蘭冬雪，瞿茜楠，于浩東，黃 天，彭傳濤，姚國強(qiáng)，趙金山，李兆杰,*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109；2.青島特種食品研究院，山東青島 266109；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

根據(jù)國際益生菌和益生元科學(xué)協(xié)會（ISAPP）2021 年發(fā)布的后生元共識聲明，后生元是指“對宿主健康有益的無生命微生物和/或其成分的制劑”[1]。后生元含有多種活性成分，包括肽聚糖、磷壁酸等菌體成分，以及維生素、有機(jī)酸、細(xì)菌素、短鏈脂肪酸、酶和氨基酸等活性代謝產(chǎn)物[1]。根據(jù)微生物的類型、菌株和代謝產(chǎn)物的不同，后生元的效果也不同[2]。使用后生元有助于改善健康，已有研究表明，后生元具有免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防感染、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病、抗高血壓、抗增殖、抗突變、抗腫瘤和減少食物過敏等作用[3-5]。后生元在宿主體內(nèi)發(fā)揮預(yù)防和治療雙重作用，臨床上使用后生元來緩解一系列疾病的癥狀，如嬰兒絞痛、成人特應(yīng)性皮炎和腹瀉等。除具有多種功效外，后生元還具有多種優(yōu)勢：一是具有更高的安全性。后生元對一些特殊人群如新生兒、腸道手術(shù)人群以及一些敏感人群同樣適應(yīng)，而且后生元不受抗生素的干擾抑制，沒有傳遞耐藥基因風(fēng)險(xiǎn)；二是具有更高的穩(wěn)定性。后生元可以耐受高溫、氧氣等環(huán)境，因此具有更長的保質(zhì)期，運(yùn)輸儲存也更方便；三是具有更廣泛的作用靶點(diǎn)，不僅限于腸道，口腔、皮膚、泌尿生殖道或鼻咽等都可作為后生元的靶點(diǎn)，而且更易于被腸道吸收，提高利用率。后生元因其清晰的化學(xué)結(jié)構(gòu)和安全劑量參數(shù)等，被認(rèn)為是天然的免疫刺激劑、抗炎劑、抗氧化劑、抗菌劑以及生長促進(jìn)劑[6]。

根據(jù)ISAPP 對后生元的定義，后生元不是單一的或純化的化合物，是由多種活性成分組成的混合物。因此后生元通常是作為一個整體進(jìn)行研究和開發(fā)應(yīng)用。盡管如此，對其活性成分的解析、作用機(jī)制的研究仍是后生元研究的一個重要方向，這將為后生元的進(jìn)一步研究和產(chǎn)業(yè)化提供重要的理論和科學(xué)依據(jù)。以抑菌功能后生元為例，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，后生元中發(fā)揮抑菌作用的成分有胞外多糖、細(xì)菌素、有機(jī)酸等，對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌等常見的致病菌具有較好的抑菌效果[7-8]。李書鴻等[9]通過對植物乳桿菌代謝產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，其抑菌活性與植物乳桿菌菌株、病原指示菌及發(fā)酵碳源相關(guān)，且受上清液低pH 的影響，其中主要的抑菌物質(zhì)有機(jī)酸。研究發(fā)現(xiàn)由鼠李糖乳桿菌L. 1.0320 中純化出細(xì)菌素1.0320 在靶細(xì)胞細(xì)胞膜上形成孔洞，增加細(xì)胞膜通透性，增加質(zhì)子動力勢PMF（proton motive force）的耗散，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致胞內(nèi)內(nèi)容物流出，誘導(dǎo)細(xì)菌死亡[10]。從微生物滅活方式來看，目前，制備后生元的方法通常有熱處理、γ或紫外線照射、酶處理、超聲處理、高壓處理、溶劑萃取或它們的組合進(jìn)行裂解等。大多數(shù)情況下，熱處理是滅活益生菌菌體的常用方法，但作用時間和溫度因微生物種類不同而不同，還取決于微生物自身的耐熱性[11]。此外，2 株或者多株菌共發(fā)酵時不同菌株間會存在互作關(guān)系，從而引起菌株代謝活動發(fā)生變化[12-13]，這給特定功能后生元的制備提供了思路。

近年來，抗生素耐藥性的出現(xiàn)導(dǎo)致治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)增加、復(fù)發(fā)和醫(yī)療保健系統(tǒng)成本增加[14]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株是最常見的抗生素耐藥菌之一，對大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有耐藥性，包括甲氧西林、青霉素、碳青霉烯類、頭孢菌素類及其衍生物。由于其分布廣泛且具有多重耐藥性，已成為令人擔(dān)憂的超級細(xì)菌[15-16]。此外，MRSA還是一種常見的皮膚化膿感染致病菌，易通過接觸傳播形成流行傳播，引起敗血癥、膿毒血癥等疾病。MRSA 可形成具有保護(hù)作用的生物膜，阻擋抗菌劑，產(chǎn)生耐藥性，使治療效果變差。生物膜是附著在表面的微生物群落，它們由胞外聚合物基質(zhì)的結(jié)構(gòu)支持，該基質(zhì)包含一種或多種胞外多糖、蛋白質(zhì)和DNA，在細(xì)菌感染的持續(xù)存在中起重要作用[17]。MRSA 生物膜的存在致使其致病性和耐藥性增加，因此開發(fā)針對MRSA 的綠色、不產(chǎn)生耐藥性的天然抗菌制劑成為解決MRSA 致病性及耐藥性的關(guān)鍵。

因此，本研究擬通過多株益生菌復(fù)合發(fā)酵，制備一種對MRSA 具有抑菌活性的后生元，研究其對MRSA 的抑菌活性及對MRSA 生物膜的影響，并探究其抑菌作用機(jī)制，為后生元在食品、醫(yī)療中使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸乳球菌乳亞種Postbio-F3、副干酪乳酪桿菌Postbio-P6、發(fā)酵粘液乳桿菌Postbio-Q7 來自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)益生菌與后生元基礎(chǔ)研究與開發(fā)應(yīng)用創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種庫；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）ATCC 43300 美國模式培養(yǎng)物集存庫；甲氧西林 北京百奧萊博科技有限公司；LB 肉湯培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA） 青島海博生物技術(shù)有限公司；活性氧檢測試劑盒 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胃蛋白酶（酶活力3 U/mg）、木瓜蛋白酶（酶活力600 U/mg）、蛋白酶K（酶活力30 U/mg）、胰蛋白酶（酶活力10 U/mg）、淀粉酶（酶活力100 U/mg）、脂肪酶（酶活力350 U/mg）TaKaRa 公司。

SU5000 掃描電子顯微鏡 株式會社日立制作所；TU-1810 型可見分光光度計(jì) 普析通用公司；Centrifuge 5810R 型冷凍離心機(jī) 艾本德公司；CLC111ECO 型恒溫培養(yǎng)箱 MMM Medcenter Einrichtungen GmbH 公司；CMax Plus 酶標(biāo)儀 美國MD 公司；SCIENTZ-WSQ 型全自動生長曲線分析儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Supcre G10 型全自動菌落分析儀 杭州迅數(shù)科技有限公司；BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀 美國BD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 具有抑菌功能的后生元的制備 參考文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道方法并適當(dāng)修改進(jìn)行后生元的制備。將副干酪乳酪桿菌Postbio-P6、發(fā)酵粘液乳桿菌Postbio-Q7、乳酸乳球菌乳亞種Postbio-F3 按2%接種量分別接種MRS 液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，培養(yǎng)條件為37 ℃好氧發(fā)酵24 h，pH 約3.8。將活化培養(yǎng)物按2%接種量分別接種MRS 液體培養(yǎng)基進(jìn)行二代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。將二代培養(yǎng)物分別按3%、2%、3%接種量接種同一MRS 液體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，發(fā)酵條件為37 ℃，好氧發(fā)酵24 h。發(fā)酵結(jié)束后首先進(jìn)行鏡檢，通過菌落形態(tài)判斷菌的增殖情況，然后將培養(yǎng)液于121 ℃高溫高壓滅菌30 min，通過菌落計(jì)數(shù)法確認(rèn)是否完全滅活，將制備的后生元于-20 ℃保存?zhèn)溆?。此外，通過測試3 種菌不同接種量下的抑菌活性，篩選確定3 種菌的最佳接種量。

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 抑菌圈 將MRSA 接種到LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h 活化備用。將最佳接種量條件下制備的后生元8000 r/min 離心10 min，分別收集上清液和沉淀（滅活菌體），上清液過0.22 μm 濾膜，沉淀用等量無菌水重懸。采用抑菌圈法分別驗(yàn)證后生元的上清液、沉淀以及未經(jīng)離心的混合液對MRSA的抑菌活性。MRSA 用生理鹽水稀釋107CFU/mL的菌液后，吸取20 μL 菌液加入到30 mL 未凝固的LB 培養(yǎng)基（45 ℃以下）中，充分混勻后傾注到培養(yǎng)皿中。待培養(yǎng)基凝固后，用打孔器在培養(yǎng)基上打直徑為 8 mm 的小孔。吸取上述后生元 200 μL 到瓊脂孔，做3 個重復(fù)，對照孔加等量PBS（pH7.4，0.01 mol/L）。將培養(yǎng)皿置于4 ℃擴(kuò)散4 h 后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈的大小[20-21]。

1.2.2.2 生長曲線的測定 將MRSA 用生理鹽水稀釋成1×105CFU/mL 的菌液，分別吸取100 μL 菌液加入到48 孔板的5 個孔中，然后吸取100 μL 濃度為12.5%、25%、50%和100%的YDFF 分別加入到孔中，對照孔中用等量PBS（pH7.4）代替，最后向每個孔中加入800 μL LB 培養(yǎng)基，組成1 mL 的培養(yǎng)體系，每個樣品做3 個重復(fù)，37 ℃下振蕩培養(yǎng)，每隔1 h 使用微生物生長曲線分析儀測量OD600值，24 h后對所有結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并繪制成圖。

1.2.3 后生元YDFF 對MRSA 的抑菌特性

1.2.3.1 酶對后生元YDFF 抑菌活性的影響 分別配置10 mg/mL 的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶溶液，與后生元按1:9混合，使酶的終濃度為1mg/mL。分別在酶最適宜pH 下置于 37 ℃水浴反應(yīng)30 min，用相同體積的水與后生元混合作為對照，然后通過抑菌圈法測定各種酶對抑菌活性的影響。

1.2.3.2 pH 對后生元YDFF 抑菌活性的影響 用5 mol/L 的NaOH 和5 mol/L 的HCl 分別將后生元YDFF 的pH 調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按照1.2.2.1 的方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，測量并記錄抑菌圈直徑，分別測試不同pH 對 YDFF 抑菌活性的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的pH 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 后生元YDFF 中胞外多糖的抑菌活性判斷參考文獻(xiàn)[22]的方法，采用乙醇沉淀法對后生元YDFF 中的胞外多糖進(jìn)行粗提。在后生元（pH7.0）中加入終濃度為 10%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）的三氯乙酸，充分混合，4 ℃靜置過夜以沉淀蛋白，然后 4 ℃、12000 r/min 離心15 min 取上清，慢慢加3 倍體積的冰乙醇，4 ℃靜置24 h，沉淀多糖。4 ℃、12000 r/min離心15 min 棄上清液，收集沉淀，揮發(fā)去除沉淀中的乙醇后進(jìn)行冷凍干燥，得到胞外粗多糖提取物。配置12.5%、25%、50%胞外多糖溶液，通過抑菌圈法測試不同濃度胞外多糖的抑菌活性。

1.2.4 后生元YDFF 對MRSA 的抑菌機(jī)制

1.2.4.1 后生元YDFF 對MRSA 生物膜形成的影響參考文獻(xiàn)[23]方法，通過結(jié)晶紫染色法測定后生元YDFF 對MRSA 生物膜形成的抑制作用。具體步驟如下：在96 孔平底培養(yǎng)板中每孔加入100 μL濃度為106CFU/mL 的MRSA 菌懸液和100 μL 濃度為25%、50%和100%的YDFF（pH7.0），對照組中加入等量的水，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后，除凈上層培養(yǎng)基以及游離細(xì)菌，用200 μL PBS 清洗3 次，再添加 200 μL 0.4%結(jié)晶紫染色15 min，吸走結(jié)晶紫；用無菌水清洗3 次洗去浮色，待干燥后用30%醋酸溶液脫色，用酶標(biāo)儀測定OD600，按照以下公式計(jì)算后生元YDFF 對MRSA 生物膜形成的抑制率。

式中：ODc為對照組OD 值： ODt為后生元處理組的OD 值。

1.2.4.2 后生元YDFF 對MRSA 形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響將MRSA 活化并稀釋至106～107CFU/mL，8000 r/min，離心10 min，用PBS 清洗3 次，除凈上清液，加入100 μL 濃度100%的后生元YDFF（pH7.0），對照組加入等量的水。置于37 ℃水浴鍋30 min 后，8000 r/min，離心10 min 收集沉淀，用PBS 清洗3 次，除凈上清液，用 2.5% 的戊二醛溶液 4 ℃固定24 h；8000 r/min，離心10 min，用PBS 洗滌3 次，除凈上清液；用濃度遞增的乙醇（30%、50%、70%、80%、90%及100%）依次進(jìn)行梯度脫水，脫水后對菌體細(xì)胞進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥后進(jìn)行噴金包被，掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)變化[24-25]。

1.2.4.3 后生元YDFF 對MRSA 胞內(nèi)DNA 泄漏的影響 根據(jù)Yin 等[26]的方法，將MRSA 活化并稀釋至106～107CFU/mL 后，8000 r/min，離心10 min，用PBS 清洗3 次，除凈上清液，分別加入100 μL 濃度為25%、50%、100%的后生元YDFF（pH7.0），對照組加入等量的水。置于37 ℃水浴30 min 后，利用紫外分光光度計(jì)，通過比較陰性對照與后生元處理過后的MRSA 在260 nm 波長下吸光度值的變化，檢測后生元處理MRSA 后的DNA 泄漏情況。

1.2.4.4 后生元YDFF 對MRSA 胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響 采用活性氧檢測試劑盒進(jìn)行檢測。試劑盒中的探針2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCF-DA）可以與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS 反應(yīng)生成熒光素，通過流式細(xì)胞儀檢測熒光素的熒光強(qiáng)度即可間接檢測ROS 的產(chǎn)量[27]。離心收集106～107CFU/mL 的MRSA菌體，用 PBS 清洗3 次后重懸于 900 μL PBS 中，分別加入100 μL 濃度為25%、50%和100%的后生元YDFF（pH7.0），37 ℃水浴 30 min，未處理組用水做對照，分別加入終濃度為 10 mmol/L H2DCF-DA 37 ℃避光染色1 h，然后用PBS 清洗，最后用流式細(xì)胞儀檢測后生元對MRSA 胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響。

1.2.5 后生元YDFF 對MRSA 抗生素耐藥性影響

根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)并參考文獻(xiàn)方法[28]，使用棋盤式微量液基稀釋法（簡稱棋盤法）檢測后生元YDFF 對MRSA 的耐藥性影響。首先測定后生元YDFF 和β-內(nèi)酰胺類抗生素甲氧西林的最小抑菌濃度（MIC），并測定其對MRSA的分級抑菌濃度指數(shù)（FICI），F(xiàn)ICI≤0.5 為兩者抗菌具有協(xié)同作用，F(xiàn)ICI>4 為拮抗作用，0.5

式中：MICa和MICb分別表示藥物后生元和甲氧西林單用時的MIC 值，MICab是后生元在甲氧西林聯(lián)合下的MIC 值，MICba是甲氧西林在后生元聯(lián)合下的MIC 值[29]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文中所有實(shí)驗(yàn)均平行三次。所有數(shù)據(jù)均以平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用 Origin 8.0 軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抑菌功能的后生元的制備

本研究對3 株菌的不同初始接種量進(jìn)行了驗(yàn)證，由表1 可知，副干酪乳酪桿菌Postbio-P6、發(fā)酵粘液乳桿菌Postbio-Q7、乳酸乳球菌乳亞種Postbio-F3 在接種量分別為3%、2%、3%時所制備的后生元活性最高，說明在此接種比例下，菌株之間通過互作關(guān)系能夠刺激相關(guān)代謝通路高量表達(dá)，從而產(chǎn)生更多抑菌活性物質(zhì)，因此選用該接種量所制備的后生元用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究采用高溫高壓方法制備后生元YDFF（含有死菌體和代謝產(chǎn)物），經(jīng)測試抑菌活性未受影響，說明YDFF 中的抑菌活性物質(zhì)耐受高溫高壓。此外，通過菌落計(jì)數(shù)法檢測后生元YDFF 無活菌生長，證明高溫高壓方法滅菌完全。

表1 不同接種量對后生元抑菌活性的影響Table 1 Effects of different inoculated doses

2.2 后生元YDFF 對MRSA 的抑菌作用

2.2.1 抑菌圈實(shí)驗(yàn) 如圖1A 所示，后生元YDFF 上清液和后生元YDFF 混合液對MRSA 均有明顯的抑制作用。后生元YDFF 上清液對MRSA 的抑菌圈直徑為19.1±1.5 mm，后生元YDFF 混合液對MRSA的抑菌圈直徑為18.5±1.2 mm，而后生元YDFF 死菌體無抑菌活性。綜上結(jié)果選用上清液進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 后生元YDFF 對MRSA 的抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of postbiotic YDFF on MRSA

2.2.2 生長曲線的測定 不同濃度的后生元YDFF對MRSA 生長變化趨勢影響如圖1B 所示，未加后生元的空白對照組細(xì)菌生長呈現(xiàn)出典型的S 型生長曲線。添加濃度為50%和100%的后生元YDFF完全抑制了細(xì)菌的生長，OD 值基本不變；添加濃度為25%的后生元YDFF 在20 h 前細(xì)菌不生長，20 h開始輕微生長；而添加12.5%后生元盡管沒有完全抑制細(xì)菌的生長，但細(xì)菌的對數(shù)生長期大大推遲，較對照推遲了12 h。上述結(jié)果說明后生元YDFF 可以顯著抑制MRSA 的生長。

2.3 后生元YDFF 對MRSA 的抑菌特性

2.3.1 不同酶對后生元YDFF 抑菌活性的影響 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了7種不同的酶對后生元YDFF 抑菌活性的影響，結(jié)果如圖2 所示。從圖中可以看出，后生元YDFF 對木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶較為敏感，對胃蛋白酶不敏感。其中，后生元YDFF 經(jīng)蛋白酶K 處理后其活性完全喪失，由此可推斷，后生元YDFF 中發(fā)揮抑菌作用的可能是蛋白類物質(zhì)。

圖2 不同酶對后生元YDFF 抑菌活性的影響Fig.2 Effects of different enzymes on the antibacterial activity of posttiotic YDFF

2.3.2 不同pH 對后生元YDFF 抑菌活性的影響由圖3 可知，后生元YDFF 在pH3.0～9.0 范圍內(nèi)均具有抑菌活性。在酸性條件下（pH3.0～6.0），隨著pH 降低，抑菌活性呈現(xiàn)增高趨勢；而在中性和堿性條件下（pH7.0～9.0），抑菌活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在pH8.0 時活性達(dá)到最大。通常后生元成分中發(fā)揮抑菌作用的主要有細(xì)菌素和有機(jī)酸等物質(zhì)[30-31]，YDFF 在pH7.0 時仍保持較好活性，說明YDFF 中除了有機(jī)酸還有其他活性抑菌成分。上述結(jié)果說明YDFF 抑菌活性具有較寬的pH 耐受范圍，這對YDFF的實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。

圖3 不同pH 對YDFF 抑菌活性的影響Fig.3 Effects of pH on the antibacterial activity of YDFF

2.3.3 后生元YDFF 中胞外多糖的抑菌活性判斷通過乙醇沉淀法粗提后生元YDFF 中的胞外多糖，并驗(yàn)證后生元中的胞外多糖是否具有抑菌活性。如圖4 所示，12.5%、25%、50%的胞外多糖對MRSA均無抑菌作用，初步判斷后生元中發(fā)揮抑菌活性的物質(zhì)不是多糖。

圖4 后生元YDFF 中胞外多糖的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of extracellular polysaccharides in YDFF on MRSA

2.4 后生元對MRSA 生物膜形成的影響

本論文通過結(jié)晶紫染色法測定了后生元YDFF對MRSA 生物膜形成的抑制作用。由圖5 可知，后生元YDFF 對MRSA 生物膜的形成具有顯著的抑制作用（P<0.001），100%、50%、25%后生元對MRSA生物膜的抑制率分別為81.2%、78.3%、76.8%，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌的生物膜與細(xì)菌的致病性、毒力密切相關(guān)，尤其與其抗生素耐藥性相關(guān)[32]。由此推斷，后生元YDFF 可能會通過破壞MRSA生物膜抑制細(xì)菌生長并降低細(xì)菌的耐藥性。

圖5 后生元YDFF 對MRSA 生物膜的形成的影響Fig.5 Effect of the YDFF on biofilm formation of MRSA

2.5 后生元對MRSA 形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

通過掃描電鏡觀察后生元YDFF 對MRSA 菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，如圖6 所示，對照組中未經(jīng)后生元處理的MRSA 菌體細(xì)胞為典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，菌體圓型，表面圓潤光滑，細(xì)胞表面完全沒有破損，結(jié)構(gòu)完整，而且菌體生長良好，沒有聚集皺縮；后生元YDFF處理的MRSA 細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞，菌體變形并有溶解現(xiàn)象，細(xì)胞完整性喪失，細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)坍塌。由此可見，后生元YDFF 可以有效地破壞MRSA 的菌體結(jié)構(gòu)，對MRSA 具有損傷作用，能夠引起細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏。

圖6 后生元YDFF 對MRSA 的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響Fig.6 Effect of YDFF on the morphological structure of MRSA

2.6 后生元對MRSA 胞內(nèi)DNA 泄漏的影響

當(dāng)細(xì)胞膜通透性受到破壞時，細(xì)胞膜的選擇性下降，DNA 等細(xì)胞內(nèi)容物流出。因此通過測定DNA泄漏可以反映細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[33]。如圖7所示，經(jīng)后生元YDFF 處理后，MRSA 胞內(nèi)DNA 出現(xiàn)了泄漏（P<0.001），且隨著后生元濃度的增加，胞內(nèi)DNA 泄漏量也逐漸增多，說明后生元YDFF 破壞了MRSA 細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄。

圖7 后生元YDFF 對MRSA 的DNA 泄漏影響Fig.7 Effect of postibiotic YDFF on DNA leakage in MRSA

2.7 后生元YDFF 對MRSA 胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響

活性氧ROS 是一種可參與許多細(xì)胞的生理活動的重要分子，它能維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，與細(xì)胞的生長和死亡密切相關(guān)，但過量的ROS 會引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[34-36]。本論文通過流式細(xì)胞儀檢測后生元YDFF 對MRSA 胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響，如圖8A 所示，對照組檢測到的產(chǎn)熒光素的細(xì)菌占比為6.31%，添加25%、50%、100%后生元檢測到的產(chǎn)熒光素的細(xì)菌占比分別為14.4%、33.8%、52.9%，且隨著后生元濃度升高，熒光強(qiáng)度也增加，具有顯著的濃度依賴性（圖8B），說明后生元YDFF 可以顯著促進(jìn)胞內(nèi)ROS 升高，這可能也是后生元YDFF 對MRSA 產(chǎn)生抑菌活性的其中一個原因。

圖8 不同濃度后生元YDFF 對MRSA 胞內(nèi)ROS 產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of different concentrations of postbiotic YDFF on intracellular ROS production of MRSA

2.8 后生元YDFF 對抗生素耐藥性影響

為驗(yàn)證后生元YDFF 對MRSA 抗生素耐藥性的影響，本研究聯(lián)合后生元YDFF 與β-內(nèi)酰胺類抗生素甲氧西林，測定其對MRSA 的FICI。結(jié)果如表2所示，后生元YDFF 和甲氧西林聯(lián)合用藥后，后生元的MIC 由原來的0.78%降低至0.025%，甲氧西林的MIC 由原來的0.98 μg/mL 降低至0.25 μg/mL，而聯(lián)用后FICI 降低至0.38（<0.5），說明YDFF 可以顯著降低MRSA 對甲氧西林的耐藥性，與甲氧西林聯(lián)合具有協(xié)同增強(qiáng)作用。后生元YDFF 降低MRSA耐藥性可能與其抑制MRSA 生物膜有關(guān)，這為有效緩解細(xì)菌耐藥性問題、減少抗生素使用提供了新的解決思路。

表2 后生元YDFF 對MRSA 耐藥性的影響Table 2 Effect of postbiotic YDFF on antibiotic resistance of MRSA to methicillin

3 結(jié)論

本研究通過復(fù)合發(fā)酵多株益生菌制備得到一種對MRSA 具有顯著抑菌活性的后生元YDFF。實(shí)驗(yàn)證明后生元YDFF 抑菌活性具有較好的pH 耐受性，在pH3.0～9.0 均可發(fā)揮抑菌作用，且在pH 中性條件下仍保持較高抑菌活性，說明后生元YDFF 中發(fā)揮抑菌作用的主要成分不只是有機(jī)酸；提取后生元YDFF 胞外多糖并驗(yàn)證其抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞外多糖無抑菌活性，表明后生元YDFF 中發(fā)揮抑菌作用的不是多糖類；酶敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白酶K 可以使后生元YDFF 抑菌活性完全喪失。綜上結(jié)果初步推斷后生元YDFF 中發(fā)揮抑菌作用的主要成分可能為蛋白類物質(zhì)。對后生元YDFF 的抑菌活性機(jī)制研究表明，后生元YDFF 通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)增加細(xì)胞膜通透性、抑制生物膜形成、增加胞內(nèi)ROS 濃度等多種方式發(fā)揮抑菌作用。另外，本研究通過測定FICI 值來驗(yàn)證后生元YDFF 對MRSA 耐藥性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示后生元YDFF 和甲氧西林聯(lián)用的FICI 降低至0.38，說明YDFF 和甲氧西林對MRSA具有協(xié)同抗菌作用，YDFF 可以顯著降低MRSA 對甲氧西林的耐藥性，這為有效緩解細(xì)菌耐藥性問題、減少抗生素使用提供了新的解決思路。

本論文初步判斷后生元YDFF 中發(fā)揮抑菌作用的主要物質(zhì)可能是蛋白類的活性物質(zhì)，這尚需對其抑菌活性成分進(jìn)行進(jìn)一步解析。另外，在抑菌機(jī)制方面，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，深入闡明后生元對細(xì)菌發(fā)揮作用的分子機(jī)制也是未來研究的重要方向。