賀秋樺，劉夢(mèng)龍，郭啟新，丁海燕,*

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.大理州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南大理 671000）

由致病微生物污染導(dǎo)致的食源性疾病每年危害著數(shù)十億人的健康，特別在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國家，該現(xiàn)象更加嚴(yán)重，世界衛(wèi)生組織（WHO）將食品安全定為本世紀(jì)優(yōu)先解決的重大問題之一[1-2]。隨著人們對(duì)食品安全的重視程度逐漸加深，開發(fā)新型安全高效的抗菌藥物及食品防腐劑迫在眉睫。雪地茶（Thamnolia subuliformis（Ehrh.） W. Culb.）又名太白茶、石白茶，霜降衣科地茶屬地衣，主要生長(zhǎng)在高海拔、高寒地區(qū)的陰濕巖石和苔地上，是我國傳統(tǒng)名貴中藥之一[3]。作為天然的保健飲品和傳統(tǒng)藥物，雪地茶在民間常被人們以水煎服或泡飲以達(dá)到清熱解毒、安神明目等目的[3-4]。近年來，關(guān)于雪地茶生物活性的報(bào)道逐漸增多，如抗菌、抗腫瘤、延緩衰老、降血壓等[4-6]。在課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，雪地茶甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、表面葡萄球菌等革蘭氏陽性菌及甲型和乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌以及致病真菌白色念珠菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，且其提取物在高溫、紫外照射等不良條件下抑菌活性穩(wěn)定性較好[4]，具有進(jìn)一步開發(fā)的潛力。但由于雪地茶生長(zhǎng)環(huán)境特殊、生長(zhǎng)極其緩慢，持續(xù)大量采收導(dǎo)致了雪地茶資源的枯竭，其藥用價(jià)值及作用機(jī)理還未被充分挖掘已步入瀕危滅絕的境地，保證其資源的可持續(xù)利用是當(dāng)務(wù)之急[7]。

研究發(fā)現(xiàn)雪地茶發(fā)揮抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物大部分來自于其復(fù)合體中的真菌[8]。內(nèi)生真菌是存在于雪地茶體內(nèi)且不會(huì)對(duì)其造成傷害的一類真菌[9-10]，可產(chǎn)生與宿主相同或相似的抑菌活性產(chǎn)物[11]，因此可作為雪地茶替代物開發(fā)其抑菌活性成分以緩解雪地茶資源短缺的問題[12]。前期在建立雪地茶內(nèi)生真菌資源庫并進(jìn)行抑菌活性初篩時(shí)發(fā)現(xiàn)，從雪地茶中分離得到的一株編號(hào)為202109-Ts-F017 的內(nèi)生真菌對(duì)多種耐藥菌均有較好的抑菌活性，經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研其抑菌活性的報(bào)道尚未查見，因此對(duì)內(nèi)生真菌202109-Ts-F017 抑菌活性進(jìn)行研究有重要的科學(xué)意義，但目前202109-Ts-F017 的抑菌譜及體外抑菌穩(wěn)定性尚未明確。

因此文章將以202109-Ts-F017 為研究對(duì)象，在分別比較了幾種常見的體外抑菌方法后，結(jié)合抑菌效果、操作便捷性以及經(jīng)濟(jì)性等因素，分別篩選出針對(duì)細(xì)菌和真菌的最優(yōu)抑菌方法以進(jìn)一步探究?jī)?nèi)生真菌202109-Ts-F017 對(duì)常見食源性致病菌、植物致病菌的體外抑制活性，根據(jù)抑菌活性的結(jié)果，選擇對(duì)202109-Ts-F017 敏感性最高的致病菌作為指示菌，并對(duì)該內(nèi)生真菌的體外抑菌活性穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為雪地茶內(nèi)生真菌資源的開發(fā)及利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株202109-Ts-F017 為課題組從雪地茶中分離所得，經(jīng)ITS 序列比對(duì)鑒定為炭角菌目梨孢假殼屬Apiospora malaysiana（昆明擎科生物科技有限公司），菌種現(xiàn)保存于大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 25923）、斯氏李斯特菌（Listeria seeligeriCICC 21671）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenesCMCC 21633）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidisATCC 12228）、甲型副傷寒桿菌（Salmonella paratyphi-ABNCC 336664）、大腸埃希氏菌（Escherichia coliCMCC（B） 441027）、福氏志賀菌（Shigella flexneriCMCC 21534）、肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniaeATCC 4352） 大理州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心提供；耐藥型白色念珠菌（Drug-resistantCandida albicansATCC 10231） 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA ATCC 43300）、灰葡萄孢（Botrytis cinereaBNCC 119830）、立枯絲核菌（RhizoctoniasolaniBNCC 356048）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorumBNCC 122299）、西瓜?；图怄哏牭毒‵usarium oxysporum f. sp. niveumBNCC 225899）

購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；營(yíng)養(yǎng)瓊脂北京陸橋技術(shù)股份有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、LB 肉湯、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）、馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基（PDB 培養(yǎng)基） 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乙酸乙酯、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCL） 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸左氧氟沙星片 山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；氟胞嘧啶片 精華制藥集團(tuán)股份有限公司；98%異菌脲原藥 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

VS-1300L-U 型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)泰安公司制造；MJ-54A 型高壓蒸汽滅菌鍋 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；GHP-9270 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MQL-61R 型震蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；RE-3000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；T6 新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SB-5200DTDN 型超聲波清洗機(jī)、Scientz-ND 型系列冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雪地茶內(nèi)生真菌Apiospora malaysiana體外抑菌活性篩查

1.2.1.1 三種體外抗細(xì)菌活性篩查方法比較Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物的制備：參考周璇等[13]的方法并做一定修改。取平板上生長(zhǎng)良好的Apiospora malaysiana菌餅接種于無菌PDB 培養(yǎng)基中，在振蕩搖床中以150 r/min，28 ℃培養(yǎng)條件培養(yǎng)5～7 d 后，用等體積乙酸乙酯對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵液分別進(jìn)行超聲30 min（超聲頻率為60 KHz，溫度為28 ℃）、抽濾、萃取等步驟，重復(fù)上述步驟3 次后，取各萃取液有機(jī)層減壓濃縮得Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物。

含菌懸液平板的制備：用接種環(huán)取適量4 ℃保存的金黃色葡萄球菌菌體于無菌生理鹽水中，采用0.5 麥?zhǔn)媳葷釋⒕簼舛日{(diào)整至108CFU/mL 后，以2%接菌量將調(diào)整好濃度的菌液接入10 mL 的無菌LB 肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)好的菌液通過2 次離心棄去上清液后，采用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛日{(diào)整至106CFU/mL 備用。將無菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與配制好的菌液按20∶1 的體積比混勻后倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固后備用。

三種體外抗細(xì)菌活性篩查方法比較：平板打孔法[14]：用6 mm 的打孔器在培養(yǎng)基中打出4 個(gè)等距的孔，相鄰兩孔各加入20 μL 發(fā)酵液粗提物（100 mg/mL）作為處理組，另兩孔分別加入20 μL 0.5 mg/mL 的鹽酸左氧氟沙星溶液（用DMSO 配制）、DMSO 為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。濾紙片法[15]：將6 mm 的濾紙片滅菌干燥后，用無菌鑷子夾取4 份濾紙片等距貼放在培養(yǎng)基表面，加樣方式及其余處理同平板打孔法。牛津杯法[16]：用鑷子夾取4 只無菌的6 mm 牛津杯等距輕放在含菌懸液的平板表面，輕輕按壓，使之充分接觸但不壓迫瓊脂表面，加樣方法及其余處理同平板打孔法。三種處理方法的平板均在培養(yǎng)箱37 ℃正置培養(yǎng)18 h 后觀察抑菌圈形成情況。

1.2.1.2 三種體外抗真菌活性篩查方法比較 菌種活化：將斜面生長(zhǎng)良好的菌株接種在無菌PDA 平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d 備用。

三種體外抗真菌活性篩查方法比較：平板對(duì)峙法：參考Yu 等[17]的方法并進(jìn)行一定的修改。用6 mm打孔器在Apiospora malaysiana與灰葡萄孢菌落邊緣菌絲生長(zhǎng)旺盛的地方打取菌餅，挑取兩種真菌的菌餅放置在無菌PDA 培養(yǎng)基，兩菌餅相距3 mm。以只接種灰葡萄孢的PDA 培養(yǎng)基、只含PDA 培養(yǎng)基的平板作為對(duì)照組。濾紙圓片擴(kuò)散法[16]：將1.2.1.1 匯總到的發(fā)酵液粗提物用DMSO 復(fù)溶至100 mg/mL。用無菌鑷子夾取3 份無菌干燥的濾紙片等距置于PDA 培養(yǎng)基表面，其中一濾紙片加入20 μL 發(fā)酵液粗提物，另兩個(gè)濾紙片各分別加入20 μL 的5 mg/mL異菌脲溶液（用DMSO 配制）、DMSO 溶液為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。菌絲生長(zhǎng)速率法[18]：稱取適量1.2.1.1中得到的Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物并加入PDA 培養(yǎng)基中混勻，使得培養(yǎng)基中發(fā)酵液粗提物終濃度為1 mg/mL，待其凝固后備用。用6 mm 打孔器在灰葡萄孢菌落邊緣菌絲生長(zhǎng)旺盛的地方打孔獲取菌餅并將其置于制備好的培養(yǎng)基平板中央，將灰葡萄孢菌餅放置在含5 μg/mL 的異菌脲溶液培養(yǎng)基中作為陽性對(duì)照，以只含無菌PDA 培養(yǎng)基接種同樣大小的灰葡萄孢菌餅作為陰性對(duì)照。處理完成后，在28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～7 d 后觀察平板菌落生長(zhǎng)情況。運(yùn)用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，三種方法抑制率計(jì)算公式為[19]：

1.2.1.3Apiospora malaysiana 體外抑菌活性試驗(yàn)根據(jù)1.2.1.1 和1.2.1.2 試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮各方面因素后，分別選擇平板打孔法、菌絲生長(zhǎng)速率法探究Apiospora malaysiana的體外抑制細(xì)菌及真菌活性。在抑制細(xì)菌部分的試驗(yàn)中，除菌液濃度調(diào)整中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）為105CFU/mL，其余菌株菌液濃度均為106CFU/mL、白色念珠菌及大腸桿菌菌懸液平板的制備使用涂布平板法、白色念珠菌的陽性對(duì)照為5 mg/mL 的氟胞嘧啶溶液（用DMSO 配制）三項(xiàng)以外，其余操作方法同1.2.1.1 平板打孔法。處理完成后在37 ℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)18 h 后，觀察并記錄抑菌圈的大小，參考Li 等[20]的研究對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性進(jìn)行判斷。在菌絲生長(zhǎng)速率法抑菌試驗(yàn)中，四種植物病原真菌的陽性對(duì)照均為98%異菌脲溶液（用DMSO 配制），濃度分別為灰葡萄孢、立枯絲核菌5 μg/mL，油菜菌核病菌、尖孢鐮刀桿菌20 μg/mL。其余步驟及計(jì)算公式同1.2.1.2。

1.2.2 雪地茶內(nèi)生真菌Apiospora malaysiana體外抑菌穩(wěn)定性試驗(yàn) 根據(jù)1.2.1.3 的試驗(yàn)結(jié)果，以對(duì)Apiospora malaysiana敏感性較高的致病菌金黃色葡萄球菌作為指示菌，運(yùn)用平板打孔法探究Apiospora malaysiana在不同的保存時(shí)間、溫度、紫外照射時(shí)間以及pH 的影響下體外抑菌效果的穩(wěn)定情況。

1.2.2.1 保存時(shí)間對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性的影響 參考郭星汝等[21]的方法并進(jìn)行一定修改。將Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物用DMSO復(fù)溶到濃度為100 mg/mL 后分別在4 ℃冰箱避光保存0（對(duì)照組）、3、7、14、21、28 d 后，采用平板打孔法測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小，具體操作方法同1.2.1.1。

1.2.2.2 溫度對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性的影響 參考Mao 等[22]的方法并進(jìn)行一定的修改。將Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物用DMSO 復(fù)溶到濃度為100 mg/mL 后再分別在4.0（對(duì)照組）、31.0（室溫）、40.0、60.0、80.0、94.1 ℃（受云南大理地理海拔的影響，加熱溫度不能達(dá)到100 ℃）的水浴鍋中分別避光水浴處理1 h，為保證發(fā)酵液量不改變，在水浴過程中均需加蓋。采用平板打孔法測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小，具體操作方法同

1.2.1.1。

1.2.2.3 紫外照射時(shí)間對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性的影響 參考王璇等[23]的方法并進(jìn)行一定的修改。將Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物用DMSO 復(fù)溶到濃度為100 mg/mL 后分別在紫外燈下（功率20 W，樣品距紫外光源垂直距離20 cm）分別照射0（對(duì)照組）、15、30、45、60、75 min，采用平板打孔法測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小，具體操作方法同1.2.1.1。

1.2.2.4 pH 對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性的影響 參考Zangeneh 等[24]的方法并進(jìn)行一定的修改。將Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物用DMSO 復(fù)溶到濃度為100 mg/mL 后分別用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 溶液將發(fā)酵液粗提物pH 調(diào)整至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，以未調(diào)整pH 的發(fā)酵液粗提物作為對(duì)照組（pH5.5），采用平板打孔法測(cè)定其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小，具體操作方法同1.2.1.1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)每個(gè)處理重復(fù)5 次，試驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪地茶內(nèi)生真菌Apiospora malaysiana 體外抑菌活性試驗(yàn)

2.1.1 三種抑制細(xì)菌方法的比較 試驗(yàn)以金黃色葡萄球菌為指示菌，探究3 種抑菌方法的抑菌效果，結(jié)果表明Apiospora malaysiana在三種抑菌方法試驗(yàn)中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）（表1），說明三種抑菌方法均可用于Apiospora malaysiana粗提物體外細(xì)菌抑制活性篩查。三種抑菌方法均屬于瓊脂擴(kuò)散法，樣品通過擴(kuò)散均勻分布在瓊脂中從而發(fā)揮抑菌作用，平板打孔法中樣品接觸瓊脂的面積大于其余兩種方法、樣品接觸瓊脂的高度小于另兩種方法，表明Apiospora malaysiana粗提物的擴(kuò)散速度和范圍與其接觸培養(yǎng)基的面積、平板中接觸培養(yǎng)基的高度均無關(guān)。但相較于另兩種方法，平板打孔法在實(shí)際操作過程中操作更加便捷、污染可能性小、無需額外購買器材，且由于液體的表面張力作用，孔中樣品不易流出，使得加樣量可控，更能獲得理想的抑菌圈[25]，因此后續(xù)試驗(yàn)選用平板打孔法來進(jìn)一步驗(yàn)證Apiospora malaysiana對(duì)致病細(xì)菌的體外活性。

表1 三種不同抑菌方法測(cè)定Apiospora malaysiana 對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of Apiospora malaysiana on Staphylococcus aureus determined by three different antibacterial methods

2.1.2 三種抑制真菌方法的比較 試驗(yàn)以灰葡萄孢為指示菌，探究不同抑制真菌方法的抑菌效果（表2），結(jié)果表明Apiospora malaysiana在三種抑菌方法試驗(yàn)中對(duì)灰葡萄孢的抑菌效果都存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），菌絲生長(zhǎng)速率法>平板對(duì)峙法>濾紙圓片擴(kuò)散法。在菌絲生長(zhǎng)速率法中，Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物對(duì)灰葡萄孢的抑菌率（100%）高于陽性對(duì)照異菌脲的抑制率（92.9%），猜測(cè)對(duì)Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物繼續(xù)分離純化后可能得到數(shù)量較多的抑菌能力與異菌脲相似或者比其更強(qiáng)的單體化合物，并且可能與異菌脲抑菌機(jī)理（降低病原真菌侵染寄生植物重要的致病因子胞外多糖的含量從而達(dá)到抑菌的作用）相似[26]，為Apiospora malaysiana抑菌機(jī)理及靶點(diǎn)的研究提供理論參考，表明Apiospora malaysiana有開發(fā)成農(nóng)用殺菌劑的巨大潛力。另外，菌絲生長(zhǎng)速率法的處理組抑制率遠(yuǎn)高于平板對(duì)峙法的抑制率，其原因可能是Apiospora malaysiana的作用形式不同導(dǎo)致抑菌效果的不同-其發(fā)酵液粗提物的抑菌效果遠(yuǎn)強(qiáng)于真菌菌塊的作用，說明Apiospora malaysiana中存在的主要抑菌物質(zhì)多溶于有機(jī)溶劑，且在提取濃縮后形成了較強(qiáng)的抑菌效果，除此之外，和菌絲生速率法可準(zhǔn)確控制樣品用量不同的是，平板對(duì)峙法只能作為定性研究[27]，表明菌絲生長(zhǎng)速率法優(yōu)于平板對(duì)峙法。而相較于菌絲生長(zhǎng)速率法，濾紙圓片擴(kuò)散法則無抑制效果，盡管二者使用的樣品均為Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物，但濾紙圓片擴(kuò)散法中樣品的濃度遠(yuǎn)低于菌絲生長(zhǎng)速率法，說明試驗(yàn)樣品的抑菌活性與濃度呈正相關(guān)，且其效果的評(píng)判具有較高的閾值，這與翟婭菲等[28]的結(jié)果相一致，是濾紙片法所做不到的。綜合上述結(jié)果，針對(duì)抑制真菌的活性篩查的試驗(yàn)方法的選擇中，菌絲生長(zhǎng)速率法更加敏感和準(zhǔn)確，可反應(yīng)待測(cè)物的真實(shí)抑菌情況，因此后續(xù)試驗(yàn)選用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)一步驗(yàn)證Apiospora malaysiana對(duì)植物致病真菌的體外抑菌活性。

表2 不同抑菌方法測(cè)定Apiospora malaysiana 對(duì)灰葡萄孢的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of Apiospora malaysiana on Botrytis cinerea by different antifungal methods

2.1.3Apiospora malaysiana體外抑菌活性試驗(yàn) 在明確活性篩查方法的優(yōu)劣后，試驗(yàn)采取最優(yōu)方法進(jìn)一步探究Apiospora malaysiana對(duì)多種致病細(xì)菌如金黃色葡萄球菌、斯氏李斯特菌、單增李斯特菌、表面葡萄球菌、MRSA 等革蘭氏陽性菌，甲型副傷寒桿菌、大腸埃希氏菌、福氏志賀菌、肺炎克雷伯菌等革蘭氏陰性菌及致病真菌白色念珠菌（表3）、灰葡萄孢、油菜菌核病菌、立枯絲核菌以及西瓜?；图怄哏牭毒囊种苹钚裕ū?）。5 種致病菌對(duì)Apiospora malaysiana粗提物高度敏感，其抑菌圈直徑排序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌>斯氏李斯特菌>單增李斯特菌>白色念珠菌>表面葡萄球菌，表明Apiospora malaysiana粗提物有廣泛且良好的抑菌活性，有被開發(fā)成天然廣譜抗菌先導(dǎo)化合物、食品保鮮劑的巨大潛力，特別是對(duì)危害廣泛、臨床耐藥嚴(yán)重的金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌兩種食源性致病菌的防治藥物的開發(fā)有重要的現(xiàn)實(shí)意義[29-31]。另外，Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物對(duì)革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑制作用而對(duì)革蘭氏陰性菌無抑制效果，猜測(cè)是粗提物阻止了革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中獨(dú)有的磷壁酸結(jié)構(gòu)的生成，導(dǎo)致細(xì)胞壁合成受阻，從而達(dá)到抑菌作用，粗提物抑菌對(duì)象的偏向性提示我們或可把研究熱點(diǎn)放在破壞致病菌獨(dú)有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，以為革蘭氏陽性菌日益嚴(yán)重的耐藥問題提供解決思路。另外，Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物對(duì)不同細(xì)菌的抑制作用存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），說明不同細(xì)菌的細(xì)胞壁成分及含量有細(xì)微差別，導(dǎo)致對(duì)粗提物的敏感性不同。與此同時(shí)，Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物對(duì)灰葡萄孢、立枯絲核菌的抑制率達(dá)100%，對(duì)油菜菌核病菌也有很強(qiáng)的抑制率（90%），對(duì)西瓜?；图怄哏牭毒囊种坡室渤^了50%，表明粗提物在子囊菌門及擔(dān)子菌門致病真菌廣泛的防治及應(yīng)用潛力，另外有研究發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢致病基因BcPDR1 可以調(diào)控病菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病力，推測(cè)BcPDR1 可以作為防治灰霉病藥物篩選的新靶標(biāo)[32]，提示粗提物或影響了病原真菌致病基因的表達(dá)從而達(dá)到抑菌效果，為粗提物的單體化合物后續(xù)抑菌作用靶點(diǎn)的選擇提供了新思路。綜上，Apiospora malaysiana粗提物對(duì)不同的致病細(xì)菌、真菌均有較好的抑制作用，表明其有被開發(fā)成廣譜抗菌藥物及農(nóng)用殺菌劑的巨大潛力。

表3 平板打孔法測(cè)定Apiospora malaysiana 的體外抑菌作用Table 3 Determination of in vitro antibacterial effect ofApiospora malaysiana by plate punching method

2.2 雪地茶內(nèi)生真菌Apiospora malaysiana 體外抑菌穩(wěn)定性試驗(yàn)

在2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)以敏感性最強(qiáng)的金黃色葡萄球菌為指示菌，進(jìn)一步探究在不同的外界因素影響下Apiospora malaysiana的體外抑菌活性穩(wěn)定性。以期為Apiospora malaysiana后續(xù)的抑菌活性物質(zhì)開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

2.2.1 保存時(shí)間對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性的影響 不同保存時(shí)間對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性的影響見表5。Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物在4 ℃冰箱保存0、3、7、14、21、28 d 后，各處理組體外抑菌活性與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。說明Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，抑菌活性物質(zhì)在4 ℃環(huán)境中保存較長(zhǎng)時(shí)間也不易發(fā)生變化，因此常規(guī)的保存方式及較長(zhǎng)時(shí)間的保存對(duì)其抑菌活性不會(huì)造成影響。Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物保存時(shí)間的穩(wěn)定性是其后續(xù)的抑菌活性開發(fā)的基礎(chǔ)與保障。組保持在同一水平，表明雪地茶內(nèi)生真菌抑菌活性成分的性質(zhì)較為穩(wěn)定。已有研究證明雪地茶對(duì)紫外線有一定的耐受作用[6]，且生活在雪域高原的人們也常以食用雪地茶以抵抗紫外線的照射[35]，從而佐證了該試驗(yàn)結(jié)果。

表5 保存時(shí)間對(duì)Apiospora malaysiana 體外抑菌活性的影響Table 5 Effect of preservation time on in vitro antibacterial activity of Apiospora malaysiana

2.2.2 溫度對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性的影響 由表6 可知，Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物經(jīng)過不同溫度處理后，體外抑菌活性與對(duì)照組相比沒有顯著差異（P>0.05）。即使經(jīng)過94.1 ℃的高溫處理1 h 后，其抑菌活性依舊未發(fā)生明顯變化，表明Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物有較好的熱穩(wěn)定性。雪地茶中可能存在的某些抑菌活性物質(zhì)如松蘿酸有較高的熔點(diǎn)和沸點(diǎn)，高溫處理下也不易發(fā)生分解[4,33]，學(xué)者在對(duì)松蘿酸提取條件的優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，提取溫度達(dá)95 ℃時(shí)對(duì)松蘿酸的得率也無明顯影響[34]，進(jìn)一步佐證了試驗(yàn)結(jié)果。因此常規(guī)的試驗(yàn)溫度更加不會(huì)對(duì)其抑菌活性造成影響。

表6 溫度對(duì)Apiospora malaysiana 體外抑菌活性的影響Table 6 Effect of temperature on in vitro antibacterial activity of Apiospora malaysiana

2.2.3 紫外照射時(shí)間對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性的影響 表7 顯示不同紫外照射時(shí)間對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性的影響，Apiospora malaysiana粗提物經(jīng)不同時(shí)長(zhǎng)的紫外照射后，抑菌活性與對(duì)照組相比沒有顯著差異（P>0.05）。即使經(jīng)過1 h 以上的紫外光照射后，其抑菌活性仍與對(duì)照

表7 紫外照射時(shí)間對(duì)Apiospora malaysiana 體外抑菌活性的影響Table 7 Effect of UV irradiation time on in vitro antibacterial activity of Apiospora malaysiana

2.2.4 pH 對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性的影響 不同pH 對(duì)Apiospora malaysiana體外抑菌活性的影響見表8。當(dāng)pH 較低，為2、4 時(shí)，Apiospora malaysiana粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性較對(duì)照組略有降低（P<0.05），但整體來說抑菌活性仍保持在對(duì)照組的92%以上。但當(dāng)pH 逐漸升高至6、8、10 時(shí)，Apiospora malaysiana對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性消失。上述結(jié)果表明Apiospora malaysiana粗提物對(duì)外界pH 的變化較敏感，pH 的升高或降低對(duì)其抑菌活性均有影響，但酸性環(huán)境影響較小，當(dāng)外界pH 高于粗提物本底pH 時(shí)，其體外抑菌活性消失。原因可能是地衣內(nèi)生真菌發(fā)酵液粗提物的抑菌活性物質(zhì)如酚酸及縮酚酸類物質(zhì)偏酸性，由于其苯環(huán)被多個(gè)酚羥基取代，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，加之酚羥基呈酸性，容易與堿性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)生真菌抑菌活性物質(zhì)失活[36-37]，因此在后續(xù)的試驗(yàn)及生產(chǎn)中應(yīng)格外注意抗菌物質(zhì)的酸堿特性與其活性的密切關(guān)系。

表8 pH 對(duì)Apiospora malaysiana 體外抑菌活性的影響Table 8 Effect of pH on in vitro antibacterial activity of Apiospora malaysiana

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，常見的3 種細(xì)菌抑制方法沒有差異，說明Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物的擴(kuò)散速度和范圍與其接觸培養(yǎng)基的面積、接觸培養(yǎng)基的高度均無關(guān)，而常見的3 種真菌抑制方法存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明Apiospora malaysiana中存在的主要抑菌物質(zhì)多溶于有機(jī)溶劑，且在提取濃縮后形成了較強(qiáng)的抑菌效果，試驗(yàn)樣品的抑菌活性與濃度呈正相關(guān)，且其效果的評(píng)判具有較高的閾值，上述抑菌方法篩選結(jié)果表明平板打孔法和菌絲生長(zhǎng)速率法分別是最合適的兩種抑菌方法。Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物有廣譜的抑菌效果，對(duì)革蘭氏陽性菌、致病真菌都有較強(qiáng)的抑菌活性。以敏感性最強(qiáng)的金黃色葡萄球菌為指示菌，研究Apiospora malaysiana發(fā)酵液粗提物體外抑菌穩(wěn)定性，保存時(shí)間、熱處理及紫外照射時(shí)間對(duì)其體外抑菌活性無影響（P>0.05），當(dāng)pH 調(diào)整至2、4 時(shí)，其抑菌活性較本底pH（5.5）略有降低，當(dāng)pH 調(diào)整至高于其本底pH 時(shí)（pH6、8、10），其體外抑菌活性消失（P<0.05），表明在Apiospora malaysiana開發(fā)利用過程中，較長(zhǎng)時(shí)間的低溫（4 ℃）保存、常見的熱處理不會(huì)對(duì)其抑菌活性造成影響，也能滿足較長(zhǎng)時(shí)間（75 min）的紫外光滅菌處理?xiàng)l件，也有較好的pH 穩(wěn)定性，但酸堿處理中pH 應(yīng)不超過其發(fā)酵液粗提物本底pH。以上結(jié)果表明雪地茶內(nèi)生長(zhǎng)真菌Apiospora malaysiana可用于天然抗菌先導(dǎo)化合物以及食品保鮮劑的開發(fā)，但限于目前對(duì)雪地茶內(nèi)生真菌生物活性物質(zhì)分離純化鑒定的相關(guān)研究尚處于起步階段，該部分可參考的內(nèi)容較少，因此雪地茶內(nèi)生真菌的分離鑒定、生物活性研究等基礎(chǔ)工作需持續(xù)進(jìn)行。