謝桂元,劉向國,方 芳,于芳春,吳柏合,趙晶燕,方 遠

(安徽中醫(yī)藥大學,安徽 合肥 230000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病,常被認為由肺衰老加速和炎癥反應引起,目前已成為全球第三大死亡因素。COPD的肺部衰老主要有氧化應激、細胞衰老與炎性衰老、端粒功能障礙和抗衰老分子等參與[1],其中炎性衰老可激活核因子κB (NF-κB)信號通路,引起腫瘤壞死因-α(TNF-α)、白細胞介素- 6(IL-6)等相關炎性因子的表達,促進肺部炎癥和肺部衰老[2]。衰老相關分泌表型(SASP)最早由Coppé等[3]提出,可分泌一系列炎性細胞因子(TNF-α、IL-6等)、生長因子、蛋白酶等,可刺激炎性反應的發(fā)生,促使衰老。p53蛋白是衰老常見指標,其不僅可以通過下調TNF-α對機體衰老起調控作用,還可以通過抑制炎癥反應延緩COPD的發(fā)展進程。沉默信息調節(jié)因子相關酶1(SIRT-1) 是一種組蛋白去乙?；?可以反向調控NF-κB信號通路炎性反應的發(fā)生,再由NF-κB信號通路調控p53蛋白,其也可直接作用于p53蛋白,減少DNA損傷,抑制細胞衰老和炎癥反應,延緩SASP進程,從而調控COPD肺部衰老的發(fā)生發(fā)展進程[4-5]。六味補氣方是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院治療COPD的經驗方,本課題組前期研究證實該方可通過調節(jié)干擾素-γ(IFN-γ)、TLR4等增強免疫功能,減輕炎癥反應,延緩COPD的發(fā)展進程[6-7]。但六味補氣方對于 COPD肺部衰老和SASP的影響機制研究尚不明確,故本研究基于SIRT-1/NF-кB/p53信號通路探討了六味補氣方對COPD大鼠肺部SASP的作用。

1 實驗材料和方法

1.1實驗動物 SPF級大鼠60只,體重190～210 g,購自濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司,生產許可證號:SCXK(魯)20190003。所有大鼠飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學新安醫(yī)學重點實驗室動物室,室溫19～24 ℃,濕度48%～62%。本實驗已通過安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審核(動物倫理編號:AHUCM-rats-2021069)。

1.2藥物 六味補氣方組方:炙黃芪15 g、生曬參10 g、玉竹10 g、益智仁6 g、陳皮6 g、肉桂3 g(藥材購自安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房),將上述藥物加入300 mL水浸泡50 min,武火沸騰換文火煎藥40 min,生曬參單獨煎。將藥湯倒至燒杯,置于水浴鍋中加溫濃縮,配置六味補氣方低、中、高劑量濃度分別為0.27 g/kg、0.52 g/kg、1.05 g/kg,相當于臨床等效量的3.1,6.2,12.4倍;桂龍咳喘寧片(桂龍藥業(yè)安徽有限公司,國藥準字Z20053135,規(guī)格:0.3 g/片)。

1.3主要試劑及儀器 脂多糖(LPS ,Solarbio生物科技公司, L8880);紅塔山香煙(焦油含量13 mg, 煙堿含量1.1 mg),滁州煙卷廠。IL-6 ELISA檢測試劑盒(武漢基因美科技有限公司,JYM0646Ra);TNF-α ELISA檢測試劑盒(武漢基因美科技有限公司,JYM0635Ra);NF-κB抗體(abcam,GR3422076-1);抗兔兩步法檢測試劑盒(ebiogo,11162110);SIRT-1(Bioworld,AAD33161);p53(bsm-33058M,AH06013022);山羊抗小鼠抗體(Zsbio,140193);山羊抗兔抗體(Zsbio,202700514); ECL超敏發(fā)光試劑盒(Thermo,VC298015)。自制煙熏箱(1 m3),動物肺功能檢測儀(北京貝蘭博公司,Ani Rws 2005),石蠟切片機(上海徠卡有限公司,RM2016),生物組織石蠟包埋機(湖北亞光,YB-7LF),光學顯微鏡(Nikon EcliPse CI),PAP Pen免疫組化筆(ebiogo,B007),自動曝光儀(上海培清科技有限公司,JS-1070P)。

1.4實驗方法 將大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、桂龍咳喘寧組和六味補氣低、中、高劑量組,每組10只。正常組無特殊處理,其余各組大鼠采用香煙煙霧聯(lián)合氣管滴注LPS的方法[7-8]進行COPD造模:于實驗第1天和第14天采用3%巴比妥麻醉大鼠后,切開頸部暴露氣管,從氣管注入LPS 200 μL(1 mL/1 mg);非LPS滴注日,將大鼠放入自制煙熏箱中,18支香煙混合60 g鋸齒末點燃,每日煙熏2次,每次25 min,共造模6周。根據大鼠的生理學特性、肺功能和肺組織病理變化判定造模是否成功。于造模第7周第1天開始,六味補氣低、中、高劑量組分別灌胃0.27 g/kg、0.52 g/kg、1.05 g/kg的六味補氣方混懸液,桂龍咳喘寧組灌胃0.8 mg/kg的桂龍咳喘寧片混懸液,正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水,均每日2次,連續(xù)6周。

1.5檢測指標及方法

1.5.1大鼠一般情況 每日記錄各組大鼠的一般情況與呼吸系統(tǒng)情況。

1.5.2肺功能 灌胃結束后第2天,采用3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠,手術暴露氣管并進行插管,連接肺功能檢測儀器進行檢測,記錄呼氣峰流速(PEF)、第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)及FEV0.3與用力肺活量(FVC)比值(FEV0.3/FVC)。

1.5.3肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量 待大鼠肺功能測定完畢后,暴露頸部氣管,插入灌胃針并扎緊,注入生理鹽水來回抽吸5次后獲得肺泡灌洗液,將其注入試管中,3 000 r/min離心5 min,取上清液于EP管中-80 ℃保存,采用ELISA法測定TNF-α、IL-6含量。

1.5.4肺組織病理學形態(tài) 打開大鼠胸腔,取出肺組織,用4%多聚甲醛溶液進行固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,連續(xù)5 μm厚切片, HE染色,光鏡觀察肺組織病理學形態(tài)并攝片。

1.5.5肺組織中NF-κB表達情況 采用免疫組化SP法檢測:將組織學切片依次經過脫蠟水化、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、封閉、加入1∶2 000的兔抗NF-кB抗體、加入1∶2 000的兔抗二抗NF-κB抗體、DAB顯色、蘇木精復染、封片,光鏡觀察并攝片。細胞內出現(xiàn)棕黃色顆粒為NF-κB陽性表達。

1.5.6肺組織中SIRT-1和p53蛋白表達情況采用Western blot 法檢測:將肺組織置于液氮中速凍,肺組織樣本裂解后離心取上清液,進行電泳、轉膜、封閉。分別加入1∶1 000的兔抗SIRT-1抗體、1∶1 000的鼠抗p53抗體和1∶2 000的鼠抗GAPDH抗體,孵育過夜洗膜后,加入1∶20 000 HPR標記的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗,室溫孵育1.2 h,洗去二抗,使用ECL試劑盒檢測蛋白表達情況,采用Image J分析膠狀條帶,計算蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1各組大鼠一般情況 正常組大鼠精神狀態(tài)良好,進食正常,反應靈敏,二便正常,體重正常增加,呼吸均勻無喘息、咳嗽等問題;模型組大鼠精神萎靡,食欲不振,體型瘦小,反應遲鈍,呼吸困難伴有喘息甚至有張口呼吸,口鼻有分泌物,煙熏過程中會有出汗表現(xiàn),部分有脫毛;與模型組比較,各藥物組大鼠精神、食欲、體型、呼吸情況等均有不同程度改善,其中六味補氣高劑量組改善效果與桂龍咳喘寧組相似。

2.2各組大鼠肺功能比較 模型組大鼠PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC均明顯低于正常組(P均<0.05);各藥物組大鼠PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC均明顯高于模型組(P均<0.05),六味補氣各組PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC均明顯低于桂龍咳喘寧組(P均<0.05),其中六味補氣高劑量組各指標與桂龍咳喘寧組差距最小。見表1。

表1 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺功能指標比較

2.3各組大鼠肺組織病理學形態(tài) 正常組大鼠肺內細支氣管黏膜存在皺襞且完整,管壁內上皮排列正常,腺體結構完整;肺泡大小正常,肺泡間隔完整。模型組大鼠細支氣管黏膜結構不完整,管壁結構發(fā)生破壞且管腔變窄,管壁內纖毛排列不規(guī)整,存在倒伏,腺體增生肥大;肺泡壁變薄塌陷,肺泡腔發(fā)生融合,肺泡腔和肺間質內發(fā)生炎性浸潤。與模型組比較,各藥物組大鼠細支氣管結構壁和黏膜相對完整,肺泡塌陷和肺泡腔融合有所改善,肺泡腔和肺間質炎性浸潤減少,其中以六味補氣高劑量組改善更為明顯。見圖1。

圖1 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺組織病理學形態(tài)(HE染色,×200)

2.4各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量比較 模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量均明顯高于正常組(P均<0.05);各藥物組大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量均明顯低于模型組(P均<0.05),且六味補氣各組IL-6和TNF-α含量均明顯低于桂龍咳喘寧組(P均<0.05),其中六味補氣高劑量組IL-6和TNF-α含量均明顯低于六味補氣低、中劑量組(P均<0.05)。見表2。

表2 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α含量比較

2.5各組大鼠肺組織NF-κB蛋白陽性表達情況正常組大鼠肺組織中無NF-κB蛋白表達;模型組大鼠肺組織中NF-κB蛋白呈強陽性表達;各藥物組大鼠肺組織中NF-κB蛋白陽性表達較模型組少,其中六味補氣低、中劑量組及桂龍咳喘寧組呈中度表達,六味補氣高劑量組呈低度表達。見圖2。2.6各組大鼠肺組織SIRT-1和p53蛋白表達情況比較 與正常組比較,模型組大鼠肺組織中SIRT-1蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05),p53蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,各藥物組大鼠肺組織中SIRT-1蛋白相對表達量均不同程度升高(P均<0.05),p53蛋白相對表達量均不同程度降低(P均<0.05)。與桂龍咳喘寧組比較,六味補氣低、中劑量組大鼠肺組織中SIRT-1蛋白相對表達量和六味補氣中、高劑量組大鼠肺組織中p53蛋白相對表達量更低(P均<0.05),六味補氣高劑量組大鼠肺組織中SIRT-1蛋白相對表達量和六味補氣低劑量組大鼠肺組織中p53蛋白相對表達量更高(P均<0.05)。見圖3。

圖2 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺組織中NF-κB蛋白陽性表達情況(免疫組化SP染色,×200)

圖3 正常組和慢性阻塞性肺疾病各組大鼠肺組織中SIRT-1和p53蛋白表達情況

3 討 論

肺部衰老與COPD的發(fā)展關系密切[9-10]。

COPD被認為是一種“加速衰老”的表型,但同時衰老也可能導致COPD的發(fā)生發(fā)展[11]。COPD可表現(xiàn)為慢性非特異性炎癥,衰老是引起COPD肺部炎癥的關鍵因素。COPD發(fā)生過程中,氧化應激反應可引起DNA的損傷,導致出現(xiàn)衰老相關表型特征,表現(xiàn)為NF-κB信號通路的激活,并出現(xiàn)SASP,其中包括IL-6、IL-8、TNF-α等促炎細胞因子,TNF-α增加可激活NF-κB信號通路上的IκBα對IL-6進行上調,NF-κB信號通路的激活又可以正向反饋對TNF-α進行上調[12],且可調控p53蛋白,引起細胞損傷和衰老。Kim等[13]研究表明,NF-κB信號通路可以調節(jié)以TNF-α為主的SASP的分泌,進而延緩老年COPD患者的衰微。Adnot等[14]研究發(fā)現(xiàn),來源于肺的SASP可將衰老過程傳播給附近的肺組織和細胞,引起持續(xù)性的炎性反應,使COPD癥狀持續(xù)存在。

SIRT-1是一種核蛋白,與人體衰老密切相關,通過參與去乙酰化組蛋白、轉錄因子和其他蛋白修飾參與氧化應激反應、炎性反應和細胞凋亡抵抗的調節(jié),這些反應與COPD 的發(fā)展密切相關。在吸煙患者肺部上皮細胞發(fā)現(xiàn)SIRT-1的表達量下降[15-16],吸煙使肺泡巨噬細胞和支氣管上皮細胞中SIRT-1的表達減少,SIRT-1活性降低,通過SIRT-1去乙?；倪^程NF-κB p50的活性升高,NF-κB被激活,炎性因子IL-6、TNF-α水平升高[17]。研究發(fā)現(xiàn)在細胞衰老過程中,SIRT-1被敲除會加快SASP的進程,SASP進程加快會讓IL-6、TNF-α水平升高[18]。劉珊等[19]研究證明白藜蘆醇通過SIRT-1/NF-κB信號通路抑制SASP進程,延緩衰老。p53是一種腫瘤抑制因子,具有許多不同的翻譯后修飾包括乙?；⒘姿峄?其中乙?；稍鰪妏53穩(wěn)定性,在細胞衰老和凋亡方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)SIRT-1可通過對p53去乙酰化抑制細胞衰老和凋亡,也可直接降低p53表達,促進米色脂肪合成而抑制衰老[20]。SIRT-1/NF-κB/p53信號通路一方面由SIRT-1參與抑制NF-κB p50去乙酰化的過程, NF-κB信號通路被抑制,下調p53蛋白,NF-κB信號通路上的亞基IκBα被抑制,下調 IL-6、TNF-α等炎性因子,另一方面SIRT-1直接去乙酰化p53蛋白,使p53蛋白下調,抑制衰老,減慢SASP進程,降低炎癥反應而延緩衰老。

中醫(yī)認為COPD發(fā)生的根本是肺脾腎氣虛交雜,臨床上通常通過補宗氣、調脾腎來改善COPD的炎癥反應和衰老影響[21]。六味補氣方可益氣固表、補脾益肺固腎。方中生曬參含人參多糖、人參皂苷,能調節(jié)機體免疫功能,降低IL-1、IL-6、IL-8水平,具有明顯抗炎作用[22];黃芪中黃芪多糖可以通過調節(jié)NF-κB信號通路減輕炎癥反應,還可以通過Akt等靶點的作用發(fā)揮抗衰老作用[23];肉桂可改善衰老小鼠腸道微生物菌群,具有抗衰老作用[24];益智仁能通過提高抗氧化酶活力和抗氧化基因表達水平,延緩衰老[25]。

本實驗結果顯示,COPD模型大鼠FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF均下降,肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量升高,肺組織中SIRT-1蛋白表達減少,NF-κB和p53蛋白表達增加;用六味補氣方干預后,大鼠肺功能有一定改善,肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量降低,SIRT-1蛋白表達增加,NF-κB和p53蛋白表達被抑制。因此推測六味補氣方通過對SIRT-1/NF-κB/p53信號通路的調控,抑制COPD模型大鼠肺部SASP的表達,從而減輕炎癥性衰老,延緩COPD發(fā)展。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。