蘇韓梅，尹海寧，張柯楠，張葉丹，李 嬋，李 瑩，惠竹梅

（西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊陵 712100）

葡萄是世界上最古老的水果之一，根據(jù)用途不同可將其分為釀酒葡萄、鮮食葡萄、制干葡萄和制汁、制罐葡萄四大類[1]。釀酒葡萄品種要求果粒小而緊湊，出汁率高，糖酸比適中，具有典型的風味和香氣，紅色品種還要求色澤亮麗[1]。葡萄品質的好壞是葡萄酒質量好壞的關鍵，通常用葡萄果實的可溶性固形物、糖酸比、pH、酚類物質的含量（包括單寧、花色苷、酚酸和黃酮類化合物）等指標來判定釀酒葡萄的品質[2]。糖類不僅具有重要的生理作用，且對釀酒葡萄的品質、口感以及深加工有很大影響，是色素及風味物質的基質[3-4]。酚類物質是衡量紅色釀酒葡萄品質的重要指標，它們決定葡萄酒的色澤，影響葡萄酒的風味[5]。

葡萄的生長發(fā)育受到內部營養(yǎng)、激素以及外部環(huán)境等因素共同調節(jié)，受光照、溫度、濕度等氣候因子的影響，釀酒葡萄果實存在著色不良、酚類物質積累不足等現(xiàn)象，影響著葡萄與葡萄酒品質[6]。研究人員通過整形修剪、鋪反光膜和補充施肥等方式調節(jié)葡萄果實生長區(qū)的微氣候以及提供釀酒葡萄生長所必須的大量元素及微量元素，從而改善葡萄品質，或者通過外源施加植物生長調節(jié)劑提高花色苷合成途徑相關酶和基因的表達，提高果實花色苷含量[7-10]。糖不僅可作為能源和結構物質，也參與調控植物生長發(fā)育及基因表達，具有和植物激素類似的作用[11]。Larronded 等[12]對葡萄果肉細胞進行懸浮培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)外源添加糖有助于誘導葡萄多酚的積累，加速果實著色，這種影響是糖特異性的，獨立于代謝和滲透效應[13-14]，先前的研究發(fā)現(xiàn)糖通過上調葡萄花色苷合成基因F3H的表達，提高花色苷合成途徑中F3H（黃烷酮3-羥化酶）的活性，進而促進果實花色苷的積累[15]。且許多研究表明，外源糖有促進草莓[16-17]、紅皮梨[18]、血橙[19]、藍莓[20]等果實花色苷積累，改善果實品質的作用，但關于外源糖對釀酒葡萄果實品質的改善效果、最適濃度和糖種類的相關研究較少。

目前，葡萄漿果的離體培養(yǎng)已被用于研究對碳源和蔗糖濃度的生長響應[21]，在離體條件下，葡萄漿果可以從培養(yǎng)基中吸收碳源和氮源，有效地利用吸收的營養(yǎng)物質進行代謝[22]，采用離體培養(yǎng)技術研究外部因素對葡萄果實花色苷合成的影響，不僅可以提高試驗的可控性，還可更精確的調控養(yǎng)分和營養(yǎng)物質的輸入[23-24]，但在實際生產中應用植物激素改善葡萄果實品質時常采用外源噴施溶液的方法[25]。因此，本研究以釀酒葡萄品種‘小味兒多’為試驗材料，分別噴施質量分數(shù)為2%、5%、8%的蔗糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖溶液，在人工氣候培養(yǎng)箱進行離體培養(yǎng)，期間統(tǒng)計各處理組葡萄轉色率，分析外源噴施不同種類糖對果實基本理化指標、花色苷和酚類物質含量的影響，通過主成分分析，明確最佳外源糖種類和適宜濃度，為深入研究外源糖對釀酒葡萄果實品質的影響機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗所用材料為歐亞種（Vitis viniferaL.）釀酒葡萄 ‘小味兒多’（cv. Petit Verdot） 采自山東省煙臺市蓬萊香格里拉瑪桑酒莊葡萄園，于葡萄轉色初期（轉色初期：葡萄果粒顏色開始變化的階段，整體轉色率在5%左右）采集生長勢基本一致的葡萄果穗，采收后立即運回實驗室進行處理；葡萄糖（Glucose，Glu）、果糖（Fructose，F(xiàn)ru）、蔗糖（Sucrose，Suc） 分析純（99.7%），光華科技股份有限公司；鼠李糖（Rhamnose，Rha） 純度≥98%，源葉生物科技有限公司；甲醇 科密歐化學試劑有限公司；吐溫80 賽默飛世爾科技有限公司。

LRX-1100D-LED 人工氣候培養(yǎng)箱 寧波普朗特儀器有限公司；YTLG-10A 冷凍干燥機 上海葉拓科技有限公司；PAL-1 手持糖度計 日本愛拓儀器公司；TGL20MW 高速冷凍離心機 北京萊博瑞杰科技有限公司；UV-1800 紫外可見分光光度計日本島津公司；超聲提取器HAD-720 北京恒奧德儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 樣本處理參考Dai 等[21]的方法并稍做改進：將葡萄果穗置于自來水下，使用流水沖洗15 min；再從整穗葡萄上剪下發(fā)育一致的未轉色漿果簇放入70% 乙醇2 s 然后轉移到含2%有效氯的NaClO 溶液中2 min，清洗過程模仿?lián)u床；之后迅速轉移到無菌去離子水中清洗2 min，重復3 次；隨后將葡萄轉移到20 mmol/L EDTA 溶液中，再次將果梗減切至約2 mm；而后將EDTA 溶液中二次剪切的果粒隨機擺放到72 孔離心管盒中，盒中盛有3%蔗糖溶液（溶液于115 ℃滅菌15 min），使果梗浸到溶液中，按照試驗設計對果粒進行噴施處理。

1.2.2 試驗設計 試驗共設13 個處理，每個處理設置三個重復：a. 無菌水（CK）；b. 2% Suc；c. 5% Suc；d.8% Suc；e. 2% Fru；f. 5% Fru；g. 8% Fru；h. 2% Glu；i.5% Glu；j. 8% Glu；k. 2% Rha；l. 5% Rha；m. 8%Rha；用無菌水將各處理的糖稀釋至對應的濃度，以吐溫80 作為展開劑（吐溫80 體積分數(shù)為0.1%），對照組的無菌水里添加同等體積分數(shù)吐溫80，以保證單一變量。按照上述試驗設計對果粒進行均勻噴施糖溶液，直至有水滴形成為止，而后轉移到恒溫26±0.5 ℃，濕度70%，光照：黑暗=16 h：8 h，光照強度為80%的培養(yǎng)箱中。每天統(tǒng)計一次轉色率，轉色達率穩(wěn)定在 90%左右時停止培養(yǎng)并采集樣品，貯于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.3 指標測定及方法

1.2.3.1 基本理化指標測定 轉色率統(tǒng)計：轉色率統(tǒng)計參照晁無疾等[26]的方法略有改動，觀察離體培養(yǎng)過程的葡萄果皮著色情況，根據(jù)著色面積將每粒葡萄著色情況分別記為1，2/3，1/2、1/3 和0，果實著色分級如表1 所示：將每粒葡萄代表值相加再除以該處理總的葡萄粒數(shù)，結果用百分數(shù)表示。轉色率計算公式：轉色率（%）=（∑每粒葡萄著色代表值）/總葡萄粒數(shù)×100。

表1 果實著色分級Table 1 Fruit coloring grading

果實基本理化指標的測定方法參考《葡萄酒分析檢驗》[27]。

可溶性固形物：隨機選取待用的葡萄果實 50 粒，除去果皮表面水分，擠出汁液混勻，用手持糖量計測定每個處理的可溶性固形物含量，重復3 次。

還原糖：取上述的葡萄汁液采用斐林試劑熱滴定法測定還原糖含量（以葡萄糖計）。

可滴定酸：取上述的葡萄汁液采用氫氧化鈉滴定法測定可滴定酸含量（以酒石酸計）。

1.2.3.2 果皮酚類物質含量的提取與測定 酚類物質的提取與測定參考蘇鵬飛[28]的方法：避光狀態(tài)下，在冰上剝取葡萄果皮，液氮冷凍粉碎成粉末裝于培養(yǎng)皿中，在冷凍干燥機中凍干24 h，取出裝于自封袋中，存放于-80 ℃冰箱中。提取時稱取0.5 g 干粉于50 mL 離心管中，加入10 mL 鹽酸甲醇溶液（60%甲醇，0.1%鹽酸）料液比1:20，于超聲提取器中（水溫30 ℃，功率40 W）下提取30 min，接著在4 ℃下10000 r/min 下離心10 min，收集上清液于絲口瓶中。然后在沉淀物中加入10 mL 鹽酸甲醇重復以上提取步驟2 次，合并3 次所有上清液搖勻并儲存于-80 ℃冰箱中備用?？偦ㄉ蘸坎捎胮H 示差法測定，總酚含量選用福林-肖卡比色法測定，類黃酮含量選用三氯化鋁比色法測定，單寧含量選用甲基纖維素沉淀法測定，黃烷醇含量選用p-DMACA-鹽酸法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2021 對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，然后采用SPSS 26.0 進行方差分析和主成分分析，并進行Duncan's 檢驗，用Excel 2021 和Origin 2022b 軟件制作圖表。

2 結果與分析

2.1 離體培養(yǎng)過程中外源糖對釀酒葡萄‘小味兒多’果實轉色率的影響

對于紅色釀酒葡萄來說，葡萄果皮著色程度對紅葡萄酒至關重要[28-29]。從葡萄顏色變化的總體趨勢來看，第2～8 d 時，葡萄轉色率與培養(yǎng)時間成正比，這個時期葡萄吸收營養(yǎng)物質和糖分的速度較快[26]。在第8～12 d 時，轉色率緩慢增加后趨于穩(wěn)定，這個階段葡萄轉色率基本達到80%以上。外源糖進入果皮細胞后無法直接轉變?yōu)榛ㄉ眨枰M行一系列的生理生化反應，才能合成花色苷[30]。因此，外源糖可促進葡萄果皮花色苷的積累，但因糖的種類和濃度不同使其作用效果存在一定差異。

由圖1a 可知，在離體培養(yǎng)第3 和第5 d 時，5%Suc 處理使葡萄轉色率顯著（P<0.05）高于對照和2%Suc 和8% Suc 處理組，而在第12 d 時，2% Suc 處理組轉色率較高，為94.23%。如圖1b 所示，2% Fru 處理使轉色率始終低于對照組和其他處理組，在第2～8 d 時，5% Fru 和8% Fru 處理使轉色率與對照之間無顯著（P>0.05）差異，但在第8～12 d 時，5% Fru 轉色率較高，最高達98.9%，其次是8% Fru。葡萄糖對果實轉色率影響如圖1c 所示，在離體培養(yǎng)期間，5%Glu 和8% Glu 處理對轉色率影響變化不穩(wěn)定，而2% Glu 處理使轉色率始終高于對照組。圖1d 反映了三個濃度的鼠李糖對果實轉色率的影響，在第5～9 d 時，5% Rha 處理使轉色率低于對照，在第10～12 d 5% Fru 與8% Fru 處理使果實的還原糖含量顯著（P<0.05）增加；三個濃度的鼠李糖處理使可溶性固形物和還原糖均顯著（P<0.05）高于對照，2% Rha 處理含量最高，8% Rha 最低；三個濃度的葡萄糖處理均可使葡萄果實中可溶性固形物和還原糖含量增加。時，各處理轉色率均高于對照，其中2% Rha 處理轉色率較高，為97.3%。

圖1 離體培養(yǎng)過程中四種外源糖對‘小味兒多’轉色率的影響Fig.1 Effect of exogenous sugars on the color transfer rate of‘Petit Verdot’ during in vitro culture

綜上所述，在本試驗中，5% Fru 促進果實轉色效果較好，其次是2% Rha，2% Suc 排第三，最后是2%Glu，這說明果皮著色程度會受到外源糖種類和濃度的影響[21-23]。

2.2 離體培養(yǎng)條件下外源糖對釀酒葡萄‘小味兒多’果實基本理化品質的影響

可溶性固形物和還原糖是釀酒葡萄內在品質的重要評價指標，在葡萄轉色過程中，其含量間接影響果皮著色和酚類物質的積累[31-32]。如表2 所示，三個濃度的蔗糖處理使可溶性固形物和還原糖含量均顯著（P<0.05）高于對照，其中2% Suc 處理使可溶性固形物和還原糖含量升高幅度較大；三個濃度的果糖處理顯著（P<0.05）降低了果實可溶性固形物含量，其中5% Fru 處理組含量最低，為4.13%，2% Fru 處理組還原糖含量與對照組之間無顯著（P>0.05）差異，

表2 外源糖對‘小味兒多’果實可溶性固形物、還原糖和可滴定酸含量的影響Table 2 Effects of exogenous sugars on soluble solids,reducing sugars and titratable acids in ‘Petit Verdot’ grape berry

可滴定酸也是果實內在品質的重要性狀之一，其含量影響葡萄果實的風味和葡萄酒的口感[25]。本研究中，2% Fru 處理使可滴定酸含量與對照之間無顯著差異，5% Fru 與8% Fru 處理使果實可滴定酸含量顯著（P<0.05）高于對照；三個濃度的蔗糖處理使可滴定酸含量均顯著（P<0.05）高于對照，其中2% Suc處理使可滴定酸含量增幅較大，為11.3%，5% Suc和8% Suc 處理之間無顯著（P>0.05）差異。與對照相比， Rha 處理使可滴定酸含量增加，2% Rha 處理增幅最大，5% Rha 處理組增幅最小。5%Glu 處理組可滴定酸含量與對照相比無顯著（P>0.05）差異，2%和8% Glu 處理后，可滴定酸含量高于對照，8% Glu處理組增幅大于2% Glu 處理組。總體來看，外源糖噴施處理使還原糖、可溶性固形物和可滴定酸含量增加，可能是因為外源糖作為基礎原料，合成并轉換成了內源糖、酸等物質[26]。

2.3 離體培養(yǎng)條件下外源糖對釀酒葡萄‘小味兒多’果皮總花色苷含量的影響

花色苷是紅色釀酒葡萄的一個重要品質指標，其生物合成受到多方面因素的影響[6]，糖不僅決定了果實的甜度與風味，也是果實和其他品質組成成分（如酚類物質、維生素和花色苷等）合成的基礎原料[32]。如圖2a 所示，蔗糖可提高果皮花色苷含量，2% Suc和5% Suc 處理之后花色苷含量顯著（P<0.05）高于8% Suc 處理，2% Suc 和5% Suc 處理組之間無顯著（P>0.05）差異。果糖對花色苷的影響如圖2b 所示，5% Fru 處理組含量最高，與對照組之間存在極顯著差異（P<0.01），其次是8% Fru 處理組，2% Fru 處理組最低，但均高于對照組。從圖2c 可以看出，2% Glu能夠促進果皮中花色苷的積累，而5% Glu 和8% Glu會抑制‘小味兒多’果皮花色苷積累，這可能受到濃度的影響，較高濃度的葡萄糖可能通過提供一個高滲透壓的環(huán)境，從而導致細胞皺縮死亡，進而抑制花色苷的積累[19]。從圖2d 可知，經2% Rha 和5% Rha 噴施處理后，‘小味兒多’果皮花色苷含量均高于對照，其中5% Rha 處理后花色苷含量較高，顯著（P<0.05）高于2% Rha 處理，而8% Rha 處理組花色苷含量顯著（P<0.05）低于對照，這與前人研究不一致，可能與葡萄品種、糖濃度和培養(yǎng)條件有關[30]。總體來看，蔗糖和果糖對花色苷積累的促進效果優(yōu)于葡萄糖和鼠李糖，果糖促進花色苷積累的最佳濃度為5%，蔗糖為2%和5%。

圖2 外源糖對‘小味兒多’果皮總花色苷含量的影響Fig.2 Effects of exogenous sugars on anthocyanins in ‘Petit Verdot’ grape skin

2.4 離體條件下外源糖對釀酒葡萄‘小味兒多’果皮花色苷酚類物質的影響

非花色苷酚類物質構成葡萄酒的骨架，賦予葡萄酒獨特的口感，總酚、單寧、類黃酮和黃烷醇是葡萄果實的重要酚類物質，決定著葡萄酒的澀感、氧化性能等[31-35]。如表3 所示，2% Fru 處理使總酚含量顯著（P<0.05）低于對照，5% Fru 與8% Fru 處理使果皮總酚含量顯著（P<0.05）高于對照，其中8% Fru 處理總酚含量最高，為45.87 mg/g；2% Suc 處理果皮總酚的含量與對照之間無顯著（P>0.05）性的差異，5% Suc和8% Suc 處理組總酚含量均顯著（P<0.05）低于對照；2% Rha 和5% Rha 處理使總酚含量均顯著（P<0.05）高于對照，其中5% Rha 處理總酚含量較高，為42.38 mg/g。2% Glu 處理組果皮總酚含量與對照相比無顯著（P>0.05）差異，5% Glu 和8% Glu 處理使總酚含量均顯著（P<0.05）低于對照。

表3 外源糖對‘小味兒多’果皮非花色苷酚類物質的影響Table 3 Effects of exogenous sugars on non-anthocyanin phenolics in ‘Petit Verdot’ grape skin

單寧決定葡萄酒的澀感[33]，從表3 可知，與對照相比，5% Fru 可顯著（P<0.05）提高果皮單寧含量，增幅為5.8%，2% Fru 和8% Fru 均降低果皮單寧含量；8% Suc 處理組單寧含量略高于對照組，2% Suc 和5%Suc 處理組單寧含量均顯著（P<0.05）低于對照；三個濃度的葡萄糖處理組單寧含量均顯著（P<0.05）低于對照，總體來看，外源糖抑制了釀酒葡萄單寧積累。

由表3 可知，三個濃度的果糖處理均可顯著（P<0.05）提高果皮類黃酮含量，其中2% Fru 處理類黃酮含量較高，為24.60 mg/g，8% Fru 處理類黃酮含量較低，類黃酮含量隨果糖濃度增加而降低；蔗糖處理后果皮類黃酮含量均顯著（P<0.05）高于對照，其中5% Suc 處理組最高，為23.31 mg/g，8% Suc 處理含量最低，為22.67 mg/g，處理組間變化幅度較小；2% Rha 和5% Rha 處理使類黃酮含量均顯著（P<0.05）高于對照，其中，5%Rha 處理使類黃酮含量高于2%Rha 處理，為23.36 mg/g，8% Rha 處理使類黃酮含量低于對照；2% Glu 處理使類黃酮含量高于對照，為23.99 mg/g。5% Glu 和8% Glu 處理使類黃酮含量均顯著（P<0.05）低于對照，綜合來看，高濃度葡萄糖和鼠李糖抑制或減少葡萄類黃酮物質積累，低濃度葡萄糖和鼠李糖則促進類黃酮積累，而三個濃度的蔗糖和果糖均促進類黃酮物質積累，與先前研究結果存在一定差異[36]。

如表3 所示，與對照相比，三個濃度的果糖均可提高果皮黃烷醇含量，與糖濃度呈正比，8% Fru 處理組黃烷醇含量略高于5% Fru 處理組；5% Suc 處理組黃烷醇含量與對照組無顯著（P>0.05）差異，質量濃度為2%的Suc 和8% Suc 均能提高果皮黃烷醇含量，其中2% Suc 處理組黃烷醇增幅最大，增加了28.1%；2% Rha 和5% Rha 處理均能提高果皮黃烷醇含量，8% Rha 處理使黃烷醇含量顯著（P<0.05）低于對照；2% Glu 能提高果皮黃烷醇含量，5% Glu 和8% Glu 則都降低了果皮黃烷醇含量。

2.5 主成分分析評價果實綜合品質

主成分分析是利用降維的思想，將多個數(shù)據(jù)轉化為少數(shù)綜合數(shù)據(jù)，這個分析方法保留了原指標的大部分信息，比單一評價更方便準確[37]。本研究采用SPSS 26.0 對外源噴施三個濃度的四種糖處理后的果實可溶性固形物（X1）、還原糖（X2）、可滴定酸（X3）、花色苷（X4）、總酚（X5）、類黃酮（X6）、單寧（X7）和黃烷醇（X8）含量進行主成分分析，結果如表4所示，共提取出兩個特征值大于1 的主成分，累計貢獻率為76.416%，可以解釋絕大部分變量信息[38]。

表4 主成分特征值及累計貢獻率Table 4 Principal component characteristic values and cumulative contribution rate

根據(jù)各指標主成分特征值（表4）與載荷表（表5） ，以載荷表中每一列的因子除以相對應的特征值的開方得到因子系數(shù)，再乘以標準化后的原始數(shù)據(jù)，計算得到各主成分得分，主成分得分方程式如下：

表5 主成分載荷表Table 5 Principal component load table

以各主成分所對應的貢獻率為權重[39]，建立綜合得分方程式：Y=0.497Y1+0.267Y2，得出各處理主成分1 得分（Y1）、主成分2 得分（Y2）和綜合得分（Y）及排名如表6 所示。

表6 外源糖處理‘小味兒多’果實品質綜合得分及排名Table 6 Comprehensive score and ranking of ‘Petit Verdot’fruit quality under different exogenous sugars

由圖3 和表5 可知，主成分1 的貢獻率最大，為49.706%，主要反映了花色苷、總酚、單寧、類黃酮和黃烷醇含量的信息，代表了葡萄果皮酚類物質的含量和品質，主成分2 的貢獻率為26.71%，主要反映了還原糖、可溶性固形物和可滴定酸含量的信息，代表了果實基本理化品質。

圖3 主成分分析載荷圖Fig.3 Principal component load diagrams

從表6 可知，主成分1 得分（Y1）最高的為5% Fru，其次是8% Fru，2% Fru 第三，說明5% Fru 對果皮酚類物質的積累更有效。主成分2 的得分（Y2）最高的2% Suc，其次是5% Suc，8% Glu 排第三，說明蔗糖能有效改善果實基本理化品質，其中2% Suc 對果實基本理化品質改善效果較好。

從表6 可知，8%Fru 處理組果實綜合品質得分最高，其次是5% Fru，排名第3、第4 的分別是2% Suc和5% Rha，這也分別代表了不同種類糖處理的最佳濃度。但在葡萄糖中，得分最高的2% Glu，排名在第7 位，且5%和8% Glu 排名均在CK 之后，分別為13 和11 名。三個濃度的果糖和蔗糖處理組排名均在對照之前，除5% Suc 和2% Fru 處理組外，其余組均在前6 名。由此可見，在提高果實綜合品質方面，處理效果最好為果糖，最適濃度為8%，綜合排名第1，5% Fru 綜合排名第2，2% Fru 綜合排名為第9，僅高于對照組；其次為蔗糖，最適濃度為2%，綜合排名為第3，8% Suc 綜合排名第5，5% Suc 綜合排名為第8；鼠李糖第3，最適濃度為5%，綜合排名在第4 位，2% Rha 排名第6，8% Rha 排名在對照組后面，為第12 名；葡萄糖在提高葡萄果實品質方面作用不明顯，2% Glu 排名在第7 位，高于對照組兩名，而5%和8% Glu 排名均低于對照，分別為13 和11 名。

3 結論

在本試驗中，果糖、蔗糖和鼠李糖對釀酒葡萄果實品質均有較明顯的改善作用，主成分分析結果表明，在提高果實綜合品質方面，處理效果最好為果糖，8% Fru 綜合排名第1，5% Fru 綜合排名第2，蔗糖的最適濃度為2%，綜合排名為第3，鼠李糖的最適濃度為5%，綜合排名在第4 位，葡萄糖對提高葡萄果實品質作用不明顯。從主成分1 和主成分2 的得分情況來看，果糖對花色苷和酚類物質（主成分1）積累有較明顯的促進作用，其中5% Fru 得分最高，8% Fru第2，2% Fru 第3；蔗糖使可溶性固形物、還原糖和可滴定酸（主成分2）的含量明顯增加，其中2% Suc得分最高，5% Suc 第2，8% Suc 第6。這表明不同種類糖進入果皮細胞后可能有不同的代謝途徑和代謝產物，需要進一步深入研究不同種類糖在果皮細胞中的代謝機制。