含水率（A）>提取溫度（B）>提取時間（C）。

圖6 各因素交互作用的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plot of interaction of various factors

表5 二次響應面回歸模型方差分析結果Table 5 Analysis of variance of quadratic response surface regression model

2.1.6.2 最佳工藝確定 通過響應面版軟件分析得到最佳條件為：料液比55:1 mg/mL 含水率為39.08%、溫度48.71 ℃、時間40.97 min，在該條件下預測牛蒡多酚的得率為1.185%。為方便操作，修正條件為料液比為55:1 mg/mL，含水率為40%、提取溫度49 ℃、時間為41 min，進行三次平行實驗，得到牛蒡多酚的得率為1.19%±0.11%，結果與預測的理論值相近，表明模型擬合良好，優(yōu)化條件可信，該模型可以用于預測牛蒡多酚的提取狀況。

2.2 大孔吸附樹脂對牛蒡多酚的純化效果

由表6 可知，采用試驗優(yōu)化的條件制備的牛蒡粗多酚的純度為16.21%±1.32%，經(jīng)AB-8 大孔樹脂純化后其純度提高到了67.86%±1.54%，顯著提高了其純度（P<0.05），提示AB-8 大孔樹脂能較好地去除牛蒡粗多酚中糖類和色素等雜質，有效實現(xiàn)了牛蒡多酚組分的富集、純化。

表6 AB-8 大孔吸附樹脂對牛蒡多酚的純化效果Table 6 Purification effect of BPs by AB-8 macroporous adsorption resin

2.3 牛蒡多酚的生物活性分析

2.3.1 牛蒡多酚體外抗氧化活性試驗結果 牛蒡多酚清除DPPH?和總還原力的結果見圖7 所示，牛蒡多酚和VC都具有較強的DPPH?清除能力和還原力，在實驗濃度范圍內(nèi)，二者的清除率都隨著濃度的增加而呈現(xiàn)著良好增加的趨勢。由7A 可知，當牛蒡多酚的濃度為35 μg/mL 時，清除率為81.42%，再提高樣品濃度時，清除率基本不變；對曲線回歸后計算得出牛蒡多酚和VC清除DPPH?的IC50值分別為7.03 μg/mL和0.27 μg/mL，其總還原能力的IC50值分別為0.93 mg/mL 和0.06 mg/mL，提示其具有較好的抗氧化活性，但牛蒡多酚對DPPH?自由基的清除能力和總還原力都低于對照品VC。范金波等[27]和蔡茜彤等[5]研究也發(fā)現(xiàn)牛蒡多酚具有較好的抗氧化活性，與本結果相似。

圖7 牛蒡多酚的抗氧化試驗結果Fig.7 Antioxidant capacity of BPs

2.3.2 牛蒡多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗結果

α-葡萄糖苷酶作為消化碳水化合物和葡萄糖釋放的關鍵酶，通過抑制其活性，可以防止餐后血糖水平升高，對于治療和預防糖尿病具有重要的意義[28]。由圖8 可知，牛蒡多酚對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制作用，隨著牛蒡多酚濃度的增加抑制率也提高。牛蒡多酚和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制率的IC50值分為0.13 和0.37 mg/mL，牛蒡多酚的抑制率約為阿卡波糖的2.85 倍，提示牛蒡多酚具有較強的降血糖能力。喬錦莉等[29]從野生藍果忍冬果實中提取的多酚也表現(xiàn)出較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖8 牛蒡多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制能力Fig.8 α-Glucosidase inhibition of BPs

2.3.3 對膽酸鹽結合能力 膽酸鹽能通過“肝腸循環(huán)”而再利用，通過結合膽酸鹽，肝臟會將膽固醇轉化成膽汁酸，從而降低血液的膽固醇含量，達到降低血脂的效果[30]。樣品對膽酸鹽的吸附能力越強則降血脂效果越好。由圖9 可知，牛蒡多酚對膽酸鹽的結合能力隨著濃度的升高而逐漸增大，當質量濃度為1.5 mg/mL 時，結合率為33.23%，繼續(xù)增大濃度后，結合率基本不變，提示牛蒡多酚有一定的膽酸鹽結合能力，具有一定的降血脂能力。徐一凡等[31]研究發(fā)現(xiàn)桑黃多酚具有一定的膽酸鹽吸附能力，與本結果相似。

圖9 對牛黃膽酸鈉的結合能力Fig.9 Binding ability to sodium taurocholate

2.4 牛蒡多酚的組分分析結果

HPLC-DAD 分析牛蒡多酚的組分結果見圖10和表7，牛蒡多酚中主要峰的出峰時間與標準品中的3、4 和5 號峰的出峰時間基本一致，推測牛蒡多酚中主要含有綠原酸、咖啡酸和阿魏酸，其中綠原酸含量最高，為（63.25±1.12）μg/mL，蔡茜彤[32]也研究發(fā)現(xiàn)牛蒡中含有綠原酸、咖啡酸和阿魏酸，且綠原酸含量較高，結果與本試驗結果一致。

圖10 多酚標準品（A）和牛蒡多酚（B）的HPLC 圖Fig.10 HPLC results of polyphenols standard (A)and BPs (B)

表7 牛蒡多酚組分及含量Table 7 Compositions and contents of BPs

3 結論

本文篩選出對牛蒡多酚提取效果最佳的低共熔溶劑體系，采用響應面確定的超聲波輔助低共熔溶劑提取牛蒡多酚的最佳工藝為，采用DES 5（氯化膽堿:乙二醇摩爾比為1:4）為提取劑，在含水率40%，料液比55:1 mg/mL，溫度49 ℃和提取時間為41 min時，牛蒡多酚的得率最高，為1.19%±0.11%。牛蒡多酚提取物經(jīng)AB-8 大孔樹脂富集、純化后，純度顯著提高，且其具有較強的總還原力、清除DPPH 自由基能力和對α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力，并表現(xiàn)出一定的膽酸鹽結合能力；結果提示牛蒡多酚較好的抗氧化效果和降血糖能力，并具有一定的降血脂能力。HPLC 分析表明牛蒡多酚中綠原酸含量最高，另外還含有咖啡酸和阿魏酸。本研究為牛蒡多酚的綠色、安全制備提供了一定的基礎，也為其作為天然抗氧化劑和降糖活性物質的研究提供了一定的理論依據(jù)。