劉現(xiàn)周,戴 睿,徐 強

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300250;2. 天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 301617)

在人類傷口愈合的過程中,傷口微環(huán)境中的真菌、細菌和病毒在內(nèi)的一系列因素在該過程中起到了非常重要的作用,其中細菌的作用最為突出。金黃色葡萄球菌是醫(yī)院和社區(qū)感染的主要病原菌之一,可以影響血液、皮膚和軟組織以及下呼吸道共生菌[1],在軟組織感染中檢出率極高。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)為多重耐藥菌,近年來研究顯示其已成為院內(nèi)感染致死的首要病原菌[2]。中藥的優(yōu)勢體現(xiàn)于能夠在不使得細菌產(chǎn)生更強的耐藥性的情況下起到對創(chuàng)面的治療作用,避免外用抗生素所致細菌更強耐藥性的惡性循環(huán),為臨床感染性創(chuàng)面體外用抗生素導(dǎo)致高耐藥菌產(chǎn)生的難題提供新的解決思路。 目前有研究表明,如意金黃散具有抑菌、抗炎、止痛等作用,對常見的致病菌如金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌有一定抑制作用,可用于治療體表化膿性感染[3-4]。用時根據(jù)局部陰陽辨證以香油、茶、蔥汁及酒調(diào)敷于患處,可起到箍集圍聚、收束瘡毒的作用,與75%酒精制備成酊劑之后能發(fā)揮其透皮吸收的作用[5]。本實驗探討了如意金黃散對MRSA感染創(chuàng)面愈合情況、炎癥因子Toll樣受體(TLR)-核因子κB(NF-κB)通路相關(guān)受體的影響,以期深入研究外用中成藥復(fù)方抗菌活性的作用機制,為中藥相關(guān)抗耐藥菌的新劑型的研發(fā)提供新的思路。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級6～8周齡SD健康雌性大鼠41只,體重(280±20)g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXIK(京)2019-0010。將大鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所清潔級動物房,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,室溫20～25 ℃,濕度50%～65%,在12 h光照、12 h黑暗的環(huán)境中,自由進食和飲水。所有實驗操作符合科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2藥物 如意金黃散(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠,國藥準(zhǔn)字Z11020906,規(guī)格:12 g/袋),臨用前與75%酒精制成酊劑;莫匹羅星軟膏(澳美制藥,國藥準(zhǔn)字HC20160015);生理鹽水(成都青山利康藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H20044562)。

1.3試劑與儀器 冰乙酸(CH3COOH,天津市江天化工技術(shù)有限公司),MRSA(寧波明周生物,菌種編號:B80950,-80 ℃儲存),異氟烷(型號:R510-22),MRSA 顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉,貨號:MR500),MH瓊脂(杭州微生物,批號:202012090),無菌脫纖維羊血(杭州新銳生物,批號:20210406),MRSA篩選瓊脂基礎(chǔ)(青島日水生物,貨號:10833),大鼠白細胞介素-10(IL-10)、大鼠白細胞介素-6(IL-6)、大鼠核因子-κB p65(NF-κB p65)ELISA試劑盒(中國江萊生物公司,貨號分別為JL20896,JL13427,JL45112),TRIzol(Thermo,貨號:YZ-15596026),氯仿(天津化學(xué)試劑有限公司,貨號:20201003),異丙醇、酒精(天津市富宇精細化工有限公司,貨號分別為20190522,20200627),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo,貨號:K1622),qPCR試劑盒(Takara,貨號:DRR039A);雙人雙面超凈臺(中國蘇州凈化設(shè)備)、加熱磁力攪拌器(德國IKA)、高性能通用臺式離心機(美國THERMO)、超微量分光光度計(中國杭州奧盛儀器NANO300),渦旋振蕩器(德國IKA)、滅菌器(中國上海博訊)、組織研磨機(中國鼎昊源科技)、二氧化碳培養(yǎng)箱(中國香港康力)、ELISA洗板機(Thermo 888)、孵箱(Thermo D401)、手持均質(zhì)儀 (杭州米歐儀器MT-13K-L)、恒溫搖床(蘇州捷美電子有限公司NS-13U)、低溫高速離心機(Eppendorf5415R)、PCR儀(BioradC1000)均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物儀器中心提供。

1.4藥物、培養(yǎng)基及細菌制備方法

1.4.1金黃散酊制備方法 取藥粉,按1∶8的比例溶于75%酒精內(nèi)浸泡48 h,分2次回流提取,每次2～3 h,濾過殘渣收集提取液即成。藥液回收率≥75%,生藥含量約12.5%。

1.4.2LB液體培養(yǎng)基制備方法 稱取胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、培養(yǎng)粉2 g于1 L蒸餾水中,混懸至完全溶解,121 ℃高壓滅菌15 min,放置在4 ℃冰箱中備用。

1.4.3LB固體培養(yǎng)板制備方法 稱取胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂粉2 g于1 L蒸餾水中,混懸至完全溶解,121 ℃高壓滅菌15 min,滅菌結(jié)束后搖勻,以防瓊脂沉積于器皿底部而凝固,放置在50 ℃水浴中,倒平板,晾干后用保鮮膜封口,放置在4 ℃冰箱中備用。

1.4.4MRSA顯色培養(yǎng)平板制備方法 稱取瓶內(nèi)干粉8.25 g于100 mL蒸餾水中,混懸至完全溶解。在微波爐中加熱,煮沸后混合物立即移出微波爐并輕輕攪拌,而后移入微波爐再加熱,直至瓊脂完全溶解(大量氣泡代替泡沫產(chǎn)生,大約需要2 min)。取增補劑溶于1 mL無菌水中,輕輕混勻。將增補劑100 μL加入冷卻至50 ℃的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,輕輕搖勻。倒平板,晾干后用保鮮膜封口,放置在4 ℃冰箱中備用。

1.4.5MH羊血培養(yǎng)平板制備方法 稱取MH培養(yǎng)粉38 g于1 L蒸餾水中,混懸至完全溶解。121 ℃高壓滅菌15 min,滅菌結(jié)束后搖勻,以防瓊脂沉積于器皿底部而凝固。放置在50 ℃水浴中,加入50 mL提前預(yù)熱至37 ℃的無菌脫纖維羊血,混勻。倒平板,晾干后用保鮮膜封口,放置在4 ℃冰箱中備用。

1.4.6細菌制備方法 從-80 ℃冰箱中取出細菌凍存管,用無菌1 μL接種環(huán)取細菌涂在MRSA抗生素篩選培養(yǎng)平板上,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,用無菌1 μL接種環(huán)刮取細菌,溶解于無菌PBS中制備細菌懸液。

1.5實驗方法 采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為4組,采用異氟烷麻醉各組大鼠,在大鼠背部兩側(cè)剃毛,然后應(yīng)用安吉爾剃須刀片刮除待手術(shù)區(qū)域的毛發(fā),常規(guī)消毒,在無菌條件下于大鼠背部用外科方法自腰背部脊柱兩側(cè)制作4個圓形潰瘍創(chuàng)面,標(biāo)記為1,2,3,4號,暴露淺筋膜。然后應(yīng)用微量移液器取25%的冰醋酸50 μL 滴到淺筋膜上,按照潰瘍面面積準(zhǔn)備細菌懸液(細菌濃度1.25×109),造成大鼠MRSA感染創(chuàng)面。各組于造模后次日開始換藥,換藥前碘伏常規(guī)消毒創(chuàng)面,生理鹽水組10只采用生理鹽水換藥,75%酒精組10只采用75%酒精換藥,莫匹羅星組10只采用莫匹羅星換藥,金黃散酊組11只采用金黃散酊換藥,均每日1次,藥量均為0.4 g/cm2。

1.6檢測指標(biāo)及方法

1.6.1創(chuàng)面面積 分別于治療第1天、第3天、第7天、第14天使用Image J軟件測量各組4號創(chuàng)面面積。

1.6.2菌落計數(shù) 分別于治療第1天、第3天、第7天、第14天取各組大鼠1,2,3,4號創(chuàng)面組織,每組取部分肉芽組織,加入1 mL無菌PBS,經(jīng)勻漿、離心、稀釋后,取10 μL菌液分別接種至MH血平板、MRSA顯色平板,37 ℃培養(yǎng)24 h后拍照、計數(shù)。

1.6.3肉芽組織蛋白上清中NF-κB p65、IL-6、IL-10含量 取各組大鼠治療第1天、第3天、第7天、第14天的部分肉芽組織,按照ELISA試劑盒說明操作,經(jīng)加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌顯色、終止后,應(yīng)用酶標(biāo)儀,白孔調(diào)零450 nm波長依序測各孔的OD值。

1.6.4肉芽組織中1-TLR2、1-TLR4 mRNA表達情況 采用RT-PCR法檢測: 取各組大鼠治療第7天冷凍保存的肉芽組織100 mg,根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取肉芽組織總RNA,并檢測總RNA的純度及濃度,以總RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄得到cRNA。采用SYBR Premix Ex TaqTM配制反應(yīng)體系,取1 μL cDNA,加入9 μL反應(yīng)體系中(2 μL SYBR,上、下游引物各1 μL,純水加至10 μL);PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95 ℃ 10 s;PCR擴增:95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,擴增40個循環(huán);溶解曲線分析,監(jiān)控PCR反應(yīng)特異性:95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,95 ℃ 15 s。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。引物序列見表1。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 在實驗第8天,金黃散酊組有1只大鼠死亡;在實驗第14天,生理鹽水組有1只大鼠死亡;其他時間及組別均無大鼠死亡,未發(fā)現(xiàn)其他染情況出現(xiàn)。

2.2各組不同時期MH羊血瓊脂培養(yǎng)平板中菌落計數(shù) 治療第3天,莫匹羅星組菌落計數(shù)明顯低于生理鹽水組和75%酒精組(P均<0.05),金黃散酊組明顯低于生理鹽水組(P<0.05),莫匹羅星組與金黃散酊組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);治療第7天,各組菌落計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);治療第14天,金黃散酊組菌落計數(shù)明顯低于生理鹽水組(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同時間段各組感染創(chuàng)面中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在MH羊血瓊脂培養(yǎng)基中的菌落計數(shù)

2.3各組不同時期MRSA顯色培養(yǎng)基平板中菌落計數(shù) 治療第3天,莫匹羅星組菌落計數(shù)明顯低于其他3組(P均<0.05);治療第7天,莫匹羅星組菌落計數(shù)仍然明顯低于其他3組(P均<0.05),金黃散酊組明顯低于75%酒精組(P<0.05); 治療第14天,莫匹羅星組菌落計數(shù)明顯低于75%酒精組與金黃散酊組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 不同時間段各組感染創(chuàng)面中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在MRSA顯色培養(yǎng)基中的菌落計數(shù)

2.4各組肉芽組織蛋白上清中NF-κB p65、IL-6、IL-10含量 治療第3天:金黃散酊組NF-κB p65含量明顯高于75%酒精組(P<0.05),IL-6含量明顯低于莫匹羅星組(P<0.05),各組間IL-10含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);治療第7天:各組間NF-κB p65、IL-6含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05),金黃散酊組IL-10含量明顯高于生理鹽水組及75%酒精組(P均<0.05),莫匹羅星組IL-10含量明顯高于生理鹽水組(P<0.05);治療第14天,各組間NF-κBp65、IL-6含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05),金黃散酊組和莫匹羅星組IL-10含量均明顯高于生理鹽水組及75%酒精組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 不同時間段各組大鼠感染創(chuàng)面肉芽組織蛋白上清中NF-κB p65、IL-6、IL-10含量

2.5各組肉芽組織中1-TLR2、1-TLR4 mRNA相對表達量 治療第7天,莫匹羅星組和金黃散酊組1-TLR2、1-TLR4 mRNA相對表達量均明顯低于生理鹽水組(P均<0.05),且金黃散酊組1-TLR2、1-TLR4 mRNA相對表達量均明顯低于75%酒精組(P均<0.05)。見表2。

表2 治療第7天各組大鼠肉芽組織中1-TLR2、1-TLR4 mRNA相對表達量比較

3 討 論

細菌感染和耐藥均是群體行為,細菌之間可以通過某些化學(xué)信號分子進行信息的傳遞[6],而中藥對細菌之間信號傳遞作用的影響研究甚少。中藥制劑如意金黃散具有抗菌消炎作用,可促進感染傷口愈合。在劑型方面,傳統(tǒng)賦形劑主要為蜂蜜、醋、蔥汁等,而目前又出現(xiàn)了以如意金黃散為底方的膜劑、乳膏劑、巴布劑等,但在臨床中較為常用的為酊劑。中藥酊劑系指藥材用規(guī)定濃度的乙醇提取或溶解而制成的澄清液體制劑,具有促進透皮吸收的作用[7]。如意金黃散出自明朝陳實功《外科正宗》,具有清熱除濕、散結(jié)化痰、消腫止痛的功效。本方的君藥為大黃、黃柏,利用其苦寒之性清熱解毒;厚樸、天南星、陳皮燥濕化痰行氣,為臣藥;姜黃破血行氣,為佐藥;天花粉、甘草、白芷為使,清熱消腫,調(diào)和諸藥。如意金黃散中的主要藥效成分之一大黃素可以顯著干擾S.aureus胞外脫氧核糖核酸(DNA)的釋放,并抑制生物膜相關(guān)基因cidA、icaA、sarA、dltB和agrA的表達[8]。孫廣等[9]研究了29種中藥提取物對MRSA的抑菌作用,發(fā)現(xiàn)黃柏的抑菌作用最強,其次是甘草、黃芩,且推測對MRSA抑制作用較強的有效成分可能為脂溶性成分,建議在進行有效成分研究中應(yīng)充分考慮提取溶劑的極性。本實驗建立大鼠MASA感染創(chuàng)面,體外抑菌實驗結(jié)果顯示金黃散酊組復(fù)合菌種培養(yǎng)基(羊血瓊脂培養(yǎng)平板)中菌落計數(shù)較其他組明顯降低,而莫匹羅星組MRSA單一菌種培養(yǎng)基(MRSA顯色培養(yǎng)基)中菌落計數(shù)較其他組明顯降低,說明如意金黃散酊劑對MRSA及其他菌種共存的創(chuàng)面抑菌作用較為明顯。本研究結(jié)果與孫廣等[9]研究結(jié)果可相互呼應(yīng)、論證。

影響傷口愈合的因素主要分成兩大類:一類是炎癥期創(chuàng)面免疫細胞的異?；钴S,在炎癥因子的作用下,創(chuàng)面長期處于炎癥狀態(tài)而無法愈合;另一類是因為創(chuàng)面營養(yǎng)狀況較差或蛋白酶的異常激活,導(dǎo)致創(chuàng)面生長因子缺乏、成纖維細胞及表皮細胞擴增受限,最終造成創(chuàng)面不愈合[10]。TLR/NF-κB通路與機體的自身免疫相關(guān),是炎癥反應(yīng)時機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號系統(tǒng)[11]。當(dāng)機體受到嚴重創(chuàng)傷或細菌感染后,會釋放大量的腫瘤壞死因子-α(TNF-α),TNF-α與TLR結(jié)合[12]。TLR激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)[13],TRAF6被激活后可降解NF-κB抑制蛋白(IκB)[14],使NF-κB的靜息狀態(tài)得以解除,NF-κB轉(zhuǎn)入細胞核中誘導(dǎo)特定基因的表達。NF-κB活化后可以增強TNF-α、IL-1等細胞因子的基因轉(zhuǎn)錄,使其產(chǎn)生和釋放增多,其正反饋效應(yīng)使NF-κB 繼續(xù)增多,出現(xiàn)炎癥瀑布樣級聯(lián)反應(yīng),促使IL-6產(chǎn)生和釋放,同時產(chǎn)生的IL-10可抑制NF-κB活化[15-16]。IL-6是一種具有冗余和多效性活性的細胞因子[17],可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、造血、急性期反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[18]。當(dāng)感染或損傷引起組織炎癥發(fā)生時,機體迅速誘導(dǎo)IL-6合成,其通過刺激急性期免疫反應(yīng)和造血有助于宿主防御,當(dāng)組織穩(wěn)態(tài)恢復(fù)時,其產(chǎn)生終止[19]。IL-10由幾乎所有白細胞產(chǎn)生,包括巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)、自然殺傷(NK)細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、B細胞和許多CD4T細胞亞群,釋放抗炎性因子,抑制單核巨嗜細胞釋放炎癥介質(zhì)[20]。本實驗結(jié)果顯示,治療第3天,金黃散酊組NF-κB p65含量明顯高于75%酒精組,IL-6含量明顯低于莫匹羅星組;治療第7天和第14天,金黃散酊組和莫匹羅星組IL-10含量均明顯高于生理鹽水組。提示如意金黃散酊劑具有減輕MRSA感染創(chuàng)面炎癥反應(yīng)作用。

TLRs是天然免疫系統(tǒng)中一個極其重要的家族,在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用,但是對于抗細菌感染中起著核心作用的主要是TLR2和TLR4[21]。研究發(fā)現(xiàn),TLR4是脂多糖(LPS)的主要識別受體,LPS是革蘭陰性細菌外膜的共同成分,具有很強的刺激免疫能力,TLR4將LPS信號通過細胞內(nèi)TRAF、IRAK等下游分子向下傳導(dǎo),最終活化NF-κB和MAPK通路,導(dǎo)致大量前炎癥因子表達;TLR2是革蘭陽性細菌脂蛋白的主要識別受體,TLR2被脂膜酸激活可在人未成熟的樹突狀細胞引起前炎癥細胞因子的分泌[22]。本實驗結(jié)果顯示,金黃散酊組1-TLR2、1-TLR4 mRNA相對表達量均明顯低于生理鹽水組及75%酒精組,提示如意金黃散酊劑可抑制TLR-NF-κB通路的1-TLR2、1-TLR4受體,從而導(dǎo)致前炎癥反應(yīng)。

綜上所述,如意金黃散酊劑可減輕MRSA感染創(chuàng)面炎癥反應(yīng),而在臨床實踐過程中,傷口感染往往是多個菌種共存的狀態(tài),因此對于中藥抗菌制劑而言,不應(yīng)一味地追求中藥針對某單一菌落的抗菌作用,而是在與傷口感染相似的環(huán)境下對復(fù)合菌種的抗感染作用,達到傷口微環(huán)境的平衡,從而促進傷口愈合。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。