張婷婷,高 梅,曲蒙蒙,嚴(yán)鎵文,吉郡珠,余海濱,2

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450000;2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)和特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是呼吸系統(tǒng)常見的異質(zhì)性疾病,均以通氣功能障礙為主要特征,其患病率居高不下且遷延難愈,給患者造成了巨大的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),我國40歲以上COPD患者高達(dá)9 990萬余人[1],預(yù)計(jì)到2030年將有超過105萬人死于COPD[2],是繼心血管疾病及中風(fēng)之后的導(dǎo)致死亡的第3大疾病[3]。COPD的主要病理特征是異常炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的氣道、血管以及肺實(shí)質(zhì)的改變,以小氣道疾病和肺氣腫等為主要表現(xiàn)[4]。IPF多發(fā)生于50歲以上的中老年人,男性多于女性,其主要病理學(xué)特征為肺泡外基質(zhì)的過度積累所導(dǎo)致的肺部瘢痕組織形成、肺泡結(jié)構(gòu)異常以及肺功能不可逆的喪失[5],是當(dāng)前社會(huì)面臨的主要健康問題之一。“異病同治”是指病機(jī)相同的不同疾病可以采用同一種方法進(jìn)行治療,即“證同則治同”[6]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為,COPD可歸屬為“肺脹”“咳嗽”等范疇,IPF則被冠為“肺痿”“肺痹”之名,二者病變臟腑皆責(zé)之肺、脾、腎,其病機(jī)均與氣虛、痰濁、血瘀有關(guān)[7-9]。補(bǔ)肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補(bǔ)骨脂3味中藥組成,其中黃芪擅補(bǔ)肺脾之氣,赤芍長于清熱涼血、活血化瘀,二者配伍調(diào)氣和血,補(bǔ)骨脂則以溫腎助陽、納氣平喘為主,全方肺脾腎兼顧且氣血陰陽同調(diào),共奏補(bǔ)肺納腎、益氣活血之功。相關(guān)研究表明,補(bǔ)肺活血膠囊在治療COPD及IPF方面具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)蛋白酶-抗蛋白酶平衡、改善肺功能及肺組織損傷等功能[10-12],臨床應(yīng)用頗為廣泛,但其作用機(jī)制尚未完全明確,仍需進(jìn)一步深入探討。本研究旨在從“異病同治”的角度,利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討補(bǔ)肺活血膠囊對COPD及IPF發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵成分、核心靶點(diǎn)、生物學(xué)進(jìn)程以及主要信號(hào)通路等,并用分子對接技術(shù)對關(guān)鍵活性成分及核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行初步驗(yàn)證,進(jìn)一步明確其分子作用機(jī)制,以期為臨床用藥及后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供方向和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1篩選補(bǔ)肺活血膠囊活性成分及靶點(diǎn) 通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫分別以“HUANG QI”“CHI SHAO”“BU GU ZHI”為檢索詞獲取補(bǔ)肺活血膠囊的藥物活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn),以“score cutoff≥20且adjusted P-value≤0.05”為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.2獲取補(bǔ)肺活血膠囊與COPD及IPF的交集靶點(diǎn) 分別以“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”“Idiopathic Pulmonary Fibrosis”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲取疾病靶點(diǎn),并以“Relevance score≥中位數(shù)”為條件進(jìn)行篩選,與從TTD及DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索到的疾病靶點(diǎn)合并去重,然后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,并用易漢博生物信息在線作圖工具(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)進(jìn)行映射,所得交集靶點(diǎn)即為補(bǔ)肺活血膠囊治療COPD及IPF的共同靶點(diǎn)。

1.3構(gòu)建“中藥-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò) 將補(bǔ)肺活血膠囊治療COPD及IPF的中藥、活性成分及交集靶點(diǎn)信息錄入Excel,建立相應(yīng)表格后導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,構(gòu)建“中藥-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),并根據(jù)相應(yīng)度(degree)值篩選主要活性成分,隨后利用STRING 11.5在線分析平臺(tái)對交集靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks,PPI),設(shè)置物種為人類,置信度(medium confidence)≥0.4,并隱去孤立靶點(diǎn)。

1.4篩選核心靶點(diǎn) 將構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)保存為TSV格式并導(dǎo)入Cytoscape軟件中,利用Network Analyzer在線工具進(jìn)行拓?fù)浞治?以“Degree≥2倍中位數(shù)”為標(biāo)準(zhǔn)對交集靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,所得靶點(diǎn)即為補(bǔ)肺活血膠囊異病同治COPD及IPF的核心靶點(diǎn)。

1.5核心靶點(diǎn)的GO、KEGG富集分析 運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫對核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析,物種選擇“Homo Spanines”,P-value<0.01,以進(jìn)一步明確補(bǔ)肺活血膠囊作用于COPD及IPF的共同細(xì)胞組分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)、生物過程(biological process, BP)及主要富集的信號(hào)通路,并分別根據(jù)-logP值及count值選擇相應(yīng)條目,利用微生信平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)對其結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.6分子對接 運(yùn)用PubChem數(shù)據(jù)庫下載補(bǔ)肺活血膠囊作用于COPD及IPF的前5位活性成分的3D結(jié)構(gòu),并用OpenBabel 3.1.1軟件將其轉(zhuǎn)化為pdb格式。通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫檢索度值前5位的核心靶點(diǎn),設(shè)置物種為“Homo Sapiens”,實(shí)驗(yàn)方法為X射線衍射法,獲取最優(yōu)評分的PDB ID及其三維結(jié)構(gòu)的pdb文件,并用Pymol軟件去除水和小分子配體,隨后將主要活性成分及核心靶點(diǎn)分別導(dǎo)入AutoDock Vina軟件進(jìn)行半柔性對接,并選取最優(yōu)構(gòu)象利用Pymol軟件繪制相應(yīng)分子對接模式圖。

2 結(jié) 果

2.1補(bǔ)肺活血膠囊活性成分及靶點(diǎn)的獲取 通過檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲得47種藥物活性成分及1 109個(gè)作用靶點(diǎn),分別去除重復(fù)值后最終得到38種活性成分,其中黃芪23種、赤芍4種、補(bǔ)骨脂11種,對應(yīng)靶點(diǎn)624個(gè)。

2.2補(bǔ)肺活血膠囊與COPD及IPF的交集靶點(diǎn)的獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫初步獲得6 407個(gè)COPD靶點(diǎn)及3 509個(gè)IPF靶點(diǎn),篩選后得到3 204個(gè)COPD靶點(diǎn)及1 755個(gè)IPF靶點(diǎn)。與從DisGeNET和TTD數(shù)據(jù)庫篩選的相應(yīng)靶點(diǎn)合并去重后獲得3 836個(gè)COPD靶點(diǎn)和2 139個(gè)IPF靶點(diǎn)。將藥物與疾病靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行映射,并且繪制相應(yīng)韋恩圖,見圖1,共得到180個(gè)交集靶點(diǎn)。

圖1 補(bǔ)肺活血膠囊與COPD和IPF的交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3“中藥-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件繪制“中藥-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2,其中黃色代表補(bǔ)肺活血膠囊中的3味中藥,綠色代表相應(yīng)活性成分,藍(lán)色代表交集靶點(diǎn)。利用Network Analyzer在線工具對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?篩選到前5位化合物成分分別為異補(bǔ)骨脂素(又稱異補(bǔ)骨脂內(nèi)酯、當(dāng)歸素,angelicin)、刀豆氨酸(canavanine)、豆甾醇(stigmasterol)、補(bǔ)骨脂酚(backuchiol)以及β-谷甾醇(beta-sitosterol),其Degree值分別為33,32,31,27,22。通過STRING數(shù)據(jù)庫對180個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,見圖3,共有180個(gè)節(jié)點(diǎn),1 759條邊,平均節(jié)點(diǎn)度值19.5。表明補(bǔ)肺活血膠囊是通過多種活性成分作用于多個(gè)潛在靶點(diǎn)協(xié)同參與“異病同治”COPD及IPF的分子機(jī)制。

圖2 “中藥-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4核心靶點(diǎn)的篩選 借助Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?以Degree≥30為標(biāo)準(zhǔn)篩選到33個(gè)核心靶點(diǎn),主要涉及ALB(Degree:98)、Akt1(Degree:94)、INS(Degree:93)、TNF(Degree:89)、IL1B(Degree:72)等,這些核心靶點(diǎn)即為補(bǔ)肺活血膠囊“異病同治”COPD和IPF的關(guān)鍵靶點(diǎn)。對核心靶點(diǎn)進(jìn)行可視化,見圖4,節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深說明該靶點(diǎn)在治療中發(fā)揮的作用越重要。

圖4 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5核心靶點(diǎn)的GO、KEGG富集分析 利用Mestascape數(shù)據(jù)庫對33個(gè)核心靶點(diǎn)分別進(jìn)行GO、KEGG富集分析,物種選擇人類,P<0.01,共得到975個(gè)GO條目以及100條信號(hào)通路。GO功能富集分析主要包括對激素的反應(yīng)、小分子代謝過程的調(diào)節(jié)、血液循環(huán)等902個(gè)生物過程以及分泌顆粒管腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、囊泡腔以及血小板α顆粒管腔等27個(gè)細(xì)胞組分和受體配體活性、信號(hào)受體激活劑活性、四氫生物蝶呤結(jié)合、信號(hào)受體調(diào)節(jié)活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性等46個(gè)分子功能。按-logP值對其結(jié)果進(jìn)行排序,分別取前10條條目進(jìn)行可視化,繪制相應(yīng)圈圖見圖5。由外自內(nèi)第1圈表示富集的分類及相應(yīng)條目編號(hào);第2圈表示該條目中的總基因數(shù),顏色越深代表-log10(p-value)值越大;第3圈表示該條目富集的核心靶點(diǎn)基因數(shù),即count值;第4圈表示該條目富集的核心靶點(diǎn)基因數(shù)與該條目總基因數(shù)的比值,即RichFactor值。KEGG通路富集分析共得到100條信號(hào)通路。結(jié)果顯示,核心靶點(diǎn)基因主要涉及癌癥通路、HIF-1信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌、PI3K-Akt信號(hào)通路、癌癥中的蛋白聚糖、化學(xué)致癌-受體激活、雌激素信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化等。按count值取前20條條目繪制氣泡圖,見圖6。說明補(bǔ)肺活血膠囊異病同治COPD及IPF主要是通過多種信號(hào)通路共同完成的,其中HIF-1信號(hào)通路可能是其發(fā)揮治療作用的主要信號(hào)通路,利用KEGG PATHWAY Database在線平臺(tái)(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)繪制相應(yīng)信號(hào)通路圖,見圖7。

圖5 GO功能富集分析圈圖

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖7 HIF-1信號(hào)通路圖

2.6分子對接結(jié)果 將核心靶點(diǎn)蛋白ALB(PDB ID:6M4R)、Akt1(PDB ID:3OS5)、INS(PDB ID:5W2H)、TNF(PDB ID:1TNR)、IL1B(PDB ID:1HIB)與主要活性成分異補(bǔ)骨脂素、刀豆氨酸、豆甾醇、補(bǔ)骨脂酚以及β-豆甾醇進(jìn)行分子對接,借助JShare在線工具(https://jshare.com.cn/demos/hhhhiz)對分子對接結(jié)果繪制相應(yīng)熱圖,見圖8,顏色越深表示配體與受體間的結(jié)合能越低,說明其結(jié)合活性越好。研究發(fā)現(xiàn),若分子對接結(jié)合能<-4.25 kcal/mol,說明活性成分與靶點(diǎn)蛋白間有一定的結(jié)合活性;若結(jié)合能<-5.0 kcal/mol,說明二者結(jié)合性能較好;若結(jié)合能<-7.0 kcal/mol,說明兩者結(jié)合活性較高,其分子對接的構(gòu)象較穩(wěn)定。分子對接結(jié)果顯示,所有活性成分與靶點(diǎn)蛋白間均能自由結(jié)合并且形成氫鍵,且除TNF與Canavanine外均能較好結(jié)合[13-14]。利用Pymol軟件將分子對接結(jié)合能≤-10.0 kcal/mol的結(jié)果進(jìn)行可視化,見圖9。

圖8 分子對接熱圖

圖9 部分分子對接結(jié)果模式圖

3 討 論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出補(bǔ)肺活血膠囊主要活性成分包括異補(bǔ)骨脂素、刀豆氨酸、豆甾醇等,其中異補(bǔ)骨脂素可作用于33個(gè)COPD及IPF的相關(guān)靶點(diǎn),是補(bǔ)肺活血膠囊發(fā)揮“異病同治”作用的首要活性成分。相關(guān)研究表明,異補(bǔ)骨脂素不僅能通過顯著下調(diào)小鼠體內(nèi)TNF及IL-6的水平,降低脂多糖誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞數(shù)量,以作用于NF-κB和MAPK信號(hào)通路來控制炎癥反應(yīng),減輕肺組織損傷[15];還可以減少體內(nèi)IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子的釋放,抑制氣道高反應(yīng)性和NF-κB活化[16];此外,還可以通過調(diào)節(jié)JNK和ERK通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來抑制癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移,發(fā)揮抗腫瘤活性[17]。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明補(bǔ)肺活血膠囊“異病同治”COPD和IPF主要通過多個(gè)潛在靶點(diǎn)共同發(fā)揮治療作用,其中ALB、Akt1、INS、TNF、IL1B等核心靶點(diǎn)尤為重要。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明[18],Akt1可以通過上調(diào)巨噬細(xì)胞中促纖維化細(xì)胞因子IL-13的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)肺纖維化,而它的缺乏則會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白沉積和纖維形成減少;除此之外,Larson-Casey等[19]發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細(xì)胞中Akt1誘導(dǎo)的線粒體自噬與細(xì)胞凋亡抗性以及促纖維化極化有關(guān),這對探索IPF的潛在治療策略具有重要意義。TNF-α作為一種常見的促炎細(xì)胞因子,在許多炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在IPF患者體內(nèi),脂多糖迅速刺激巨噬細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生,然后激活NF-κB通路誘導(dǎo)趨化因子CXCL13基因的表達(dá),進(jìn)而控制肺中異位淋巴結(jié)構(gòu)的新生[20];另外,當(dāng)細(xì)胞受到TNF-α刺激時(shí),NF-κB與κB位點(diǎn)結(jié)合,進(jìn)一步激活TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性細(xì)胞因子,反過來增強(qiáng)炎性反應(yīng),加重COPD患者肺組織損傷[21]。一項(xiàng)大型研究發(fā)現(xiàn),IL1B可能是COPD氣道炎癥的新參與者,它在COPD患者小氣道上皮細(xì)胞中顯著上調(diào),但在肺組織、痰液和血液中沒有,推測這可能是由于對外源性刺激以及炎癥微環(huán)境的反應(yīng)[22]。由此推測補(bǔ)肺活血膠囊可通過多種活性成分作用于上述靶點(diǎn),控制COPD和IPF炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展,從而達(dá)到治療疾病的目的。

GO功能富集分析結(jié)果表明補(bǔ)肺活血膠囊主要通過參與對激素的反應(yīng)、血液循環(huán)、調(diào)節(jié)小分子代謝過程、蛋白質(zhì)磷酸化以及平滑肌細(xì)胞增殖等生物學(xué)進(jìn)程來發(fā)揮治療COPD和IPF的作用,這與COPD和IPF的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制以及病理生理學(xué)特點(diǎn)相吻合。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示補(bǔ)肺活血膠囊“異病同治”COPD和IPF主要與HIF-1、PI3K-Akt、TNF等信號(hào)通路密切相關(guān)。研究表明,大多數(shù)慢性炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病與缺氧有關(guān)[23]。COPD和IPF患者的氣道通常以慢性炎癥、結(jié)構(gòu)改變以及黏液分泌過多所致的氣道阻塞等為特征,這可能引起肺局部組織區(qū)域耗氧量增加,進(jìn)一步導(dǎo)致微環(huán)境缺氧,反過來影響炎癥的消退。當(dāng)HIF-1信號(hào)通路被激活后,與其相關(guān)的蛋白HIF-1α在患者肺組織中的過度表達(dá),增加的HIF-1α可以上調(diào)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體VEGF2,進(jìn)一步在外周血管生成和氣道重塑中發(fā)揮作用[24]。PI3K/Akt信號(hào)通路作為調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路之一,它的激活不僅可以通過調(diào)節(jié)下游的mTOR、HIF-1α和FoxO等來參與肺纖維化[25],而且可以促進(jìn)COPD大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和黏附[26],極有可能是治療COPD和IPF的合理治療位點(diǎn)。

分子對接結(jié)果預(yù)測出補(bǔ)肺活血膠囊中主要活性成分均可與潛在核心靶點(diǎn)自由結(jié)合,一定程度上驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的準(zhǔn)確性,為后續(xù)藥理學(xué)研究提供了一定的方向。

綜上所述,本研究基于“異病同治”理論,利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)從分子層面揭示了補(bǔ)肺活血膠囊主要通過多成分、多靶點(diǎn)以及多條信號(hào)通路協(xié)同發(fā)揮“異病同治”COPD和IPF的作用機(jī)制。然而,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法也存在一定的局限性。首先,相關(guān)數(shù)據(jù)庫更新不及時(shí),某些活性成分和靶點(diǎn)尚未被錄入或者尚未被研究發(fā)現(xiàn);其次,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)只是把中藥組成單純相加,并未考慮到藥物間的配伍關(guān)系以及藥物含量、濃度等影響因素;最后,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接結(jié)果均為預(yù)測所得,補(bǔ)肺活血膠囊“異病同治”COPD和IPF的潛在分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。