張德才

（海西州都蘭縣察蘇鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，青海 都蘭 816199）

隨著抗菌藥物及含有抗菌藥物的添加劑的使用，羊胸膜肺炎放線菌對臨床中常用的抗菌藥物產生嚴重的耐藥性，給羊胸膜肺炎放線菌病治療帶來一定困難，同時還威脅著人們健康。 本試驗從海西州都蘭縣地區(qū)規(guī)?；吧B(yǎng)戶中采集患呼吸道疾病病羊的咽拭子、鼻拭子及死亡羊的肺臟等病料樣品共計198 份中分離得到70 株羊胸膜肺炎放線菌病，對分離的羊胸膜肺炎放線菌病進行耐藥情況監(jiān)測，為指導臨床合理用藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2021～2023 年采集某地區(qū)規(guī)?；吧B(yǎng)戶中采集患呼吸道疾病病羊的咽拭子、鼻拭子及死亡羊的肺臟等病料樣品198 份（見表1）。

表1 樣品采集情況

1.2 主要儀器

THB 平板（含NAD） 、THB 液體培養(yǎng)基（含NAD），購自北京劍橋生物科技有限公司；革蘭氏陰性菌生化鑒定試劑盒、臨床用的8 類抗菌藥物敏紙片， 均購自北京天壇藥物生物技術開發(fā)公司；細菌基因組DNA 試劑盒、2×Taq Master Mix、DL2000 DNA Maker， 均購上海聯邁生物工程有限公司。

1.3 細菌分離與培養(yǎng)

對采集海西州都蘭縣地區(qū)規(guī)?；吧B(yǎng)戶中采集患呼吸道疾病病羊的咽拭子、鼻拭子及死亡羊的肺臟等病料樣品198 份，對采集的病料組織樣品進行編號，在無菌的條件下分別劃線接種于THB 平板（含NAD）37℃培養(yǎng)12～18 小時后，接種于THB 液體培養(yǎng)基（含NAD）進行純化培養(yǎng)，取純化后分離菌株劃線接種于胰蛋白胨血瓊脂平板培養(yǎng)基上再接種金黃色葡萄球菌后，37℃培養(yǎng)12～24 小時后觀察是否有衛(wèi)星現象。

1.4 細菌生化鑒定

參照革蘭氏染色試劑盒說明書， 調整菌液濃度為0.5 個麥氏濁度，對分離的細菌進行生化鑒定試驗鑒定

1.5 細菌PCR 鑒定

根據胸膜肺炎放線菌的基因序列（NR_114419.1）設計通用型APP 檢測引物（5’-TTATCCGAACTTTGGTTTAGCC-3’，5-CATATTTGATAAAACCATCCGTC -3’） 片段大小為418 bp，在生工生物工程(上海)股份有限公司合成通用型APP 檢測引物， 提取臨床分離菌株基因組DNA 為模板，用通用型APP 檢測引物對分離菌株進行PCR 鑒定。

1.6 藥敏試驗

將臨床中分離的豬胸膜肺炎放線菌用K-B藥敏紙片法進行藥敏試驗，每1 種藥物做3 個重復，取其平均值，記錄每一株分離菌株的藥敏試驗結果。 其操作流程及判定結果參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會 （CLSI）2013 年推薦的標準K-B 紙片法。 統(tǒng)計臨床分離羊胸膜肺炎放線菌分離菌株的對臨床中不同藥物的耐藥性。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)

從采集海西州都蘭縣地區(qū)規(guī)?；吧B(yǎng)戶中患呼吸道疾病病羊的咽拭子、鼻拭子及死亡羊的肺臟等病料樣品中分離得到的菌株，通過培養(yǎng)特性鑒定分離菌株在THB 平板（含NAD）長出特征性菌落形態(tài)，胰蛋白胨血瓊脂平板培養(yǎng)基上出現典型的“衛(wèi)星現象”（見圖1）革蘭氏染色可見分離菌株成鏈狀排列或者單個的紅色短桿菌（見圖2）。 與《伯杰細菌鑒定手冊》中報道的羊胸膜肺炎放線菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)學及生化鑒定基本一致， 經過統(tǒng)計70 株分離菌株初步鑒定為羊胸膜肺炎放線菌。

圖1 分離菌株的“衛(wèi)星現象”

圖2 分離菌株革蘭氏染色結果（1000×）

2.2 細菌PCR 鑒定

從采集海西州都蘭縣地區(qū)規(guī)?；吧B(yǎng)戶中患呼吸道疾病病羊的咽拭子、鼻拭子及死亡羊的肺臟等病料樣品中分離的疑似70 株羊胸膜肺炎放線菌分離菌株， 通過PCR 鑒定均擴增出大約為418 bp 目的基因條帶 （部分分離菌株PCR 鑒定結果見圖3），70 株分離菌株從分子生物學水平上鑒定為羊胸膜肺炎放線菌。

圖3 部分分離菌株PCR 鑒定結果

2.3 耐藥性分析

采用K-B 藥敏紙片法檢測70 株羊胸膜肺炎放線菌的耐藥性。 結果由表2 可知，對臨床中分離的70 株羊胸膜肺炎放線菌對磺胺間甲氧嘧啶、 慶大霉素、 新霉素等10 種藥物耐藥率在50.0%～95.7%， 對其他的8 種藥物耐藥率在7.1%～31.4%。

表2 耐藥性檢測結果

3 討論

近年來，在我國內蒙古、新疆、河北、山東、陜西、甘肅及河南等多個地區(qū)養(yǎng)殖場中關于胸膜肺炎放線桿菌引起羊死亡的報道逐漸增多，其死亡率且呈現上升的趨勢，羊胸膜肺炎放線菌病是危害羊養(yǎng)殖中主要的細菌性呼吸道傳染病之一，因此，對規(guī)?；B(yǎng)羊場及散養(yǎng)戶中羊胸膜肺炎放線菌病的防控具有重要的意義。 相關研究表明，胸膜肺炎放線菌具有多種不同血清型，不同血清型的分離菌株具有不同的致病性且缺少交叉免疫反應，目前沒有有效的疫苗進行預防，也是該病在不同養(yǎng)殖場中廣泛流行的重要因素之一。本研究從采集海西州都蘭縣地區(qū)規(guī)模化及散養(yǎng)戶中患呼吸道疾病病羊的咽拭子、 鼻拭子及死亡羊的肺臟等病料樣品198 份分離到70 株羊胸膜肺炎放線菌， 說明羊胸膜肺炎放線菌引起海西州都蘭縣地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶中不同階段羊的呼吸道疾病的主要病原菌之一。因此，規(guī)模化養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶應注意羊胸膜肺炎放線菌病的綜合防控。 臨床防治豬胸膜肺炎放線菌病過程中不合理使用抗菌藥物現象較多，導致耐藥性產生， 的治療帶來一定的困難。 采用K-B 藥敏紙片法檢測70 株羊胸膜肺炎放線菌的耐藥性。 結果顯示，臨床中分離的70 株羊胸膜肺炎放線菌對磺胺間甲氧嘧啶、慶大霉素、新霉素等10 種藥物耐藥率在50.0%～95.7%，對其他的8 種藥物耐藥率在7.1%～31.4%。 表明從該地區(qū)養(yǎng)殖場分離的羊胸膜肺炎放線菌對常用藥物產生不同的耐藥性。 因此，在臨床治療羊胸膜肺炎放線菌病時，應該合理使用抗菌藥物，同時配合環(huán)境消毒，才能提高治療效果。