林彩霞，蘇 偉,2,*，母應(yīng)春，任婷婷，潘和勇，王家琴

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025；3.貴州洞釀洞藏酒業(yè)有限公司，貴州遵義 564622）

白酒是一種起源于中國的蒸餾酒，以其古老的釀造工藝和獨(dú)特的風(fēng)味而聞名，是世界上七大著名蒸餾酒之一[1]，醬香型白酒是最常見的四種基本風(fēng)味類型之一[2]。由于釀造原料、酒曲種類、環(huán)境和制作工藝的不同，影響著釀酒微生物菌群的形成[3]。醬香型白酒釀造的地域要求嚴(yán)格、生產(chǎn)需求大[4]，而由貴州喀斯特地貌形成的天然古溶洞—龜仙洞，溶洞常年恒溫、恒濕，洞口通風(fēng)條件良好，為釀酒藏酒所需的微生物提供繁衍與生產(chǎn)的溫床，是經(jīng)基尼斯認(rèn)證的目前全球最大的天然溶洞白酒釀藏基地[5]。洞釀醬香酒與傳統(tǒng)醬香型白酒一致經(jīng)過“12987”過程完成一個周期，“12987”即為一年一個生產(chǎn)周期，需經(jīng)過兩次投料、九次蒸煮、八次發(fā)酵和七次取酒過程[2]，但洞釀酒整個生產(chǎn)過程均在天然溶洞內(nèi)進(jìn)行。洞釀酒研究中張超等[6]通過平板計(jì)數(shù)法探索不同季節(jié)濃香型白酒微生物菌群在整個發(fā)酵周期的動態(tài)變化情況，發(fā)現(xiàn)3 個季節(jié)微生物消長變化無明顯差異，由此說明洞釀車間能夠?yàn)橛幸嫖⑸锾峁┻m宜的生長環(huán)境，維持正常代謝。而目前對于天然溶洞釀造醬香型白酒的研究鮮見報(bào)道。

發(fā)酵分為堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵。堆積發(fā)酵是指原料或酒醅經(jīng)過高溫蒸煮糊化后，加入高溫大曲收攏成椎體，在地面堆積發(fā)酵2～7 d[7]。堆積發(fā)酵富集到了大量的微生物和產(chǎn)生大量風(fēng)味前體物質(zhì)，對醬香白酒品質(zhì)至關(guān)重要[8]。因此評價堆積發(fā)酵過程中微生物菌群多樣性對于其在洞釀醬香白酒生產(chǎn)中的功能和價值以及提高工藝效率具有重要意義。Dai 等[9]對利用高通量測序?qū)θ奈遢喆吾u香型白酒的微生物多樣性進(jìn)行研究，并且結(jié)合相應(yīng)的理化特性與感官品評結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三四五輪次白酒質(zhì)量最佳。張春林等[10]采用高通量測序技術(shù)對茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒二輪次堆積發(fā)酵酒醅樣品中微生物結(jié)構(gòu)多樣性及其風(fēng)味之間的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬、裸胞殼屬、海洋芽孢桿菌屬等是醬香型白酒堆積過程中的主要微生物，對醬香型白酒的風(fēng)格形成有重大貢獻(xiàn)。目前，已經(jīng)有了許多堆積發(fā)酵過程中微生物對代謝物影響的研究，但大多都是在車間內(nèi)進(jìn)行，而針對洞內(nèi)發(fā)酵的研究較少。由于五輪次作為醬香型白酒中酒質(zhì)最好的輪次之一，因此本研究主要集中在洞釀醬香酒五輪次堆積發(fā)酵過程，通過系統(tǒng)分析五輪次酒醅微生物區(qū)系的動態(tài)變化和風(fēng)味物質(zhì)及其相關(guān)性，探討風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)制。旨在為推進(jìn)洞釀醬香酒的穩(wěn)定發(fā)展提供基礎(chǔ)理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品取自某洞內(nèi)第五輪次堆積發(fā)酵酒醅，洞內(nèi)溫度25 ℃，相對濕度80%～90%，堆子高1.7 m、長2 m。五輪次堆積發(fā)酵三天后下窖，參考任婷婷等[11]洞口一輪次的采樣方法與堆子溫度變化情況（0～24 h 升溫速率最快，48 h 到達(dá)頂峰后趨于穩(wěn)定，72 h后堆積發(fā)酵結(jié)束），將取樣時間選擇為0、24、48、72 h，在每個時間節(jié)點(diǎn)分別采集酒醅上、中、下三個層次樣品，每個層面分別采集中間及四周邊緣位置（如圖1）混合后作為一個層面的酒醅樣，隨后將3 個層面的酒醅樣混合均勻作為一個樣，混合樣立即裝入無菌密封袋，每個樣品取三次平行，置于-80 ℃下保存用于高通量測序及風(fēng)味分析；脫氧核糖核酸試劑盒（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒 美國MP Biomedicals 公司；2%瓊脂糖凝膠 西班牙Biowest公司；FastPfu 聚合酶 北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；正反引物 深圳市英俊生物技術(shù)有限公司；緩沖液：Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 美國New England Biolabs 公司；環(huán)己酮（>99.5%，GC）、正構(gòu)烷烴（C7～C40） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

圖1 堆積發(fā)酵取樣示意圖Fig.1 Sampling diagram of accumulation fermentation

HS-SPME/GC-MS（Trace 1300-TSQ 8000） 美國賽默飛世爾科技公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì) 美國Thermo Fisher Scientific 公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；ABI GeneAmp? 9700型PCR 儀 美國ABI 公司；Illumina MiseqMISEQ測序儀 美國Illumina 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA 提取與PCR 擴(kuò)增 根據(jù)FastDNA SPIN Kit for Soil 試劑盒（MP Biomedicals，USA）對酒醅樣品進(jìn)行總DNA 提取。對細(xì)菌V3～V4 可變區(qū)用基因上游引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGC AGCAG-3'）與下游引物806R（5'-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3'）以及真菌ITS1 區(qū)域引物ITS1（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）與ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35 次。PCR擴(kuò)增總體積為20 μL，包括Forward Primer （5 μmol/L） 0.8 μL，Reverse Primer（5 μmol/L） 0.8 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5×FastPfu Buffer 2 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL 和樣本Template DNA 10 ng 的反應(yīng)體系。

1.2.2 文庫構(gòu)建和Illumina Miseq 測序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences, Union City，CA，USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST（Promega，USA）進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300 的文庫。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進(jìn)行測序。

1.2.3 Illumina Miseq 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用QIIME tools import 插件，將原始序列fastq 文件，導(dǎo)入為可進(jìn)行QIIME2 后續(xù)處理的文件格式。然后運(yùn)用QIIME2 dada2 插件進(jìn)行質(zhì)控、修剪、去噪、拼接以及去除嵌合體后，得到了最終的特征序列表格接著，運(yùn)用QIIME2 feature-classifier 插件將ASV 的代表序列比對到預(yù)先訓(xùn)練好的13_8 版本99%相似度的GREENGENES 與Greengenes Database 13_8 版本數(shù)據(jù)庫（根據(jù)338F/806R 引物對將數(shù)據(jù)庫修剪到V3～V4 的區(qū)域），得到了物種的分類信息表[12]?；诩?xì)菌和真菌群落的組成，在門和屬兩個水平上進(jìn)行樣品的多樣性分析。

1.2.4 GC-MS 測定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì) 稱取1 g 已磨碎混勻的酒醅樣品放入20 mL 的頂空瓶內(nèi)，加入2 g 氯化鈉和7 mL 的純凈水，再加入10 μL 環(huán)己酮（20 μg/mL）作為內(nèi)標(biāo)物，并用PTFE 隔膜緊密覆蓋。使用已老化的50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS 萃取頭在40 ℃下振搖并提取180 min。提取完成后，立即將SPEM 纖維插入進(jìn)樣端口，并在230 ℃下解析分離5 min[13]。

色譜條件：毛細(xì)管柱為DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm），氦氣（99.999%）為載氣，流速為1.0 mL/min，無分流模式。升溫程序：在40 ℃下保持5 min，然后以5 ℃/min 的速率上升到150 ℃ ，保持在150 ℃下3 min，最后以5 ℃/min 的速率升至240 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），電子能量為70 eV，傳輸線溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，在50～450 amu 的范圍內(nèi)采集數(shù)據(jù)，速率為1 scan/s[13]。

1.2.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)據(jù)分析 定性分析：參考王涵鈺[13]的分析方法，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫（NIST）進(jìn)行比較，篩選出匹配度大于800 的揮發(fā)性化合物。在相同條件下運(yùn)行C7～C40 的正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)液以確定化合物的保留系數(shù)（RI），計(jì)算公式如下：

式中：Rt（x）、Rt（n）、Rt（n+1）分別為待測的揮發(fā)性成分、含n 個碳原子正構(gòu)烷烴和含n+1 個碳原子的正構(gòu)烷烴保留時間。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法對揮發(fā)性成分進(jìn)行相對定量分析，計(jì)算公式如下：

式中：Ci為任一組分的質(zhì)量濃度（μg·kg-1）； Cis為內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度（μg·kg-1）；Ai任一組分的色譜峰面積；Ais為內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS（26.0）進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）確定差異顯著性（P<0.05），數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）來表示。使用TBtools 和SPSS 軟件繪制熱圖，SIMCA 軟件進(jìn)行PCA 和OPLS-DA 模型分析，Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)分析。數(shù)據(jù)繪圖使用Origin 2019b，相關(guān)性分析采用R 軟件進(jìn)行繪制分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alaph 多樣性分析

Alaph 多樣性通常用于分析樣品中微生物群落多樣性，單個樣品Alaph 多樣性分析可以反映樣品內(nèi)微生物群落物種豐度及物種多樣性[14]。由圖2 所示，細(xì)菌與真菌的稀釋曲線與香農(nóng)曲線逐漸趨于平坦，則說明本研究的測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。此外由表1 可知，在堆積發(fā)酵過程中，細(xì)菌的Chao1 指數(shù)在0～48 h 降低，72 h 時略有上升，細(xì)菌的Simpson 指數(shù)變化不大；真菌的Chao1 指數(shù)逐漸降低，Simpson 指數(shù)與Shannon 指數(shù)則逐漸增加，說明在洞釀環(huán)境下微生物之間競爭激烈，與車間環(huán)境下醬香酒細(xì)菌與真菌多樣性規(guī)律變化不同[6]?？傮w來說，細(xì)菌菌群的Chao1 指數(shù)、Simpson 和Shannon 指數(shù)明顯高于真菌菌群，則說明細(xì)菌的物種豐富度與多樣性較高。

表1 細(xì)菌和真菌在不同發(fā)酵時間的豐富度和多樣性Table 1 Richness and diversity of bacteria and fungi at different fermentation times

圖2 細(xì)菌和真菌的稀釋曲線（A、C）與香農(nóng)曲線（B、D）Fig.2 Dilution curves (A, C) and Shannon curves (B, D) of bacteria and fungi

2.2 樣品中微生物菌落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 基于門水平和屬水平分析樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 如圖3A 所示，在門水平上，4 個樣品中共檢測出3 個優(yōu)勢細(xì)菌門（平均相對豐度≥1.00%），分別為厚壁菌門（Firmicutes，95.2%）、變形菌門（Proteobacteria，3.80%）和放線菌門（Actinobacteriota，3.52%），這與Wang 等[15]對車間內(nèi)生產(chǎn)的醬香型白酒第五輪次優(yōu)勢細(xì)菌門的研究結(jié)果一致。由于厚壁菌門主要由芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia）等微生物組成[16]，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，可以在相對極端的條件保持生長代謝，因此厚壁菌門具有絕對優(yōu)勢。

圖3 細(xì)菌在門水平（A）與屬水平（B）上的相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacteria at phylum level (A) and genus level (B)

如圖3B 所示，在屬水平上，4 個樣品中共檢測出9 個優(yōu)勢細(xì)菌屬（相對豐度≥1.00%），分別為枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus，29.54%）、Kroppenstedtia（19.84%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，16.95%）、海洋芽孢桿菌（Oceanobaciillus，10.62%）、高溫放線桿菌屬（Themnactionomyces，7.56%）、醋酸桿菌屬（Acetobacter，2.15%）、糖多孢菌屬（Saccharopplyspora，2.07%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，1.64%）、片球菌屬（Pediococcus，1.11%）。在堆積發(fā)酵整個階段（0～72 h），枝芽孢桿菌屬、Kroppenstedtia與海洋芽孢桿菌屬為主導(dǎo)優(yōu)勢菌。在車間釀造醬香白酒中，主要優(yōu)勢細(xì)菌屬為高溫放線菌屬、芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬[10]，說明不同的釀造環(huán)境對醬香型白酒微生物區(qū)系有一定的影響。在發(fā)酵初期（0 h）枝芽孢桿菌屬相對豐度最高為33.72%，其原因可能是發(fā)酵前期可能存在一些有害菌，而枝芽孢桿菌可以抑制有害菌和病原菌等繁殖進(jìn)一步篩選有益菌群，且具有較強(qiáng)分泌蛋白酶和其他酶的能力，使大分子物質(zhì)被分解形成十二酸乙酯、3-甲基-1-丁醇等風(fēng)味化合物[17]，以增加白酒風(fēng)味。在發(fā)酵后期（72 h）Kroppenstedtia與枝芽孢桿菌屬相對豐度較高，Kroppenstedtia是高溫放線菌科的主要屬，能在大曲高溫高濕的環(huán)境下生長旺盛[18]。此外，在本研究0～72 h 期間里芽孢桿菌屬相對豐度均較高（13.56%～22.40%），聶士昊等[19]的研究發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)芽孢桿菌能夠提升醬香型白酒的微生物群落分布豐度和促進(jìn)微生物生長。

2.2.2 基于門水平和屬水平分析樣品中真菌群落結(jié)構(gòu) 如圖4A 所示，在門水平上，4 個樣品共檢測出1 個優(yōu)勢真菌門（相對豐度≥1.00%）為子囊菌門（Ascomycota，99.48%），這與Son 等[20]通過高通量測序揭示傳統(tǒng)固體發(fā)酵醬香型白酒中核心微生物群落中優(yōu)勢真菌門的研究結(jié)果一致。如圖4B 所示，在屬水平上共檢測出7 個優(yōu)勢真菌屬（相對豐度≥1.00%），分別為嗜熱真菌屬（Thermomyces，49.52%）、接合酵母菌屬（Zygosaccharomyces，11.98%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus，11.12%）、曲霉菌屬（Aspergillus，6.05%）、畢赤酵母屬（Pichia，4.04%）、紅曲霉屬（Monasaus，2.11%）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis，1.95%）。在堆積發(fā)酵初期（0～24 h）主要優(yōu)勢真菌屬為嗜熱真菌屬與嗜熱子囊菌屬，這與Wang 等[7]對貴州地區(qū)不同堆積發(fā)酵時期醬香型白酒微生物多樣性研究結(jié)果相似，這種情況與醬香型酒白酒的生產(chǎn)工藝有關(guān)，溶洞釀造與車間釀造一致使用高溫大曲，該類大曲容易分離耐高溫真菌屬[21]。但洞釀醬香酒堆積發(fā)酵72 h 后嗜熱真菌屬、嗜熱子囊菌屬相對豐度降低至23.74%、3.85%，而畢赤酵母屬、接合酵母屬呈上升趨勢，到72 h 時相對豐度升至9.19%、24.86%，成為堆積發(fā)酵后期的主導(dǎo)優(yōu)勢菌。研究表明，畢赤酵母屬的活性影響乳酸乙酯的代謝[22]，在發(fā)酵后期乳酸乙酯也成為主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。接合酵母屬成為優(yōu)勢真菌屬后對發(fā)酵后期淀粉糖化提供很大的貢獻(xiàn)，增加洞釀酒香氣，使酒體更加醇厚綿柔[23]。與洞內(nèi)釀造不同，傳統(tǒng)車間第五輪次發(fā)酵后期的優(yōu)勢真菌屬主要是Issatchenkia屬，有研究表明，溫度、濕度與酸度會影響發(fā)酵食品微生物的組成[24]，因此推測可能是因?yàn)槿芏磧?nèi)濕度及氧氣等差異造成洞內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)廠房有較大差異，后續(xù)將對洞內(nèi)空氣微生物進(jìn)行取樣并監(jiān)測洞內(nèi)濕度、氧氣濃度等參數(shù)，進(jìn)一步分析洞內(nèi)釀造對醬香白酒微生物群落結(jié)構(gòu)及品質(zhì)的影響。

圖4 真菌在門水平（A）與屬水平（B）上的相對豐度Fig.4 Relative abundance of fungi at phylum level (A) and genus level (B)

2.3 洞釀醬香酒五輪次堆積發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的變化

洞釀醬香酒在五輪次堆積發(fā)酵過程中產(chǎn)生各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類、醛類、酯類、酸類等是賦予洞釀醬香酒風(fēng)味的關(guān)鍵物質(zhì)。如下表2 與圖5所示，采用頂空固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對堆積發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物進(jìn)行檢測，根據(jù)匹配值（SI）>800 共鑒定出55 種揮發(fā)性化合物，分為6 類，分別為25 種酯類、5 種醇類、7 種醛類、4 種酸類、4 種酚類、3 種烷烴類，其余7 種風(fēng)味物質(zhì)歸為一類。

表2 五輪次洞釀醬香酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的變化Table 2 Dynamic changes of volatile flavor compounds in five rounds of Dongniang sauce-flavor Baijiu

圖5 五輪次洞釀醬香酒發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化Fig.5 Changes of volatile flavor substances during five rounds of Dongniang sauce-flavor Baijiu

酯類物質(zhì)是醬香型白酒中重要的揮發(fā)性香味物質(zhì)[25]。在檢測的25 種酯類化合物中，含量較高的有乳酸乙酯、苯乙酸乙酯、十六酸乙酯（棕櫚酸乙酯）、油酸乙酯、乙酸苯乙酯和（Z,Z）-9,12-十八烷二烯酸乙酯。其中油酸乙酯（89.97～214.53 μg·kg-1）屬于高級脂肪酸乙酯，孫優(yōu)蘭等[26]對清醬型白酒風(fēng)味特征研究中發(fā)現(xiàn)，系列酒中高級脂肪酸乙酯含量越高其醬香風(fēng)味越明顯，同時能保持酒的醬香和空杯留香的風(fēng)格特征[27]。從優(yōu)勢細(xì)菌屬看，在整個堆積發(fā)酵期間存在片球菌屬與乳酸桿菌屬，片球菌屬與乳酸桿菌屬能與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成乳酸乙酯，因此乳酸乙酯在發(fā)酵期間含量較高[28]。苯乙酸乙酯（70.84～84.67 μg·kg-1），乙酸苯乙酯（46.86～70.77 μg·kg-1），二者都屬于芳香族化合物，芳香族化合物香味突出且具有閾值低、沸點(diǎn)高、難揮發(fā)的特點(diǎn)，這是使酒體優(yōu)雅、醇厚等風(fēng)味形成的關(guān)鍵[29]。

醇類化合物是醬香型白酒中的重要風(fēng)味物質(zhì)，也是形成酒體爽口、醇厚、助香的主要成分。在洞釀醬香酒五輪次堆積發(fā)酵過程中共檢測出5 種醇類，分別是異戊醇、糠醇、芐醇、苯乙醇、十二醇。從優(yōu)勢真菌屬看，接合酵母屬與畢赤酵母屬隨著發(fā)酵的進(jìn)行，相對豐度逐漸升高，研究表明苯乙醇是由酵母菌在發(fā)酵過程中通過轉(zhuǎn)化發(fā)酵液中的苯丙氨酸產(chǎn)生的，或者從發(fā)酵初始開始產(chǎn)生[30]。因此在本研究中苯乙醇含量隨著發(fā)酵時間的進(jìn)行從509.77 μg·kg-1上升708.55 μg·kg-1，同時其具有柔和、愉快而持久玫瑰花香。異戊醇呈雜醇油香、糠醇呈焦糖甜香、芐醇呈苦杏仁氣味[31-32]。十二醇作為一種高級醇，一方面襯托酯香，另一方面可使酒體口感豐滿柔和、醇厚，給人愉快舒適的感覺[33]。這些醇類在釀造過程中含量逐漸升高，能夠增加酒體的風(fēng)味和口感[34]。

醛類物質(zhì)也是構(gòu)成醬香型白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)，主要來源于脂肪氧化與氨基酸降解[35]。在堆積發(fā)酵過程中共檢測出7 種醛類。分別為：糠醛、苯甲醛、苯乙醛、癸醛、α-亞乙基-苯乙醛、十二醛、十五醛。在0 h 時糠醛含量最高52.89 μg·kg-1，其次是苯乙醛；但隨著發(fā)酵進(jìn)行到72 h 時，糠醛含量降至0，原因可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其作為反應(yīng)的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酸類或醇類[13]。發(fā)酵后期苯乙醛含量相對其他醛類含量最高，但對比0 h 階段含量降至一半，可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行通過苯丙氨酸經(jīng)Strecker 降解產(chǎn)生醛后還原生成苯乙醇[36]。

另外還檢測到4 種酸類物質(zhì)和4 種酚類物質(zhì)。酸類物質(zhì)是形成酯類化合物的前體物質(zhì)，產(chǎn)生的酯類物質(zhì)賦予醬香型白酒特殊的香氣。其中，乙酸、辛酸分別為乙酸乙酯、辛酸乙酯的前體。酚類物質(zhì)中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚只存在于發(fā)酵前期，可能是由于畢赤酵母屬能夠利用還原酶將酒醅中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚還原為4-乙基愈創(chuàng)木酚[37]。

2.4 微生物與揮發(fā)性風(fēng)味代謝物之間的相關(guān)性分析

為了研究洞釀醬香酒五輪次堆積發(fā)酵過程中微生物群與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的關(guān)系，選取相對豐度大于1%的優(yōu)勢微生物屬與55 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析?；赑earson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示出共有935 個兩兩之間的相關(guān)性，通過相關(guān)系數(shù)|r|>0.7 和P<0.05 兩個條件同時滿足篩選出75 個兩兩強(qiáng)相關(guān)，通過Ctyoscape 對其進(jìn)行可視化。如圖6所示，其中共有47 個正相關(guān)（藍(lán)色實(shí)線）和28 個負(fù)相關(guān)（粉色虛線）。

圖6 洞釀醬香酒五輪次堆積發(fā)酵過程中微生物菌群（VIP（pred）>1）與揮發(fā)性物質(zhì)之間的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between miccroorganisms(VIP(pred)>1) and volative compounds with significantdifference during the fermentation of Dongniang sauce-flavor Baijiu

在細(xì)菌方面，與Kroppenstedtia相關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)最多，主要與酯類物質(zhì)具有較強(qiáng)的相關(guān)性，Du 等[38]研究結(jié)果顯示Kroppenstedtia也同脂肪酸酯如十四酸乙酯密切相關(guān)，十四酸乙酯可以提供花香和蜂蜜香氣，可以增強(qiáng)白酒的風(fēng)味。在真菌方面，紅曲霉菌屬作為洞釀醬香酒五輪次堆積發(fā)酵過程中的優(yōu)勢真菌屬，與14 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈正相關(guān)，主要與酯類、酚類、烷類、醇類具有較強(qiáng)相關(guān)，說明其在洞釀醬香酒五輪次堆積發(fā)酵過程中對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生起了很大作用。紅曲霉菌屬在分泌酯化酶的同時，在進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵時可以產(chǎn)生醇、醛、酸、酯類物質(zhì)，散發(fā)出酒香、果香、蜜甜香味[39]。畢赤酵母屬是一種非酵母菌屬，是產(chǎn)生豐富醇類、酯類的功能菌[40]，在五輪次洞釀醬香酒中與異戊醇、糠醇、芐醇、十二醛、苯并噻唑呈正相關(guān)，其中異戊醇、糠醇、十二醇、芐醇與嗜熱子囊菌屬呈負(fù)相關(guān)。

2.5 微生物屬間相互作用對風(fēng)味物質(zhì)的影響

微生物相互作用被認(rèn)為是支撐微生物結(jié)構(gòu)的重要因素[41]。菌群之間復(fù)雜的關(guān)系維持著整個堆積發(fā)酵體系的穩(wěn)定，推進(jìn)釀造風(fēng)味向富集方向發(fā)展[42]?；赑earson 相關(guān)系數(shù)和P值分析真菌優(yōu)勢屬與細(xì)菌優(yōu)勢屬之間的相關(guān)性。如圖7 所示，復(fù)膜孢酵母菌屬與乳酸桿菌屬呈正相關(guān)（r>0.5，P<0.05）。張艷等[43]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌通過分泌乳酸形成弱酸性培養(yǎng)環(huán)境，促進(jìn)酵母菌生長。研究表明，在葡萄酒發(fā)酵過程中乳酸菌與酵母菌共同培養(yǎng)時，可增加水果香氣[44]及與乳酸乙酯相關(guān)的奶油香氣。相反，乳酸桿菌屬抑制了

圖7 優(yōu)勢細(xì)菌屬與優(yōu)勢真菌屬相關(guān)性熱圖Fig.7 Heat map of the correlation between dominant bacteria and dominant fungal genera

畢赤酵母屬的生長，羅青春等[45]對釀酒酵母、畢赤酵母、布氏乳桿菌和耐酸乳桿菌進(jìn)行純培養(yǎng)和共培養(yǎng)對比研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌代謝合成乳酸使環(huán)境中pH 下降，抑制畢赤酵母的生長和乙醇代謝。另外，枝芽孢桿菌屬與復(fù)膜孢酵母菌屬呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），芽孢桿菌屬與接合酵母菌屬呈正相關(guān)（P<0.05），基本上所有的芽孢桿菌都可以適應(yīng)pH 在5.5～9.0 的生長環(huán)境[46]，并已被證明在醬香型白酒風(fēng)味的形成起重要作用。由此可知，不同酵母屬受環(huán)境pH 的影響不同，但由于本研究乳酸菌的豐度較低，酵母菌的豐度較大，因此枝芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、接合酵母菌屬屬于優(yōu)勢菌。

3 結(jié)論

本研究對第五輪次洞釀醬香酒堆積發(fā)酵過程中微生物群多樣性、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及二者之間的潛在相關(guān)性進(jìn)行分析。高通量測序分析結(jié)果顯示，細(xì)菌屬以枝芽孢桿菌屬、Kroppenstedtia、芽孢桿菌屬、海洋芽孢桿菌、高溫放線桿菌屬、醋酸桿菌屬、糖多孢菌屬、乳酸桿菌屬、片球菌屬為主。真菌屬以嗜熱真菌屬、接合酵母菌屬、嗜熱子囊菌屬、曲霉菌屬、畢赤酵母屬、紅曲霉屬、復(fù)膜孢酵母屬為主。采用HS-SPME/GC-MS 共檢測出55 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，分別為25 種酯類、5 種醇類、7 種醛類、4 種酸類、4 種酚類、3 種烷烴類及其他7 類。基于皮爾遜相關(guān)性分析五輪次洞釀醬香酒堆積發(fā)酵過程中微生物菌群與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以及優(yōu)勢真菌屬與優(yōu)勢細(xì)菌屬之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示Kroppenstedtia、紅曲霉屬、芽孢桿菌屬與復(fù)膜孢酵母菌屬對乳酸乙酯、十四酸乙酯、乙酸苯乙酯、糠醇等風(fēng)味物質(zhì)的形成起關(guān)鍵作用。本研究對加強(qiáng)洞釀醬香型白酒香味特性的了解具有重要的研究意義，為提高產(chǎn)品生產(chǎn)品質(zhì)提供理論。