陳 潔,楊林燕,郝曉娟,何 琦,侯世杰

(邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056001)

糖尿病腎病是糖尿病最常見的一種微血管并發(fā)癥,是引發(fā)終末期腎病的第二大原因,僅次于慢性腎小球腎炎,具有較高的致殘、致死率[1]。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)高血糖導(dǎo)致糖脂代謝紊亂,引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),破壞腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能,導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率降低、腎細(xì)胞代償性增生和組織纖維化[2-3]。由E2相關(guān)因子2(Nrf2)及其下游血紅素加氧酶1(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO1)組成的信號通路在細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用,激活Nrf2/HO-1信號通路,能夠抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而減輕糖尿病腎病腎損傷[4]。金雀異黃酮(又名染料木素)廣泛存在于金雀花、大豆、皂莢、槐角等豆科植物中,具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用[5-6]。既往實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),金雀異黃酮能夠通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路減輕糖尿病大鼠心肌組織損傷[7],可通過調(diào)控MAPK/核因子κB(NF-κB)通路減輕糖尿病腎病大鼠腎細(xì)胞線粒體損傷[8]。但金雀異黃酮對糖尿病腎病大鼠腎損傷的影響以及是否與調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)尚需進(jìn)一步研究,故本實(shí)驗(yàn)基于該通路探討了金雀異黃酮對糖尿病腎病大鼠腎損傷的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 55只清潔級雄性SD品系大鼠,7周齡,體重180～210 g,購于河北伊維沃生物科技有限公司[SCXK(冀)2020-002],在室溫23～25 ℃、相對濕度45%～65%、12 h/12 h光暗交替的控制環(huán)境中分籠飼養(yǎng)。研究中所有動物操作遵循減少、替代、優(yōu)化原則。本實(shí)驗(yàn)通過邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會審批通過[HDZXLL(K) 2021-018]。

1.2藥物與試劑 金雀異黃酮(純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司(批號:Y21D5C10382);鴉膽子苦醇(Nrf2抑制劑)、鏈脲佐菌素(STZ)、馬森(Masson)染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司(貨號分別為IB0520,S8050,G1340);蘇木精-伊紅(HE)、過碘酸-雪夫(PAS)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號分別為C0105M,C0142M);鋨酸、醋酸鈾、檸檬酸鉛購自美國Ted Pella公司(貨號分別為19271,21035,20084);肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、尿微量白蛋白(U-mAlb)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所(貨號分別為C011-2-1,C013-2-1,E038-1-1,H052-1,H002,H008);總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司(貨號分別為YT309,YT292,KFS380);兔源Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1、核因子κB(NF-κB)、β-actin、組蛋白H 3(H3)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號分別為bs-1074R,bs-2013R,bs-23407R,bs-3485R,bs-0061R,bs-3776R);RIPA裂解液、BCA法蛋白含量檢測試劑盒、核蛋白提取試劑盒、羊抗兔IgG二抗、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司(貨號分別為R0010,PC0020,R0050,SE134,SW2030)。

1.3主要儀器 One-Touch型動物血糖儀(美國強(qiáng)生公司);HEMIX-180型全自動生化分析儀(日本Sysmex公司);5810型高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司);MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司);HI 1220型烤片機(jī)、RM 2264型石蠟切片機(jī)、EMUC7型超薄切片機(jī)(德國Leica公司);JEM-1400型透射電子顯微鏡(TEM,日本電子株式會社);Powerpac U型垂直電泳系統(tǒng)、Trans-blot型蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司);Chemi Scope 6100型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)取10只大鼠作為正常組,剩余的45只大鼠參照祁珊珊等[9]報(bào)道方法,采用一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg)的方法復(fù)制糖尿病腎病大鼠模型。分別于注射STZ后24 h和72 h取尾靜脈血檢測空腹血糖(FPG),2次檢測均FPG≥16.7 mmol/L則判定糖尿病模型制備成功,8周后檢測FPG≥16.7 mmol/L且24 h尿微量白蛋白(24hU-mAlb)≥30 mg/L即可判定糖尿病腎病模型制備成功[10]。成模42只,分別剔除24h U-mAlb水平最高和最低各1只大鼠,將剩余的40只糖尿病腎病大鼠隨機(jī)分為模型組、金雀異黃酮組、鴉膽子苦醇組、金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組各10只。參考文獻(xiàn)[11-12]給藥劑量,金雀異黃酮組給予金雀異黃酮30mg/kg灌胃,鴉膽子苦醇組給予鴉膽子苦醇2 mg/kg灌胃,金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組給予金雀異黃酮30 mg/kg+鴉膽子苦醇2 mg/kg灌胃,正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃,均1次/d,連續(xù)灌胃6周。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平 末次灌胃24 h后,由尾靜脈采血并通過動物血糖儀檢測FPG水平。采用40 mg/kg戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠,腹主動脈采血,室溫靜置30min后1 500 r/min(r=10 cm)離心5 min取血清,然后按照試劑盒操作說明,采用肌氨酸氧化酶法檢測SCr水平、脲酶法檢測BUN水平。末次灌胃完成后,收集各組大鼠24 h尿液,按照試劑盒操作說明,采用免疫比濁法檢測24hU-mAlb水平。

1.5.2腎臟指數(shù) 末次灌胃24 h后,稱量各組大鼠體重后,摘取雙側(cè)腎組織,生理鹽水沖洗并用濾紙拭干后稱重,計(jì)算腎臟指數(shù)。腎臟指數(shù)=(雙側(cè)腎重/體重)×100%。

1.5.3腎組織病理形態(tài) 取部分左側(cè)腎組織,于10%中性福爾馬林溶液中固定72 h,經(jīng)脫水、石蠟包埋、4 μm切片、展片、55 ℃烤片、脫蠟水化等處理后,分別按照試劑盒操作說明行HE染色、PAS染色和Masson染色,通過光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理形態(tài)。

1.5.4腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 取部分左側(cè)腎組織,修飾成1 mm×1 mm×1 mm小塊后,加入4%戊二醛溶液4 ℃固定2 h、2%鋨酸4 ℃固定2 h,梯度丙酮脫水處理后Epon812包埋樹脂進(jìn)行包埋,60 nm厚度切片,進(jìn)行醋酸鈾和檸檬酸鉛電子雙染色,然后通過透射電子顯微鏡觀察腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5.5腎組織中T-SOD、CAT活性和MDA含量取部分右側(cè)腎組織,冰上剪碎后加入9倍量4 ℃生理鹽水,冰上研磨勻漿,3 500 r/min(r=10 cm)離心5 min取上清液,然后按照試劑盒操作說明,采用分光光度法檢測T-SOD、CAT活性和MDA含量。

1.5.6腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-8含量 取1.5.5制備的腎組織勻漿上清液,采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-8含量。

1.5.7腎組織中Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1、總NF-κB、胞核NF-κB蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測:取100 mg右側(cè)腎組織,加入1 mL RIPA裂解液后冰上研磨勻漿,冰上靜置30 min后,4 ℃下3 500 r/min(r=10 cm)離心5 min取上清液,4 ℃下12 000 r/min(r=10 cm)離心30 min取沉淀,即為總蛋白;按照胞核蛋白提取試劑盒操作說明制備胞核蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白含量測定,配平后以30 μg/孔上樣,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉溶液封閉PVDF膜2 h,一抗稀釋液Nrf2(1∶1 000)、p-Nrf2(1∶800)、HO-1(1∶1 000)、NQO1(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)、H3(1∶2 000)4 ℃避光孵育12 h,洗膜后二抗稀釋液IgG(1∶3 000)室溫孵育1.5 h,洗膜后ECL顯色,通過Image J圖像分析軟件檢測各蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平比較 模型組大鼠FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平均明顯高于正常組(P均<0.05)。鴉膽子苦醇組大鼠FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平均明顯高于模型組(P均<0.05),金雀異黃酮組和金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組大鼠FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平均明顯低于模型組(P均<0.05),但金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組大鼠FPG、SCr、BUN及24hU-mAlb水平均明顯高于金雀異黃酮組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和糖尿病腎病各組大鼠FPG、SCr、BUN、24hU-mAlb水平比較

2.2各組大鼠腎臟指數(shù)比較 正常組和模型組大鼠的腎臟指數(shù)分別為(0.54±0.08)%、(1.17±0.15)%,模型組明顯高于正常組(P<0.05)。金雀異黃酮組、鴉膽子苦醇組、金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組大鼠的腎臟指數(shù)分別為(0.78±0.10)%、(1.36±0.17)%、(0.94±0.13)%,鴉膽子苦醇組明顯高于模型組(P<0.05),金雀異黃酮組和金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組均明顯低于模型組(P均<0.05),但金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組明顯高于金雀異黃酮組(P<0.05)。

2.3各組大鼠腎組織病理形態(tài)比較 正常組大鼠腎小球、腎小管、腎間質(zhì)形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞分布均勻。模型組大鼠腎組織HE染色見腎小球肥大,基質(zhì)增生,系膜擴(kuò)張,炎性浸潤,細(xì)胞固縮;PAS染色見腎組織出現(xiàn)糖原沉積、腎小球硬化;Masson染色見腎小球、腎小管、腎間質(zhì)有大量膠原沉積。與模型組比較,金雀異黃酮組大鼠腎組織病變明顯減輕,鴉膽子苦醇組腎組織病變明顯加重。與金雀異黃酮組比較,金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組腎組織病變明顯加重。見圖1。

圖1 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織病理形態(tài)(×400)

2.4各組大鼠腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較 正常組大鼠腎細(xì)胞超微形態(tài)、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)等均未見異常;模型組大鼠腎小球細(xì)胞可見足突腫脹或消失,基底膜彌漫性增厚,線粒體嵴斷裂或消失;與模型組比較,金雀異黃酮組腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變明顯減輕,鴉膽子苦醇組腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變明顯加重;與金雀異黃酮組比較,金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變明顯加重。見圖2。

圖2 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(TEM,×7 000)

2.5各組大鼠腎組織中T-SOD、CAT活性和MDA含量比較 與正常組比較,模型組大鼠腎組織中T-SOD、CAT活性均明顯降低(P均<0.05),MDA含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,鴉膽子苦醇組 T-SOD活性明顯降低(P<0.05),MDA含量明顯升高(P<0.05);金雀異黃酮組T-SOD、CAT活性均明顯升高(P均<0.05),MDA含量明顯降低(P<0.05)。與金雀異黃酮組比較,金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組T-SOD、CAT活性均明顯降低(P均<0.05),MDA含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織中T-SOD、CAT活性和MDA含量比較

2.6各組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-8含量比較 模型組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-8含量均明顯高于正常組(P均<0.05)。鴉膽子苦醇組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-8含量均明顯高于模型組(P均<0.05),金雀異黃酮組和金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-8含量均明顯低于模型組(P均<0.05),但金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-8含量均明顯高于金雀異黃酮組(P均<0.05)。見表3。

表3 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-8含量比較

2.7各組大鼠腎組織中Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1、總NF-κB、胞核NF-κB蛋白表達(dá)情況比較與正常組比較,模型組大鼠腎組織中p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達(dá)量及p-Nrf2/Nrf2比值均明顯降低(P均<0.05),胞核NF-κB蛋白相對表達(dá)量及胞核NF-κB/總NF-κB比值均明顯升高(P均<0.05)。與模型組比較,鴉膽子苦醇組大鼠腎組織中p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達(dá)量及p-Nrf2/Nrf2比值均明顯降低(P均<0.05),胞核NF-κB蛋白相對表達(dá)量及胞核NF-κB/總NF-κB比值均明顯升高(P均<0.05);金雀異黃酮組大鼠腎組織中p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達(dá)量及p-Nrf2/Nrf2比值均明顯升高(P均<0.05),胞核NF-κB蛋白相對表達(dá)量及胞核NF-κB/總NF-κB比值均明顯降低(P均<0.05)。與金雀異黃酮組比較,金雀異黃酮+鴉膽子苦醇組大鼠腎組織中 p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達(dá)量及p-Nrf2/Nrf2比值均明顯降低(P均<0.05),胞核NF-κB蛋白相對表達(dá)量及胞核NF-κB/總NF-κB比值均明顯升高(P均<0.05)。見圖3及表4。

圖3 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織中Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1、總NF-κB、胞核NF-κB蛋白表達(dá)情況

表4 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織中各蛋白相對表達(dá)量及p-Nrf2/Nrf2、胞核NF-κB/總NF-κB比值比較

3 討 論

糖尿病腎病主要表現(xiàn)為白蛋白尿及腎小球?yàn)V過率持續(xù)低下,治療以降糖調(diào)脂、控制血壓、改善腎功能等為主,但仍不能有效阻斷糖尿病腎病進(jìn)行性加重以及發(fā)展為終末期腎病的結(jié)局。中醫(yī)根據(jù)糖尿病腎病的癥狀將其歸于“消渴”“尿濁”“水腫”“溺毒”等范疇,認(rèn)為氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)、水濕濁毒阻滯為該病的主要病機(jī)。近年來,中藥及中藥提取物防治糖尿病腎病成為醫(yī)藥研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用一次性腹腔注射STZ的方法復(fù)制糖尿病腎病模型,觀察了金雀異黃酮對腎損傷的影響。結(jié)果顯示糖尿病腎病大鼠腎功能明顯降低,病理觀察顯示腎小球肥大、基質(zhì)增生、系膜擴(kuò)張、炎性浸潤、糖原沉積、腎小球硬化、膠原沉積,腎小球細(xì)胞可見足突腫脹或消失、基底膜彌漫性增厚、線粒體嵴斷裂或消失,與江波等[13]報(bào)道一致,但尹江寧等[14]研究結(jié)果顯示糖尿病腎病大鼠呈現(xiàn)腎小球萎縮,這可能與造模方法不同及糖尿病腎病嚴(yán)重程度不同有關(guān)。金雀異黃酮組大鼠腎功能明顯改善,腎組織病理性改變和腎小球細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變明顯減輕,說明金雀異黃酮能夠減輕糖尿病腎病大鼠腎損傷,保護(hù)腎功能。

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是糖尿病腎病發(fā)生進(jìn)展的重要因素?；钚匝醮?ROS)是引發(fā)氧化應(yīng)激損傷的物質(zhì)基礎(chǔ),而長期高血糖可刺激細(xì)胞線粒體大量產(chǎn)生ROS,抗氧化酶T-SOD、CAT被過度消耗,破壞體內(nèi)ROS動態(tài)平衡,不能及時清除的ROS將攻擊破壞生物膜脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)和DNA、結(jié)構(gòu)蛋白等大分子,并生成有害分子MDA,導(dǎo)致細(xì)胞損傷及組織病變[15-16]。并且長期高血糖將導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,白細(xì)胞在受損處聚集并大量釋放促炎因子,其中TNF-α可促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤,IL-1β和IL-8可促進(jìn)白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等聚集并釋放炎癥因子,從而進(jìn)一步加重炎癥損傷[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,金雀異黃酮組大鼠腎組織中T-SOD、CAT活性明顯高于模型組,MDA、TNF-α、IL-1β、IL-8含量明顯低于模型組,提示金雀異黃酮能夠通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)減輕糖尿病腎病大鼠腎損傷。

Nrf2是一種核轉(zhuǎn)錄因子,其結(jié)構(gòu)中含有6個高度保守的環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白同源結(jié)構(gòu)域(Neh),其中Neh2為Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap-1)結(jié)合位點(diǎn),生理狀態(tài)下以無活性“Nrf2/Keap-1”結(jié)合態(tài)形式存在于細(xì)胞質(zhì)[18]。ROS可刺激Nrf2磷酸化,促使“Nrf2/Keap-1”解離,p-Nrf2核轉(zhuǎn)位后可與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,誘導(dǎo)T-SOD、CAT等抗氧化酶轉(zhuǎn)錄表達(dá),提高機(jī)體抗氧化能力。HO-1和NQO1為Nrf2下游靶蛋白。HO-1為血紅素降解限速酶,能夠阻止血紅素參與氧化應(yīng)激反應(yīng),并且血紅素降解產(chǎn)物CO、膽綠素等均為內(nèi)源性抗氧化劑[19]。NQO1是一種具有抗氧化能力的黃素蛋白酶,可催化醌類及其衍生物還原降解,從而阻止其產(chǎn)生ROS參與氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]。NF-κB是定位于細(xì)胞質(zhì)的一種核轉(zhuǎn)錄因子,核轉(zhuǎn)位后可誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-8等多種炎癥因子轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而加重炎癥反應(yīng)[21],而HO-1具有抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位的作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn),金雀異黃酮組大鼠腎組織中p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達(dá)量及p-Nrf2/Nrf2比值明顯高于模型組,胞核NF-κB蛋白相對表達(dá)量及胞核NF-κB/總NF-κB比值明顯低于模型組;鴉膽子苦醇組大鼠各檢測指標(biāo)變化趨勢與模型組相同且更加嚴(yán)重,鴉膽子苦醇可明顯逆轉(zhuǎn)金雀異黃酮對糖尿病腎病大鼠上述指標(biāo)的調(diào)控作用。證實(shí)金雀異黃酮抑制糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用可能與促進(jìn)Nrf2/HO-1通路活化、抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

綜上所述,金雀異黃酮能夠抑制糖尿病腎病大鼠腎組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),減輕腎組織病變和腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變,其機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2/HO-1通路活化、抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位有關(guān),本研究為金雀異黃酮用于糖尿病腎病的防治提供了一定理論依據(jù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。