張廣麗,黎壯偉,宋 卉

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院,廣東 廣州 510000)

化療仍然是目前治療肺癌的主要手段之一,該療法可抑制和殺傷肺癌細(xì)胞,但由于多數(shù)化療藥物對(duì)肺癌細(xì)胞特異性并不高,在殺傷肺癌細(xì)胞的同時(shí)也破壞了機(jī)體的正常細(xì)胞,造成骨髓抑制[1],患者常出現(xiàn)貧血、白細(xì)胞下降或者血小板下降。所以加強(qiáng)肺癌化療者骨髓造血功能保護(hù)成為癌癥治療領(lǐng)域的重要目標(biāo)。龜板固本方是治療腫瘤相關(guān)性貧血的有效經(jīng)驗(yàn)方,課題組前期研究證實(shí)該方可有效防治骨髓抑制[2-3],推測(cè)其可能是通過(guò)作用于細(xì)胞DNA周期,參與受損傷的細(xì)胞DNA修復(fù),并調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白,進(jìn)而改善骨髓的抑制程度。為驗(yàn)證這一假說(shuō)是否正確,本課題組通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),從骨髓細(xì)胞DNA周期損傷修復(fù)及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的角度,研究了龜板固本方對(duì)肺癌化療小鼠骨髓抑制的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠60只,體重18～22 g,購(gòu)于北京華阜康科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0008]。動(dòng)物在SPF 級(jí)屏障環(huán)境動(dòng)物房分籠飼養(yǎng),5只/籠,自由攝食飲水,室溫(21±2)℃,濕度30%～60%,照明時(shí)間12 h,換氣次數(shù)>10次/h。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循2006年國(guó)家科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的規(guī)定。

1.2細(xì)胞株及藥品 Lewis肺癌瘤株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。龜板固本方由龜板15 g、黃精30 g、桑椹30 g、黃芪30 g、紅參10 g組成,中藥飲片購(gòu)自廣州致信藥業(yè)股份有限公司,按常規(guī)方法水煎取汁濃縮,實(shí)驗(yàn)用藥生藥含量為0.8 g/mL,置冰箱4 ℃保存?zhèn)溆?。注射用環(huán)磷酰胺由江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字H32020857,規(guī)格:0.2 g/瓶。重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液,杭州九源基因工程有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字S10980029,規(guī)格:75 μg/支。

1.3主要試劑與儀器 Bcl-2、Bax抗體(英國(guó)Abcam公司);碘化丙啶(北京百奧萊博科技有限公司)。RNA酶(Roche公司); IMDM培養(yǎng)液(HYCLONE公司,批號(hào): NWB0372)。Napco-5410 CO2培養(yǎng)箱 (美國(guó)Shelden公司) ;全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-SⅡ);UV2101 PC型紫外分光光度計(jì)(尤尼科上海儀器有限公司)。熒光顯微鏡(Leica Microsystems Ltd,德國(guó));流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECKMAN-COULTER公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將60只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、龜板固本方組、粒細(xì)胞刺激因子組,每組15只。除空白組外,其他3組小鼠均進(jìn)行肺癌骨髓抑制造模。具體方法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis肺癌細(xì)胞,常規(guī)離心,制成瘤細(xì)胞混懸液,消毒小鼠右前腋,取0.2 mL接種于皮下。待瘤體生長(zhǎng)至直徑1～1.5 cm時(shí),處死小鼠,選取生長(zhǎng)良好的瘤組織,剪碎、稱(chēng)重,用細(xì)胞勻漿器制成勻漿,制備成濃度為1×107/mL瘤細(xì)胞混懸液,每只小鼠右腋下接種0.2 mL[約(1～2)×106瘤細(xì)胞],接種4 d后,以小鼠右腋下皮下可觸及腫瘤塊標(biāo)志肺癌造模成功。然后對(duì)肺癌造模成功小鼠一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺250 mg/kg(于臨用前配制),以外周血WBC、RBC、Plt明顯低于正常小鼠提示肺癌骨髓抑制模型復(fù)制成功[1]。造模完成后24 h,龜板固本方組按0.4 mL/d的劑量灌胃龜板固本方懸液,空白組和模型組灌胃等量生理鹽水,粒細(xì)胞刺激因子組皮下注射重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液5 ng/g,均1次/d,連續(xù)干預(yù)7 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1骨髓細(xì)胞周期 最后1次干預(yù)24 h后,經(jīng)頸椎脫臼處死各組小鼠,取左側(cè)股骨,用剪刀剪開(kāi)股骨兩頭,露出骨髓腔,然后用消毒過(guò)的注射器(4號(hào)針頭)吸取2 mL培養(yǎng)液,反復(fù)沖洗骨髓腔,收集骨髓細(xì)胞,全部置離心管內(nèi),反復(fù)吹打使細(xì)胞完全分散,然后1 000 r/min離心10 min,去上清,加入適量培養(yǎng)液充分混勻,制成骨髓有核細(xì)胞懸液。加入1 mL冰浴預(yù)冷70%乙醇中,輕輕吹打混勻,4 ℃固定12 h,用PBS漂洗2次后,加100 μL PBS混勻,加入濃度為50 μg/mL的碘化丙啶染色液,37 ℃避光溫浴30 min,4 ℃避光存放。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠骨髓細(xì)胞周期。

1.5.2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 取各組小鼠右側(cè)股骨,4%多聚甲醛固定24 h,20% EDTA脫鈣,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、切片,用免疫組化SP法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)情況。攝像顯微鏡下觀(guān)察,Bcl-2和Bax陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色,無(wú)棕黃色為陰性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),取其平均值為每張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。Bcl-2和Bax表達(dá)情況以陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定,陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn): 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1%～25%為1分,26%～50%為2分, 51%～75%為3分, 76%～100%為4分。染色強(qiáng)度:無(wú)色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分。以?xún)身?xiàng)評(píng)分的乘積作為最終的判斷結(jié)果,≤7分為陰性,>7分為陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠骨髓細(xì)胞周期比較 與空白組比較,模型組G0/G1期和S期細(xì)胞比例明顯升高(P均<0.05),G2/M期細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05);與模型組比較,龜板固本方組和粒細(xì)胞刺激因子組G0/G1期細(xì)胞比例均明顯降低(P均<0.05),S期和G2/M期細(xì)胞比例均明顯升高(P均<0.05);與粒細(xì)胞刺激因子組比較,龜板固本方組S期細(xì)胞比例較低(P<0.05),G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 空白組和肺癌骨髓抑制各組小鼠骨髓細(xì)胞周期比較

2.2各組小鼠骨髓細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)情況比較與空白組比較,模型組Bax蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,龜板固本方組和粒細(xì)胞刺激因子組Bax蛋白表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);與粒細(xì)胞刺激因子組比較,龜板固本方組Bcl-2蛋白表達(dá)量較低(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 空白組和肺癌骨髓抑制各組小鼠骨髓細(xì)胞中凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)量比較

3 討 論

骨髓抑制是肺癌藥物治療過(guò)程中常見(jiàn)的不良反應(yīng),目前仍沒(méi)有非常有效的預(yù)防方法,主要是骨髓抑制發(fā)生后采用促紅細(xì)胞生成素、重組人粒細(xì)胞刺激因子、白細(xì)胞介素-11等選擇性作用于造血祖細(xì)胞,促進(jìn)其增殖、分化,改善骨髓抑制,但其作用時(shí)間比較短暫,不能長(zhǎng)期有效解決骨髓抑制問(wèn)題。細(xì)胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與合成后期(G2期)、細(xì)胞分裂期(M期),骨髓細(xì)胞周期的分布情況是骨髓造血功能的重要指標(biāo),可以反映骨髓增殖的狀態(tài)。當(dāng)化療使造血細(xì)胞DNA受到損傷后,骨髓細(xì)胞周期阻滯于G1期來(lái)修復(fù)損傷的DNA,對(duì)不能修復(fù)者啟動(dòng)凋亡程序消除受損細(xì)胞。因此,解除骨髓細(xì)胞G1期阻滯,使細(xì)胞由G1期轉(zhuǎn)入S期,進(jìn)而使S期向G2/M期轉(zhuǎn)化是拮抗放、化療藥物造成骨髓抑制的一個(gè)重要機(jī)制[4-5]。造血干細(xì)胞數(shù)量減少與骨髓細(xì)胞凋亡增加有關(guān)[6]。細(xì)胞凋亡受到一系列相關(guān)基因的調(diào)節(jié)和控制,其中Bcl蛋白家族為細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)者[7],按其作用不同分為抗凋亡和促凋亡兩大類(lèi)[8-9]。Bcl-2屬于抗細(xì)胞凋亡因子,其表達(dá)增強(qiáng),可抑制骨髓細(xì)胞凋亡;Bax屬于促細(xì)胞凋亡因子,其表達(dá)增強(qiáng),可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有研究表明,中藥具有干預(yù)細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,例如青藤堿可抑制786-O細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S期阻滯,調(diào)節(jié)786-O細(xì)胞中cmyc的表達(dá)水平,誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)上調(diào),促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。中藥復(fù)方益髓理血飲能下調(diào)骨髓增生異常綜合征大鼠Bax表達(dá),上調(diào)Bcl-2表達(dá),減少骨髓細(xì)胞凋亡[11]。

骨髓抑制表現(xiàn)為血液不足或血液的濡養(yǎng)功能減退,患者可見(jiàn)精神疲倦、乏力、頭暈、面色蒼白或萎黃、唇甲蒼白、氣促、心悸、失眠、多夢(mèng)、手腳麻木,舌質(zhì)淡,脈細(xì)無(wú)力,中醫(yī)可按“血虛證”進(jìn)行辨證論治。中醫(yī)認(rèn)為, 脾和腎與血的生成關(guān)系最為密切,血液來(lái)源于經(jīng)中焦脾胃所化生的水谷精微,如《靈樞·決氣》所說(shuō):“中焦受氣,取汁,變化而赤,是謂血?！蹦I者主水,受五臟六腑之精而藏之,精能生血?！吨T病源候論》指出:“腎藏精,精者,血之所成也?！狈断然萚12]研究表明,健脾益腎補(bǔ)血法能夠明顯改善肺癌化療者骨髓造血功能,提高外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)及血紅蛋白等。劉杰等[13]研究顯示,健脾益腎顆粒不但能促進(jìn)骨髓有核細(xì)胞分裂,保護(hù)造血干細(xì)胞,而且能通過(guò)提高細(xì)胞免疫功能,補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和微量元素等多種途徑而發(fā)揮生血作用。馬晶潔等[14]研究結(jié)果顯示,化療期間配合使用健脾補(bǔ)腎方可改善貧血,提高患者的生活質(zhì)量。由此可見(jiàn),健脾補(bǔ)腎是治療骨髓抑制的主要原則。龜板固本方具有健脾補(bǔ)腎、填精益髓的功效。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),龜板固本方能明顯提升肺癌骨髓抑制小鼠外周血白細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞計(jì)數(shù),能提高骨髓造血微環(huán)境的促紅細(xì)胞生成素 、血小板生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子含量[15],從而改善骨髓抑制,促進(jìn)骨髓細(xì)胞分化增殖。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組G0/G1期和S期細(xì)胞比例顯著升高,G2/M期細(xì)胞比例顯著降低,表明化療不僅引起G1期阻滯,而且還造成S期阻滯;與模型組比較,龜板固本方組G0/G1期細(xì)胞比例顯著下降,S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著升高,表明龜板固本方可能通過(guò)解除細(xì)胞G0/G1期和S期阻滯,促使G1期細(xì)胞進(jìn)入S期,使S期細(xì)胞向G2/M期細(xì)胞轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖,改善骨髓抑制。同時(shí)模型組Bax蛋白表達(dá)升高,Bcl-2蛋白表達(dá)降低,提示化療促進(jìn)骨髓細(xì)胞凋亡;龜板固本方組Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào),Bax蛋白表達(dá)下調(diào),說(shuō)明龜板固本方可調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),從而抑制骨髓細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)在以往臨床和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步證實(shí)龜板固本方可通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)和下調(diào)Bax蛋白表達(dá),抑制肺癌骨髓抑制小鼠骨髓細(xì)胞凋亡,促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖,為龜板固本方治療骨髓抑制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。