楊 薇,平高華,姚吉太,張 崢,宋美卿,高 峰

(山西省中醫(yī)藥研究院,山西 太原 030012)

腹膜纖維化為細胞外基質(zhì)過度聚集于腹膜形成的疾病,是由生長因子、多種細胞因子相互作用導致的,與長期腹膜透析密切相關,可使腹膜增厚,影響透析效果[1-2],但目前對于腹膜纖維化尚無確切治療措施。水蛭為活血化瘀常用藥物,具有通經(jīng)活絡、祛瘀消癥的作用,纖維化發(fā)病初期,凝血酶可刺激腎小管上皮細胞分泌單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1),采用水蛭素干預,可通過下調(diào)腎間質(zhì)MCP-1、ICAM-1表達和抑制p38蛋白磷酸化,改善大鼠腎功能,延緩腎間質(zhì)纖維化進展[3-4],但其對腹膜纖維化是否有影響尚不明確。李林煜等[5]研究報道,腹膜纖維化大鼠腹膜組織中糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、β連環(huán)蛋白(β-catenin)表達明顯升高,藥物干預可通過下調(diào)GSK-3β、β-catenin表達而減輕腹膜增厚,抑制膠原纖維增加?；诖?本研究探討了水蛭素對腹膜纖維化大鼠的干預效果及對GSK-3β/β-catenin信號通路的影響,以明確水蛭素干預腹膜纖維化的價值及可能作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1動物 SPF級SD大鼠60只,6～8周齡,體重(218.0±16.3)g,購自深圳市益諾思生物醫(yī)藥安全評價研究院有限公司,動物許可證號:SYXK(粵)2021-0271。飼養(yǎng)條件:室溫(23.0±2.1)℃,相對濕度(55.02±5.33)%,每日光照12 h,自由飲水進食。本次實驗操作嚴格參照動物實驗倫理要求相關規(guī)定進行。

1.2藥物 水蛭素(湖北日升昌新材料科技有限公司,貨號:8001-27-2);氯沙坦鉀(浙江華海藥業(yè)股份有限公司,國藥準字H20143030)。

1.3主要試劑及儀器 晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒(深圳海思安生物技術有限公司),GSK-3β、β-catenin抗體(武漢益普生物科技有限公司,貨號分別為FN-ER0060和CSB-E11307m)。

1.4實驗方法 隨機取10只大鼠作為正常組,其余50只大鼠參照孟立鋒等[6]方法建立腹膜纖維化模型:腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠后,切開腹腔,分離其左腎并切除上下極,1周后采用同樣方式切除大鼠右腎;實驗第3周,在大鼠腹腔內(nèi)注射4.25%含糖腹膜透析液100 mL/(kg·d),1次/d,連續(xù)注射4周,并分別于實驗第8,10,12,22,24,26天給予含脂多糖0.6 mg/kg的4.25%含糖腹膜透析液100 mL/(kg·d)腹腔注射,建立腹膜纖維化模型。將40只建模成功大鼠隨機分為模型組、水蛭素低劑量組、水蛭素高劑量組、氯沙坦鉀組各10只,水蛭素低劑量組給予40 mg/kg水蛭素灌胃,水蛭素高劑量組給予80 mg/kg水蛭素灌胃,氯沙坦鉀組給予25 mg/kg氯沙坦鉀灌胃,正常組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃,均1次/d,連續(xù)灌胃4周。

1.5觀察指標及方法

1.5.1腹膜功能指標 灌胃結束后,腹腔注射4.25%含糖腹膜透析液100 mL/(kg·d),4 h后麻醉大鼠,打開腹膜,將液體取出,計算超濾量和葡萄糖轉(zhuǎn)運量。超濾量=取出液體量-給予的液體量。葡萄糖轉(zhuǎn)運量=(透析液初始葡萄糖濃度×注入透析液量)(透析末葡萄糖濃度×終末透析液出量)。

1.5.2腹膜厚度及腹膜組織病理形態(tài) 將大鼠斷頸處死,取壁層腹膜,加多聚甲醛固定45 h后進行乙醇脫水處理,石蠟包埋,制作5 μm薄片,脫蠟、脫水后進行HE染色,光學顯微鏡下觀察,并測量6個高倍視野中每個視野3個不同位置的腹膜厚度,取3次測量平均值。

1.5.3血清氧化應激指標水平 取各組大鼠灌胃結束后凍存的血清,解凍后采用ELISA法檢測AGEs、MDA、GSH、T-SOD水平。

1.5.4腹膜組織中GSK-3β、β-catenin mRNA表達情況 取各組大鼠冷凍腹膜組織,放入液氮中研磨,使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用RT-PCR法檢測,反應體系:模板DNA 1 μL、上下游引物0.5 μL、蒸餾水20 μL;反應條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,70 ℃ 34 s,共進行35個循環(huán)。采用2-△△CT法計算出GSK-3β、β-catenin mRNA相對表達量。采用Primer5.0軟件設計引物序列,GSK-3β上游引物序列為5’-TACCCATACGATGTTCCAGAT-3’,下游引物序列為5’-ACCCTGCCCAGGAGTTGCCAC-3’;β-catenin上游引物序列為5’-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3’,下游引物序列為5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCA-3’;內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTCGCT-3’。

1.5.5腹膜組織中GSK-3β、β-catenin蛋白表達情況 采用 Western blot法檢測:取各組大鼠冷凍腹膜組織,冰上溶解,25’min后制作組織勻漿,在組織中加入1 mL裂解液,迅速研磨為勻漿,取1.5 mL配置好裂解液放入離心管離心,采用BCA法進行蛋白變性。上樣,進行電泳(80 V 0.5 h,120 V 1 h)、切膠、轉(zhuǎn)膜(300 mA,2 h)處理,室溫下,在5%脫脂牛奶中封閉1.5 h,并采用一抗室溫孵育1 h,4 ℃過夜;次日取出膜,采用TBST洗3次,每次10 min,加入山羊抗兔二抗室溫孵育1 h,TBST洗滌,顯色液顯色并利用UVP成像儀成像后拍照。以GAPDH為內(nèi)參, 使用Image J軟件定量分析蛋白表達情況。試驗重復進行5次。

2 結 果

2.1各組大鼠超濾量、葡萄糖轉(zhuǎn)運量、腹膜厚度比較 與正常組比較,模型組超濾量明顯降低(P<0.05),葡萄糖轉(zhuǎn)運量、腹膜厚度均明顯升高(P均<0.05);與模型組比較,水蛭素低、高劑量組和氯沙坦鉀組超濾量均明顯升高(P均<0.05),葡萄糖轉(zhuǎn)運量、腹膜厚度均明顯降低(P均<0.05);與水蛭素低劑量組比較,水蛭素高劑量組和氯沙坦鉀組超濾量均更高(P均<0.05),葡萄糖轉(zhuǎn)運量、腹膜厚度均更低(P均<0.05),且水蛭素高劑量組超濾量明顯高于氯沙坦鉀組(P<0.05),葡萄糖轉(zhuǎn)運量、腹膜厚度均明顯低于氯沙坦鉀組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和腹膜纖維化各組大鼠超濾量、葡萄糖轉(zhuǎn)運量、腹膜厚度比較

2.2各組大鼠腹膜組織病理學形態(tài)比較 正常組大鼠腹膜結構正常,細胞為扁平間皮細胞;模型組大鼠細胞出現(xiàn)炎性浸潤,間皮細胞為圓形、柱形,間皮細胞下基質(zhì)增厚;水蛭素低劑量組大鼠腹膜結構與模型組相似;水蛭素高劑量組、氯沙坦鉀組大鼠炎性浸潤減少,間皮細胞排列整齊,細胞轉(zhuǎn)化為扁平形。見圖1。

圖1 正常組和腹膜纖維化各組大鼠腹膜組織HE染色病理形態(tài)(×400)

2.3各組大鼠血清氧化應激指標水平比較 與正常組比較,模型組血清AGEs、MDA水平均明顯升高(P均<0.05),血清GSH、T-SOD水平均明顯降低(P均<0.05);與模型組比較,水蛭素低、高劑量組和氯沙坦鉀組血清AGEs、MDA水平均明顯降低(P均<0.05),血清GSH、T-SOD水平均明顯升高(P均<0.05);與水蛭素低劑量組比較,水蛭素高劑量組和氯沙坦鉀組血清AGEs、MDA水平均更低(P均<0.05),血清GSH、T-SOD水平均更高(P均<0.05),且水蛭素高劑量組血清AGEs、MDA水平均明顯低于氯沙坦鉀組(P<0.05),血清GSH、T-SOD水平均明顯高于氯沙坦鉀組(P均<0.05)。見表2。

表2 正常組和腹膜纖維化各組大鼠血清氧化應激指標水平比較

2.4各組大鼠腹膜組織中GSK-3β、β-catenin mRNA相對表達量比較 模型組GSK-3β、β-catenin mRNA相對表達量均明顯高于正常組(P均<0.05);水蛭素低、高劑量組和氯沙坦鉀組GSK-3β、β-catenin mRNA相對表達量均明顯低于模型組(P<0.05),且水蛭素高劑量組和氯沙坦鉀組GSK-3β、β-catenin mRNA相對表達量均明顯低于水蛭素低劑量組(P均<0.05),水蛭素高劑量組均明顯低于氯沙坦鉀組(P均<0.05)。見表3。

表3 正常組和腹膜纖維化各組大鼠腹膜組織中GSK-3β、β-catenin mRNA相對表達量比較

2.5各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達量比較 模型組GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達量均明顯高于正常組(P均<0.05);水蛭素低、高劑量組和氯沙坦鉀組GSK-3β、β-catenin 蛋白相對表達量均明顯低于模型組(P<0.05),且水蛭素高劑量組和氯沙坦鉀組GSK-3β、β-catenin 蛋白相對表達量均明顯低于水蛭素低劑量組(P均<0.05),水蛭素高劑量組均明顯低于氯沙坦鉀組(P均<0.05)。見圖2及表4。

圖2 正常組和腹膜纖維化各組大鼠腹膜組織中GSK-3β、β-catenin蛋白表達條帶圖

表4 正常組和腹膜纖維化各組大鼠腹膜組織中GSK-3β、β-catenin 蛋白相對表達量比較

3 討 論

腹膜纖維化為腹膜的急性/慢性炎癥和感染、損傷所致,主要與腹膜透析液刺激有關[7-8]。腹膜細胞損傷,出現(xiàn)纖維化樣、腹膜間皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,可對腹膜生理功能造成較大影響,使腹膜超濾功能喪失,故明確腹膜纖維化發(fā)病機制,干擾腹膜纖維化形成過程在腹膜纖維化研究中非常重要[9-11]。

水蛭素為多肽物質(zhì),具有抗炎、抗纖維的作用,其可通過抑制JAK/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)刺激的腎小管上皮細胞異常增殖和纖維化[12]。賀彬等[13]研究報道,水蛭素可以明顯減輕博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化,減輕肺組織炎癥反應,減少細胞外基質(zhì)沉積,機制可能與調(diào)控p38 MAPK/NF-κB信號通路有關。本研究發(fā)現(xiàn),水蛭素低、高劑量組超濾量明顯高于模型組,葡萄糖轉(zhuǎn)運量、腹膜厚度均明顯低于模型組,腹膜纖維化改變明顯減輕,提示水蛭素可抑制腹膜纖維化的發(fā)展。

目前研究顯示,腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展與氧化應激反應密切相關,腹膜細胞暴露于高糖透析溶液中,可使葡萄糖降解產(chǎn)物發(fā)生非酶化學反應,產(chǎn)生AGEs,導致細胞內(nèi)蛋白形態(tài)學改變,并引發(fā)腹膜纖維化[14]。唐閣等[15]實驗研究發(fā)現(xiàn),腹膜組織上AGEs可刺激單核巨噬細胞分泌炎癥因子,使氧化應激反應加重,并促進細胞外基質(zhì)合成,導致腹膜纖維化。本實驗結果顯示,與模型組比較,水蛭素低、高劑量組血清AGEs、MDA水平均明顯降低,血清GSH、T-SOD水平均明顯升高,表明水蛭素可抑制氧化應激反應,從而延緩腹膜纖維化的發(fā)展。

GSK-3β/β-catenin通路異?；罨蓪е缕鞴倮w維化,其中GSK-3β磷酸化可抑制β-catenin泛素化活性,使β-catenin集聚于蛋白內(nèi),并遷移至細胞核[16]。機體長期進行腹膜透析,可改變腹膜形態(tài)、功能,增加腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運,形成腹膜纖維化,激活GSK-3β/β-catenin通路,介導腹膜間皮細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,增加細胞外基質(zhì)沉積,導致腹膜功能退化,且腹膜透析液中GSK-3β和β-catenin水平與腹膜透析患者發(fā)生腹膜纖維化的程度呈正相關[17]。本實驗研究發(fā)現(xiàn),水蛭素低、高劑量組腹膜組織中GSK-3β、β-catenin mRNA及蛋白相對表達量均明顯低于模型組,且水蛭素高劑量組降低更明顯。提示水蛭素可通過調(diào)節(jié)GSK-3β/β-catenin通路發(fā)揮抗腹膜纖維化作用。

綜上所述,水蛭素可減輕腹膜纖維化大鼠病理改變,機制可能與抑制氧化應激和GSK-3β/β-catenin通路激活相關。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。